南极磷虾是南极海洋中主要的磷虾种类，近年来，磷虾的营养保健功能已被广泛报道[1-3]，其独特的营养成分使得人们对磷虾产品研发的兴趣日益增加。极性脂和甘油三酯(tiglyceride，TAG)是南极磷虾的主要脂质组分，分别占其总脂含量的56%～81%和12%～38%[4]。南极磷虾油是从整个南极磷虾或磷虾粉获得的脂质提取物，磷虾油中磷脂（phospholipid，PL）占总脂含量的40%以上[5]，这与植物食用油以TAG（＞95%）为主要脂质组分不同。南极磷虾油富含ω-3型多不饱和脂肪酸（ω-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3 PUFA），特别是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。研究表明，EPA和DHA作为重要的功能性脂肪酸能改善人类的大脑功能[6]、降低心血管风险[7]和减少慢性炎症[8]等。磷虾中的EPA和DHA主要以磷脂形式存在[9-10]，而鱼类中的ω-3 PUFA主要以TAG形式存在。研究表明，相比于TAG型EPA和DHA，PL型EPA和DHA能够更好地渗入组织中，具有更强的心脏保护作用[11]和生物活性[12]。随着消费者对高品质磷虾油的需求量不断增加，市场上出现的许多品牌的南极磷虾油，品质差异较大[13]。为了磷虾油产业的健康发展，要健全其产品的过程控制及质量的评价体系。目前EPA和DHA含量为磷虾油品质评价指标之一[14]，通过在磷虾油产品中添加鱼油可提高EPA和DHA含量。因此建立更准确地评价磷虾油产品方法对于磷虾油产品市场健康发展具有重要意义[15-16]。
基于内标十七烷酸甲酯（methyl heptadecanoate，C17:0-ME）的EPA定量分析方法，通过薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）分离，采用气相色谱法定量分析南极磷虾油卵磷脂（lecithin，PC）型EPA的含量，提出南极磷虾油PC型EPA占总EPA比例的评价指标，这一指标可以有效定量EPA的单一存在形式，甄别出含有外源添加EPA的南极磷虾油，本文利用该指标分析了6种不同来源南极磷虾油的品质，为南极磷虾产品的质量控制评价提供了科学依据。
1 材料与方法
1.1 试剂
正己烷（色谱纯）：德国Merck公司；氯仿、甲醇、三乙胺、丙酮（分析纯）：天津科密欧有限公司；二十碳五烯酸甲酯（methyl eicosapentaenoate，EPA-ME）标准品（纯度≥98.5%）、C17:0-ME标准品（纯度≥99%）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）标准品（纯度≥99%）、PC标准品（纯度≥99%）：美国SIGMA公司。
1.2 南极磷虾油样品
南极磷虾油样品及厂家见表1。
表1 南极磷虾油样品及其厂家
Table 1 Antarctic krill oil samples and manufacturers
样品 厂家1、2、3 中国吉林省中冠生物科技（珲春）有限公司4美国纽曼斯公司5澳大利亚斯维诗公司6加拿大维柏健公司7英国邦利公司8德国双心公司9美国海王星公司
1.3 仪器与设备
7890B型气相色谱仪（附氢火焰离子化检测器）：美国Agilent公司；BS210S分析天平：德国Sartorius公司；Silica gel 60 F254硅胶板（0.20 mm，20 cm×20 cm）：德国Merck公司。
1.4 试验方法
1.4.1 标准品溶液的配制
EPA-ME标准溶液：用正己烷分别配制成浓度为 0.20、0.23、0.29、0.33、0.39 mg/mL；C17:0-ME 标准溶液：用正己烷分别配制成浓度为 0.04、0.19、0.38、0.57、0.76 mg/mL，现配现用。
1.4.2 南极磷虾油样品转酯化
称量南极磷虾油样品至10 mL圆底烧瓶中，加入5 mL 2%的H2SO4-甲醇，70℃油浴反应1 h。反应结束后冷却至室温（25℃），向烧瓶中加入2 mL正己烷和0.75 mL蒸馏水，混合30 s[17]。取上层有机相进行气相色谱分析[18]。
1.4.3 气相色谱检测条件
色谱柱：DB-23色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），色谱柱升温程序：130℃保持1 min；130℃～170℃，10℃/min；170℃～215℃，2.8℃/min保持 1 min。进样口温度：270℃，氢火焰离子化检测器温度：270℃，进样方式：分流进样，分流比 10∶1，进样量：1 μL，载气：高纯氮气（99.99%）。
