百香果又称西番莲，有紫果和黄果两大类，主要集中在巴西、秘鲁、智利等地[1]。我国对于百香果的引入已有多年的历史，在国内多个地方都有栽培[2]。目前我国对于百香果的研究主要集中在果肉，而对其果皮的研究比较少[3]。百香果果皮占鲜果重的二分之一，所占比例较大，常造成百香果废弃果皮资源和环境污染等问题[4]。
多酚化合物含有一个或多个羟基基团的苯环结构，是百香果中含量最多的生物活性成分[5]。有研究表明，百香果果皮含有多种酚类、生氰和多糖等活性物质，这些物质与心血管疾病、高血糖和神经性疾病有关[6-8]。百香果具有抗焦虑、抗氧化和降压等作用，但其内在作用机理尚不明确[9-13]。试验采用两项溶剂萃取的方法对干燥的百香果果皮进行提取，并对所制备的样品进行体外抗氧化活性研究，为百香果果皮的综合利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
紫色百香果：产自广西桂林。
1，1-二苯基-2-苦基肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、无水硫酸钠、邻菲罗啉、无水乙醇、硫酸亚铁、Folin酚、没食子酸标准品、乙酸乙酯、无水乙醚、三吡啶基三嗪（tripyridytriazine，TPTZ）、丙酮、氢氧化钠、抗坏血酸、无水碳酸钠、六水三氯化铁、甲醇、结晶乙酸钠、正己烷、冰醋酸、浓盐酸、过氧化氢：广州一马生物有限公司，以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV759紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DHG-9140电热恒温干燥箱：上海市百典仪器厂；JJ500电子天平：天津市顺诺仪器科技有限公司；DZW-8恒温水浴锅：北京众星伟业仪器有限公司；MJ-BL25B2粉碎机：美的集团有限公司；XHRE-52A旋转蒸发仪：郑州豫华仪器制造有限公司；GENEX pH计：上海宝予德科学仪器有限公司；CXJ-IIB离心机：上海安亭科学仪器厂；SHZ-D（III）循环水式真空泵：邢台润联科技开发有限公司
1.3 方法
1.3.1 原料预处理
选择大小均匀、无机械损伤和病虫害的百香果，取百香果果皮于50℃恒温烘箱中干燥36 h，使用粉碎机粉碎后密封于常温（25℃）保存备用。
1.3.2 多酚化合物的提取
1.3.2.1 游离态多酚的提取
参考Krygier等[14]和肖星凝等[15]的方法并稍作修改。取10.0 g百香果果皮粉末用甲醇、丙酮和水提取液（体积比 7∶7∶6）于常温（25℃）暗处反应，重复 5 次，抽滤，然后用旋转蒸发仪45℃浓缩，所得浓缩滤液用6 mol/L HCl调pH值至2，抽滤。所得滤液与正己烷按体积比1∶1混合萃取5次，去掉正己烷相，剩下的水相用乙酸乙酯和无水乙醚按体积比1∶1混合，萃取5次，加入无水硫酸钠，用旋转蒸发仪30℃浓缩干燥，最后加入甲醇定容至25 mL，得到游离态多酚。
1.3.2.2 酯化态多酚的提取
将上述抽滤后的残渣与无水乙醚和乙酸乙酯萃取后的水相混合，加入4 mol/L NaOH避光反应4 h并用6 mol/L HCl调pH值至2，抽滤。所得滤液与正己烷按体积比1∶1混合萃取5次，去掉正己烷相，剩下的水相用乙酸乙酯和无水乙醚按体积比1∶1∶1混合萃取5次，加入无水硫酸钠，用旋转蒸发仪30℃浓缩干燥，最后加入甲醇定容至25 mL，得到酯化态多酚。
1.3.2.3 结合态多酚的提取
将上述抽滤后的滤渣加入50 mL 4mol/L NaOH避光反应4 h,并用6 mol/L HCl调pH值至2，抽滤。所得滤液与正己烷按体积比1∶1混合萃取5次，去掉正己烷相，剩下的水相用乙酸乙酯和无水乙醚按体积比1∶1∶1混合萃取5次，加入无水硫酸钠，用旋转蒸发仪30℃浓缩干燥，最后加入甲醇定容至25 mL，得到结合态多酚。
以上试验均重复3次，将试验得到的3种形式百香果果皮多酚在-20℃密封储存。
1.3.3 多酚化合物含量的测定
参考 Singleton VL[16]、尚红梅等[17]和马士巧等[18]的方法并稍作修改。以没食子酸（gallic acid）为标品制作标准曲线：y=0.008 3x+0.003 2（R2=0.998 9），将标准曲线算出的结果换算为每克样品（干质量）中所含的多酚相当于没食子酸的毫克数，结果表示为mgGAE/gDW。
1.3.4 体外抗氧化活性测定
1.3.4.1 DPPH自由基清除能力测定
参照齐高强等[19]的方法并稍作修改。取0.2 mL百香果果皮提取液，加入4mL 0.1 mmol/L DPPH溶液在常温（25℃）避光反应，从0～1h每隔10min测1次517nm的吸光度A1。以甲醇作为对照，测517nm的吸光度A2。以无水乙醇为空白。DPPH·清除率按如下公式计算。
1.3.4.2 铁离子还原能力测定
