玉米是禾本科玉蜀黍属植物，富含对人体健康有益的活性成分，如蛋白质、脂肪、维生素以及微量元素等。隐性饥饿（hidden hunger）是指机体营养不平衡或者缺乏某种维生素及人体必需的矿物质。铁缺乏位居全球三大“隐性饥饿”之首，影响到世界上20%～50%的人群[1]。2岁以内婴幼儿、60岁以上老人、育龄妇女是贫血患病的高危人群[2]。铁缺乏或贫血可对人体健康产生多种危害，包括儿童生长发育迟缓、工人劳动效率下降、机体免疫力降低等[3]。人体铁的主要膳食来源为主食农作物，而主食中铁含量低，且含有多种抗营养因子影响铁的吸收利用，从而导致膳食摄入可利用铁不足[4]。通过植物育种或转基因技术对作物生物强化从而改善铁营养状况的良好效果已得到了证明[5]。近年来通过培养液培育萌发谷物及豆类种子提高其营养价值成为新的预防隐性饥饿的方式，余赛西等[6]使用铁、锌培养液强化萌发大豆，发现铁、锌培养液能够提高发芽大豆中微量元素铁、锌和铁蛋白的含量，有效地提高了发芽大豆中铁、锌元素含量。李圆圆等[7]利用锌、锰、铜、亚铁培养液萌发黑豆发现能够提高黑豆中微量元素和营养素含量，并且能够降低植酸等抗营养因子的含量，提高了黑豆微量元素的生物可利用性，从而提高了黑豆营养价值。尽管有关通过含有微量元素的培养液生物强化种子萌发的研究越来越多，但是关于玉米生物强化的相关研究较少，使用不同形态的铁培养液强化萌发玉米，探究玉米芽苗营养特性变化的研究还尚未见报道。
本试验使用超纯水对玉米种子浸种，对两种不同的外源铁强化剂进行生物强化萌发，研究不同铁强化剂对玉米微量元素和营养物质的影响，为富铁玉米芽苗菜成为人体补铁的膳食营养来源提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
金海13号：莱州市金海种业有限公司；盐酸（优级纯）、七水合硫酸亚铁（分析纯）、过氧化氢（优级纯）、正丁醇（分析纯）、硝酸（优级纯）、亚硝酸钠（分析纯）、草酸（分析纯）：西陇化工股份有限公司；乙二胺四乙酸铁钠[（ethylenediaminetetraacetic acid ferric sodium salt，FeⅢ-EDTA），分析纯]、三羟甲基氨基甲烷、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、2，4，6-三吡啶基三嗪、芦丁（分析对照品）：上海麦克林生化科技有限公司；Zn标准溶液、Fe标准溶液（1 000 μg/mL）：国家有色金属及电子材料分析测试中心；次氯酸钠（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：广州光华科技股份有限公司；硝酸铝（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸亚铁铵（分析纯）、碳酸氢钠（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；原花青素（分析对照品）：上海源叶生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
FA1004N 电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；101B数显式电热恒温干燥箱：上海沪越实验仪器有限公司；THZ-82水浴恒温振荡器：国华企业公司；单道可调式手动移液器[eppendorf（0～1 000 μL）、Finnpipette（1 mL～5 mL）]；TAS-99 火焰原子吸收分光光度计、TU-1901紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；HSR025型人工气候箱：南京实验仪器厂；DL-5-B离心机：上海安亭科学仪器厂；JL-180DTH超声波清洗仪：上海杰理科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 两种铁培养液的配制