1.4.4 校正因子的计算
分别读取EPA-ME和C17:0-ME（内标）峰面积，按下式计算校正因子。
式中：f为校正因子；A内标为内标C17:0-ME峰面积；A标准品为 EPA-ME 峰面积；M内标为内标 C17:0-ME质量，mg；M标准品为 EPA-ME 的质量，mg。
1.4.5 南极磷虾油中EPA含量的测定
采用校正的内标法对EPA进行定量，EPA的含量（xi）计算公式如下。
式中：Ai为EPA的峰面积；A内标为内标C17:0-ME的峰面积；Mi为所称取南极磷虾油的准确质量，mg；M内标为内标 C17:0-ME 质量，mg。
1.4.6 PC型EPA含量的定量分析
称取等质量的南极磷虾油样品，用氯仿溶解点于硅胶板上，展开剂采用氯仿∶甲醇∶水∶三乙胺（50∶40∶8∶50，体积比）[19]。待溶剂完全挥发后，利用浓度0.05%（溶剂为20%水和80%丙酮）樱草黄喷雾显色，紫外灯365 nm下观察。将PC条带刮下，按照1.4.2和1.4.3进行转酯化和气相色谱分析。
1.5 统计分析
试验数据采用SPSS 18.0进行统计分析，结果以平均值±标准偏差表示（n=3），利用单因素方差分析（ANOVA）对不同南极磷虾油产品品质的差异显著性进行统计分析，当差异显著时，对数据进行Turkey多重比较分析，以P＜0.05作为差异显著性水平。
2 结果与分析
2.1 基于C17:0-ME内标法的EPA定量分析
C17:0-ME、EPA-ME标准品及不同来源南极磷虾油样品的气相色谱图见图1。
图1 C17:0-ME、EPA-ME标准品及不同来源南极磷虾油样品的气相色谱图
Fig.1 The gas chromatograph of EPA-ME,C17:0-ME standards and Antarctic krill oil samples from different sources
由图1可知，EPA-ME和C17:0-ME标准品的保留时间分别为14.9、7.5min，两种脂肪酸甲酯完全分离。此外，南极磷虾油样品4的EPA-ME的保留时间为14.9min，样品5～9的EPA-ME的保留时间为15.8min。从气相色谱分析图中可以定性比较不同来源南极磷虾油样品PC型EPA的含量，图1显示，样品6和样品7的PC型EPA的含量较高，样品5和9次之，样品4和8较低。
不同浓度EPA-ME对内标C17:0-ME的相对质量校正因子见表2。
表2 EPA-ME对内标C17:0-ME的相对质量校正因子
Table 2 The relative mass correction factor of EPA-ME in relative to the internal standard C17:0-ME
（mg/mL） 峰面积 质量浓度/（mg/mL） 峰面积C17:0-ME EPA-ME f（EPA-ME/C17:0-ME） f平均值质量浓度/images/BZ_168_490_2720_504_2774.png0.04 58.7 0.20 189.9 1.55 1.52±0.03 0.19 309.6 0.23 240.1 1.56 0.38 622.3 0.29 317.8 1.50 0.57 950.1 0.33 367.4 1.50 0.76 1 265.3 0.39 440.5 1.47
由表2可知，C17:0-ME浓度的线性范围为0.04 mg/mL～0.76 mg/mL，在该范围内得到EPA-ME对C17:0-ME的相对质量校正因子为1.52。
2.2 南极磷虾油PC型EPA的定量分析及PC型EPA含量占总EPA含量比例的确定
磷脂标准品和样品1～3的磷脂分离见图2。
图2 磷脂标准品和南极磷虾油磷脂的分离
Fig.2 Separation of phospholipid standard and Antarctic krill oil phospholipid
A.PE标准品、PC标准品、PE与PC的混合标准品；B.样品1～3。
由图2可知，南极磷虾油的PL主要包括PC、溶血磷脂酰胆碱（lysolecithin，LPC）和PE，而PC和LPC是南极磷虾油的主要组分，本研究测定的PC组分是分离的PC和LPC含量之和。
基于C17:0-ME对EPA-ME的相对质量校正因子计算得到南极磷虾油样品1～3的PC型EPA的含量，具体见表3。
表3 南极磷虾油样品1～3的品质分析
Table 3 Quality evaluation of Antarctic krill oils samples 1-3
注：同一列数值带有同一字母上标表示差异不显著（P＞0.05）；带有不同字母上标表示差异显著（P＜0.05）。