参照杨希娟等[20]的方法并稍作修改。取1 mL TPTZ（10 mmol/L）、1 mL FeCl3·6H2O（20 mmol/L）和 10 mL pH3.6醋酸盐缓冲液（0.3 mol/L）充分混匀得到铁离子还原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）溶液，在37℃恒温锅中贮藏备用。取3.6 mL FRAP溶液加入0.36 mL蒸馏水和0.12 mL百香果果皮提取液，充分混合后于37℃水浴锅中避光放置，以蒸馏水代替百香果果皮提取液为空白，从0～1 h每隔10 min测1次593 nm的吸光度。以FeSO4·7H2O为标品制作标准曲线回归方程为y=0.007 2x+0.065 9（R2=0.999 9），根据标准曲线计算硫酸亚铁的浓度（mmol/L）。
1.3.4.3 ·OH清除能力测定
参考周淑仪等[21]的方法。取1 mL邻菲罗啉溶液（1.865 mmol/L）加入1 mL百香果果皮提取液和2 mL pH7.4磷酸盐缓冲液，混合后加入1 mL FeSO4溶液（1.865 mmol/L），再次混合后加入1 mL 0.03%的H2O2，在37℃恒温锅中反应1 h，测536 nm的吸光度A样。用甲醇代替百香果果皮提取液，测536 nm的吸光度A损。以甲醇代替百香果果皮提取液、蒸馏水代替H2O2为空白，测536 nm的吸光度A空。·OH清除率按如下公式计算。
1.4 百香果果皮中多酚化合物组成的检测
采用电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spe-ctrometry，ESI-MS）检测百香果果皮中多酚化合物的组成。
质谱条件：采用ESI源，负离子模式，离子扫描范围：100 m/z～800 m/z；雾化气压力：0.28 MPa；干燥气流速：10.00 L/min；干燥气温度：350℃；最大累计时间：200ms；碰撞诱导解离的MS/MS诱导碰撞能量为1.0 V。
1.5 数据处理
每组数据均平行3次，结果用平均值±标准差表示。采用Excel 2010进行绘图；采用SPSS 19.0中单因素方差分析（one-way ANOVA）和邓肯式多重比较进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 百香果果皮中多酚化合物含量
百香果果皮中3种形态多酚含量见图1。
图1 百香果果皮中3种形态多酚含量
Fig.1 Contents of three polyphenols in passion fruit peel
不同小写字母表示差异极显著（p＜0.01）。
由图1可知，百香果果皮中游离态多酚含量最高，为0.641 3 mg GAE/g DW，占总酚的48.45%；酯化酚含量次之，为0.529 0 mg GAE/g DW，占总酚的39.97%；结合酚含量最少，为0.153 3 mg GAE/g DW，占总酚的11.58%；结果表明百香果果皮中3种不同形式多酚含量差异极显著（p＜0.01）。由此可见，百香果果皮中多酚主要为游离酚和酯化酚。
2.2 百香果果皮中多酚的抗氧化能力分析
2.2.1 DPPH自由基清除能力分析
百香果果皮中3种形态多酚和混合酚清除DPPH·的动力学反应见图2，游离酚、酯化酚、结合酚、混合酚和VC的DPPH·清除能力见图3。
图2 百香果果皮中3种形态多酚和混合酚清除DPPH·的动力学反应
Fig.2 Reaction of dynamics of scavenging DPPH free radicals by free phenol，esterified phenol，bound phenol and mixed phenol in passion fruit peel
图3 百香果果皮中游离酚、酯化酚、结合酚、混合酚和VC的DPPH·清除能力
Fig.3 DPPH free radical scavenging ability of free phenol，esterified phenol，bound phenol，mixed phenol and VCin passion fruit peel
不同小写字母表示差异极显著（p＜0.01）。
混合酚提取液为等浓度等体积的游离酚、酯化酚和结合酚提取液的混合液。试验所用各样品的浓度均为92μg/mL。由图2可知，百香果果皮中游离酚、酯化酚、结合酚和混合酚的吸光度随着反应时间的延长而逐渐减少。样品中的吸光度越小，说明样品中的DPPH自由基清除能力越强。DPPH·清除率随着反应时间的延长而升高，反应时间到50 min基本达到稳态。由图3可知，百香果果皮中游离酚、酯化酚、结合酚和混合酚提取液的DPPH·清除率与VC相比差异极显著（p＜0.01）。相同浓度的5种样液的DPPH·清除率为VC＞游离酚＞酯化酚＞混合酚＞结合酚。结果表明百香果果皮中游离酚和酯化酚的DPPH·清除能力较强。
2.2.2 铁离子还原能力分析
百香果果皮中游离酚、酯化酚、结合酚和混合酚FRAP值的动力学反应见图4，游离酚、结合酚、酯化酚、混合酚和VC的铁离子还原能力见图5。
图4 百香果果皮中游离酚、酯化酚、结合酚和混合酚FRAP值的动力学反应
Fig.4 Reaction of dynamics of FRAF value of free phenol，esterified phenol，bound phenol and mixed phenol in passion fruit peel