准确称取0.124 4 g七水合硫酸亚铁于烧杯中，加水溶解后转移到250 mL容量瓶中，用水定容至刻度线得硫酸亚铁浓度为100 μg/mL的培养液。随后依次稀释成 5、10、20、50、100 μg/mL 的培养液；准确称取0.164 3 g乙二胺四乙酸铁钠于烧杯中，加水溶解后转移到250 mL容量瓶中，用水定容至刻度线得FeⅢ-EDTA浓度为100 μg/mL的培养液。并依次稀释得到 5、10、20、50、100 μg/mL 的培养液。
1.3.2 玉米芽苗的制备
玉米种子的选取和萌发前处理参考Zou等[8]的方法稍有改动，使用清水冲洗表面后用3%的次氯酸钠溶液消毒15 min，消毒结束后用蒸馏水冲洗种子表面3次～5次。玉米种子萌发条件参考GB/T 3543.4—1995《农作物种子检验规程发芽试验》[9]，将消毒后的玉米种子在人工气候箱内，使用超纯水避光浸泡10 h，浸泡完毕后将玉米种子转移到敞口塑料盒中，培养盒底部带有排水孔和一层定性滤纸，并在种子上面覆盖一层滤纸，随后将培养盒置于（28±1）℃人工气候箱中避光培养96 h，每4 h用不同浓度的两种铁培养液（硫酸亚铁和FeⅢ-EDTA：5、10、20、50、100 μg/mL）分别喷洒，使玉米种子保持在湿润环境中萌发。同时设置玉米未萌发种子为空白组，超纯水萌发玉米为对照组。将强化萌发后的玉米样品可食部分和不可食部分分开，将可食部分置于60℃恒温干燥箱中干燥24 h后用研钵研磨成粉，过30目（0.600 mm）标准筛，装入样品袋-4℃冷藏保存。
1.3.3 铁、锌元素的分析测定
取0.5 g样品装入消化罐，加入5 mL浓硝酸过夜进行预消化（或预消化4 h），预消化完成后加入1.5 mL双氧水，将消化罐组装密封后于160℃下恒温消化5 h，消化结束后用5%硝酸定容到50 mL容量瓶，采用火焰原子分光光度法测定铁、锌含量。
1.3.4 玉米芽苗中总黄酮含量的测定
总黄酮的提取参考耿敬章[10]的方法，并有所改动，称取1.0 g样品于具塞试管中，加入15 mL 60%乙醇溶液，50℃恒温水浴提取2 h后将提取液转入25 mL容量瓶并用60%乙醇溶液定容，随后总黄酮含量采用氯化铝-亚硝酸钠比色法[11]测定，以芦丁为标准品，采用分光光度法测定其含量，总黄酮含量以mg/kgDW表示。
1.3.5 玉米芽苗中原花青素含量的测定
原花青素含量测定参考黄爱妮等[12]的方法，并有所改动，称取玉米芽苗粉末0.5 g，用10 mL 50%乙醇溶液溶解，并超声处理约20 min后于3 000 r/min离心20 min，离心后取上清液，重复1次后合并上清液用50%乙醇溶液定容到25mL。然后于10mL具塞试管中分别加入6 mL正丁醇-盐酸溶液、1 mL系列标准溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）和样品溶液、2 mL 硫酸铁铵溶液（用2 mol/L盐酸配成2%的溶液），混匀，同步做空白试验。将所有试管置于沸水中精确反应40 min后，立即放在冰水中15 min。在546 nm处，用甲醇调零，测定标准系列溶液和样品的吸光度，并绘制标准曲线计算溶液中原花青素浓度，计算含量。
1.3.6 玉米芽苗的总抗氧化能力测定
总抗氧化能力测定参考Benzie等[13]方法，稍有改动。配制浓度为 0、22、44、66、88、110 μg/mL 的 VC标准溶液，取0.3 mL的VC标准溶液和样液，加入9 mL 2，4，6-三吡啶基三嗪（tri-2-pyridyl-s-triazine，TPTZ）工作液，0.6 mL超纯水，在37℃下反应30 min后，在593 nm处测量吸光度。TPTZ工作液由pH3.6的0.3 mmol/L醋酸盐缓冲液、10 mmol/L的TPTZ溶液和20 mmol/L的FeCl3溶液以10∶1∶1的体积比配制而成。样品的总抗氧化能力以μg VC/g DW表示。
1.3.7 DPPH自由基清除率测定
DPPH自由基清除率测定参考Islam等[14]的方法，略微改动，准确称取0.019 7 g DPPH试剂，甲醇溶解定容至250 mL，得到2×10-4mol/L的DPPH溶液，吸取2 mL甲醇提取物加入2 mL DPPH溶液摇匀，在黑暗中反应10 min，然后在525 nm处测定其吸光度。用下列方程计算其清除活性。