样品编号 PC型EPA含量/%（PC型EPA含量/总EPA含量）/%1 11.2±0.6b 15.8±0.4b 71.0±1.6b 2 6.0±0.5a 11.6±0.3a 51.7±3.0a 3 10.0±0.4b 11.9±0.3a 84.7±5.0c总EPA含量/%
从TLC中获得的PC组分，由于量非常少，大约为0.5 mg～1 mg，用称重法难以进行准确定量。因此，将TLC分离得到的样品PC经转酯化进行了脂肪酸甲酯的定量分析。比较样品1和2的总EPA含量以及PC型EPA的含量，总EPA含量均为南极磷虾油质量的10%以上，样品1中的总EPA含量比样品2高27%。从总EPA含量来分析两个样品的品质，样品1优于样品2。通过对其PC型EPA的含量进行测定，结果显示，样品1的PC型EPA含量约为样品2的2倍，结合总EPA的含量，计算得到两个样品PC型EPA占总EPA含量的比例，均大于50%，且样品1比样品2高27%。从这一参数分析两个样品的品质，得到的结论与通过总EPA含量分析得到的结果一致，说明PC型EPA含量占总EPA含量比例这一参数可以作为分析不同来源南极磷虾油品质的指标，且能够准确定量南极磷虾油样品中的PC型EPA含量。此外，样品3所含PC型EPA含量占总EPA含量比例高达85%左右。虽然样品1和2的PC型EPA含量占总EPA含量的比例达到了50%以上，但其品质还能够通过工艺优化进一步提高。
按照1.4.5和1.4.6方法计算不同来源南极磷虾油（样品4～9）PC型EPA含量占总EPA含量的比例，结果见表4。
表4 不同来源南极磷虾油（样品4～9）品质的比较
Table 4 Comparison of the quality of Antarctic krill oil samples（4-9）from different sources
注：同一列数值带有同一字母上标表示差异不显著（P＞0.05）；带有不同字母上标表示差异显著（P＜0.05）。
样品编号PC型EPA含量/非PC型EPA含量4 4.7±0.1b 9.6±0.2b 48.0±0.6b 0.92 5 6.9±0.1d 13.2±0.2c 52.3±0.6b 1.10 6 9.1±0.1e 13.0±0.3c 70.0±2.4c 2.33 7 9.6±0.3e 14.5±0.2d 64.5±0.6c 1.82 8 4.0±0.3a 7.8±0.7a 51.3±0.6b 1.05 9 5.3±0.3c 17.9±0.2e 29.7±1.5a 0.42 PC型EPA含量/%总EPA含量/%（PC型EPA含量/总EPA含量）/%
从测定结果分析，样品5和6的总EPA含量无显著差异，但样品6中PC型EPA含量占总EPA含量的比例显著高于样品5，且样品6中PC型EPA含量是非PC型EPA含量的2倍左右，综合总EPA含量的数据和PC型EPA/总EPA含量数据，说明了样品6中EPA的存在形式主要是PC型。比较样品5和8，样品5的总EPA含量约为样品8的2倍，但两个样品PC型EPA含量占总EPA含量的比例无显著差异，同时样品5和样品8的PC型EPA含量与非PC型EPA含量的比值相当，说明两个样品的EPA存在形式是一致的。
样品9的总EPA含量达到17.9%，均高于其它5种南极磷虾油，但其PC型EPA含量占总EPA含量的比例只有29.7%，均低于其它5种南极磷虾油，表明该样品的EPA主要以非磷脂型EPA形式存在，如TAG型或游离型EPA。因此南极磷虾油中总EPA含量不能反映EPA的存在形式，而PC型EPA含量占总EPA含量的比例能够对南极磷虾油EPA的存在形式进行准确的表征，区别出含有外加非磷脂型EPA的虾油。PC型EPA含量占总EPA含量的比例作为过程控制参数，也可以表征磷脂的水解情况。
根据这一参数分析本研究中这6种南极磷虾油样品的品质，较优的为样品6和样品7，PC型EPA含量占总EPA含量的比例均在60%以上；其次为样品4、5、8。这5种样品PC型EPA含量占总EPA含量的比例在48%～70%之间；而样品9的该参数显著低于其它5种样品，以此为标准可以鉴定不同南极磷虾油产品的品质。
3 结论
本研究建立了基于C17:0-ME内标法准确测定EPA的定量方法，测定得到的EPA-ME相比于C17:0-ME的相对质量校正因子为1.52。结合TLC分离定量分析了南极磷虾油PC型EPA的含量，提出了PC型EPA含量占总EPA含量的比例这一南极磷虾油品质评价指标，根据这一参数分析了6种不同来源南极磷虾油的品质，并筛选出优质南极磷虾油（样品6和样品7），其PC型EPA含量占总EPA含量的比例在60%以上，最高可达70%，这些结果为南极磷虾油产品质量标准评价体系的建立提供科学依据。
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