图5 百香果果皮中游离酚、结合酚、酯化酚、混合酚和VC的铁离子还原能力
Fig.5 Iron ion reduction ability of free phenol，bound phenol，esterified phenol，mixed phenol and VCin passion fruit peel
不同小写字母表示差异极显著（p＜0.01）。
由图4可知，百香果果皮中游离酚、酯化酚、结合酚和混合酚的吸光度随着反应时间的延长而增加。样品中的吸光度越大，说明样品中的铁离子还原能力越强。FRAP值随着反应时间的延长而逐渐增大，反应时间到50 min基本达到稳态。由图5可知，百香果果皮游离酚、酯化酚、结合酚和混合酚提取液的铁离子还原能力与VC相比差异极显著（p＜0.01）。相同浓度的5种样液的铁离子还原能力为游离酚＞混合酚＞酯化酚＞结合酚＞VC。结果表明百香果果皮多酚中游离酚和酯化酚的铁离子还原能力较强。
2.2.3 羟基自由基清除能力分析
百香果果皮中游离酚、结合酚、酯化酚、混合酚和VC的·OH清除能力见图6。
图6 百香果果皮中游离酚、结合酚、酯化酚、混合酚和VC的·OH清除能力
Fig.6 ·OH scavenging ability of free phenol，bound phenol，esterified phenol，mixed phenol and VCin passion fruit peel
不同小写字母表示差异极显著（p＜0.01）。
由图6可知，百香果果皮酯化酚、结合酚和混合酚提取液的羟基自由基清除能力与VC相比差异极显著（p＜0.01）。相同浓度的5种样液的·OH清除率为VC＞游离酚＞酯化酚＞结合酚＞混合酚。结果表明百香果果皮多酚中游离酚和酯化酚的羟基自由基清除能力较强。
通过查阅资料可知，评定一个样品的抗氧化活性至少需要两种方法进行综合评定[22-23]。本文通过测定百香果果皮提取液的DPPH·清除能力、FRAP值及·OH清除能力3个指标，综合评定百香果果皮的抗氧化性，结果表明百香果果皮中游离酚的3个指标均比酯化酚高，结合酚最低。综上所述，百香果果皮中不同形式多酚的抗氧化能力大小为游离酚＞酯化酚＞结合酚。
2.3 百香果果皮中游离酚、酯化酚和结合酚的组分分析
百香果果皮中3种形态多酚的ESI-MS图谱见图7，3种形态多酚的质谱特征见表1。
图7 百香果果皮游离酚、酯化酚及结合酚的ESI-MS图谱
Fig.7 ESI-MS spectra of passion phenol，esterified phenol and bound phenol
A.游离酚；B.酯化酚；C.结合酚。
表1 百香果果皮游离酚、酯化酚和结合酚的质谱特征
Table 1 Mass spectral characteristics of free phenol，esterified phenol and bound phenol in passion fruit peel
种类 组分 质谱特征（m/z） 响应值/mAu游离酚 1 156.714 30 2 634 887酯化酚2 396.129 93 84 700 312 3 539.187 54 15 679 752 4 658.197 11 6 980 336 5 813.230 67 3 788 533相对分子质量158 398 541 660 815结合酚种类 组分 质谱特征（m/z） 响应值/mAu 相对分子质量1 279.159 85 124 649 960 281 2 463.194 98 33 384 578 465 3 579.293 52 139 802 400 581 1 193.104 49 54 560 644 195 2 301.142 06 342 525 284 303 3 579.296 55 2 216 786 176 581
由图7可知，百香果果皮游离酚种类丰富，酯化酚、结合酚种类较少。由表1可知，百香果果皮中游离酚共检测出5种物质，相对分子质量分别为158、398、541、660、815，酯化酚检测出3种物质，相对分子质量为281、465、581，结合酚检测出3种物质，相对分子质量分别为195、303、581。由此可得出，百香果果皮中酯化酚和结合酚都检测出相对分子质量为581这个物质。综上所述，百香果果皮中3种形式多酚在种类和组分上存在着很大的差异。
3 结论
从百香果果皮中提取游离态、酯化态及结合态3种形态多酚，分别测定多酚含量和体外抗氧化活性，发现百香果果皮中游离酚、酯化酚和结合酚的含量分别为 0.641 3、0.529 0、0.153 3 mg GAE/g DW，不同存在形式百香果果皮多酚的含量表现为游离酚＞酯化酚＞结合酚；百香果果皮中游离酚、酯化酚和结合酚的DPPH·清除率和FRAP值均与反应时间成正比，反应时间到50 min时达到稳态；不同存在形式百香果果皮多酚的抗氧化能力大小表现为游离酚＞酯化酚＞结合酚。同时，通过对3种形式多酚进行成分分析，表明百香果果皮中3种形式多酚在种类和组分上存在着很大的差异。
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