式中：A为DPPH甲醇溶液的吸光度；B为DPPH甲醇提取物（样品）的吸光度。
1.4 数据分析
为了确保试验数据的准确性，所有试验重复进行3次，利用SPSS 26.0软件对所得数据进行处理，采用Duncan进行显著性差异分析（P=0.05），所有图形采用Origin 9.0绘制。
2 结果与分析
2.1 铁强化玉米芽苗中Fe、Zn含量
2.1.1 铁强化玉米芽苗中Fe含量
铁强化玉米芽苗中Fe含量见图1。
图1 铁强化玉米芽苗中Fe含量
Fig.1 The content of Fe in iron-enriched corn sprout
不同小写字母表示显著性差异，P＜0.05。
由图1可以发现未发芽玉米种子中Fe含量约为45.22mg/kgDW，经过发芽处理后玉米芽苗中Fe含量与未发芽种子相比有略微的上升，达到了55.18mg/kgDW。有研究[15]证明萌发有利于谷物、豆类对微量元素的吸收并促进其营养价值提升，胡广林等[16]研究也表明使用碘培养液强化萌发玉米能够促进玉米对碘元素的富集。玉米种子经过铁培养液培育过后的玉米芽苗中Fe含量都有显著提升。当培养液为硫酸亚铁，在浓度为100 μg/mL时，Fe含量达到最高497.97 mg/kg DW，相比对照组增加了902.45%。培养液为FeⅢ-EDTA时最高含量也是在浓度为100μg/mL，Fe含量达到了最高，为249.32 mg/kg DW，相比对照组增加了451.83%。但是当培养液为硫酸亚铁，浓度为5 μg/mL时，玉米芽苗中的Fe含量有所下降，可能原因是由于低浓度的铁培养液促进种子萌发，并合成了相关酶，导致Fe有所流失。总体来说，硫酸亚铁培养液对玉米芽苗中Fe元素的富集效果比FeⅢ-EDTA强，但是在低浓度（小于50 μg/mL）时，FeⅢ-EDTA的促进效果比硫酸亚铁更好，Sida-Arreola等[17-18]研究表明螯合形态的铁比离子形态铁更容易在豆类谷物种子中富集，且螯合铁相比离子铁更容易提高谷物豆类的生物产量。
2.1.2 铁强化玉米芽苗中Zn含量
铁强化玉米芽苗中Zn含量见图2。
图2 铁强化玉米芽苗中Zn含量
Fig.2 The content of Zn in iron-enriched corn sprout
不同小写字母表示显著性差异，P＜0.05。
由图2可知，未发芽玉米中Zn含量约为17.76 mg/kg DW，玉米经过发芽处理后Zn的含量有所提升，达到了22.09 mg/kg DW。发芽可以使植物中部分微量元素含量提高，但是经过外源硫酸亚铁培养液培育过后的玉米芽苗中Zn含量相比未发芽种子有略微上升，浓度为5 μg/mL时有略微下降，但相比对照组都略微下降，浮动约在79.58%～98.78%，可能是由于随着外源铁浓度的增高，种子中微量元素锌的吸收受到了一定的抑制作用。经过FeⅢ-EDTA培养液培育过后的玉米芽苗中Zn含量与硫酸亚铁类似，相比未发芽种子有提升，相比对照组有所下降（除浓度20 μg/mL外），浮动约在85.20%～108.19%。但在浓度为20 μg/mL时，玉米芽苗相比对照组的Zn含量有略微提升。
2.2 铁强化玉米芽苗中营养成分含量变化
2.2.1 总黄酮含量变化
铁强化玉米芽苗中总黄酮含量见图3。
图3 铁强化玉米芽苗中总黄酮含量
Fig.3 The content of total flavonoids in iron-enriched corn sprout
不同小写字母表示显著性差异，P＜0.05。
由图3中可以看出，未发芽的玉米种子中总黄酮含量为841.56 mg/kg DW，经过蒸馏水发芽处理后总黄酮含量提高到了1 100.00 mg/kg DW，提高了大约130.71%。通过两种不同培养液强化培育后总黄酮含量均有了一定提升，在培养液为FeⅢ-EDTA，浓度为5 μg/mL时含量最高可达到2 163.83 mg/kg DW。相比未发芽种子总黄酮含量提高了257.12%，相比对照组提高了196.71%。另外，通过数据分析发现，使用FeⅢ-EDTA培养液强化对玉米芽苗中总黄酮含量的提升大于使用硫酸亚铁培养液对玉米芽苗中总黄酮含量的影响，说明使用FeⅢ-EDTA培养液更有利于黄酮类物质在玉米芽苗体内的合成。
2.2.2 原花青素含量变化
铁强化玉米芽苗中原花青素含量见图4。
图4 铁强化玉米芽苗中原花青素含量
Fig.4 The content of anthocyanins in iron-enriched corn sprout
不同小写字母表示显著性差异，P＜0.05。
如图4所示，未发芽的玉米种子中原花青素含量为213.23 mg/kg DW，这与Zhao等[19]得到的结果一致。Fe强化玉米芽苗中原花青素含量达到了216.54mg/kgDW～375.46 mg/kg DW。其中当培养液为硫酸亚铁时，经过Fe强化过后的玉米芽苗中原花青素含量有明显的提高，在浓度为20 μg/mL时达到最高，约为375.46mg/kgDW相比未发芽玉米种子提高了176.08%。当培养液为FeⅢ-EDTA时，只有当浓度为10μg/mL～20μg/mL时，原花青素含量相比未发芽种子有明显提高，在浓度为10μg/mL时最高达到321.04 mg/kg，相比未发芽种子提高了150.56%。另外，经过Fe强化过后的玉米芽苗中原花青素含量有明显变化，且培养液为硫酸亚铁时强化效果比FeⅢ-EDTA更好，说明使用硫酸亚铁为培养液时更有利于玉米芽苗体内合成原花青素。
2.3 抗氧化活性评价
2.3.1 总抗氧化能力测试
铁强化玉米芽苗中总抗氧化能力见图5。
图5 铁强化玉米芽苗中总抗氧化能力
Fig.5 The total antioxidant capacity of iron-enriched corn sprout
不同小写字母表示显著性差异，P＜0.05。
由图5可以看出，未发芽玉米的总抗氧化能力约为44.49μgVC/gDW，对照组则达到了82.43μgVC/gDW。当培养液为硫酸亚铁时，在浓度为50 μg/mL～100 μg/mL时，总抗氧化能力提升较为明显，在50 μg/mL达到最大，约为102.90 μg VC/g DW。当培养液为FeⅢ-EDTA时，在浓度为 5 μg/mL～20 μg/mL 以及 100 μg/mL 时提升最为明显，在浓度为10μg/mL时最高达到119.89μgVC/g DW。另外，FeⅢ-EDTA对玉米芽苗的总抗氧化能力的影响要大于硫酸亚铁对玉米芽苗总抗氧化能力的影响。
2.3.2 DPPH自由基清除能力测试
铁强化玉米芽苗中DPPH自由基清除率见图6。
图6 铁强化玉米芽苗中DPPH自由基清除率
Fig.6 The DPPH free radical scavenging rate in iron-enriched corn sprout
不同小写字母表示显著性差异，P＜0.05。
如图6所示，铁强化玉米芽苗的DPPH自由基清除率均高于未发芽玉米，除培养液为FeⅢ-EDTA且浓度为20 μg/mL和50 μg/mL时，其他相比未发芽玉米均存在显著性差异（P＜0.05），所有经过培养液强化的玉米芽苗相比对照组均无显著性差异（P＞0.05），DPPH自由基清除率整体呈现低浓度促进、高浓度抑制的规律，Li等[20]研究也发现经过铁培养液强化萌发过的发芽糙米DPPH自由基清除率也呈现低浓度促进、高浓度抑制的规律。当培养液为FeⅢ-EDTA，浓度为10 μg/mL时，DPPH自由基清除率最高达到87.63%，相比未发芽提高了123.60%。培养液为硫酸亚铁时DPPH自由基清除率最高达到了87.59%，此时浓度为50 μg/mL，相比未发芽提高了123.54%。但是培养液为硫酸亚铁对玉米芽苗DPPH自由基清除率的影响大于培养液为FeⅢ-EDTA时的影响。
3 结论
本研究表明，两种铁强化剂强化玉米萌发都能够提高玉米芽苗中Fe含量，且不会使玉米芽苗中Zn含量明显变化，另外玉米芽苗中总黄酮含量、原花青素含量都有所提高，通过对玉米芽苗的总抗氧化能力以及DPPH自由基清除率的测定，发现经过铁强化萌发后的玉米芽苗抗氧化能力和DPPH自由基清除率相比对照组都有所提升。说明使用Fe强化剂培育萌发玉米种子能够提升玉米芽苗的营养品质，所以使用外源铁培养液培育的富铁玉米芽苗菜在人体补铁及其他营养健康领域中具有应用价值。
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