β-胡萝卜素作为主要的食品天然色素，广泛存在于自然界中。但是其水溶性差和不稳定性严重限制了其应用，这也使得β-胡萝卜素在生产加工和应用中存在着很大局限[1]。为了解决这个难题，许多学者尝试运用了多种方法，其中最有效的方法就是利用微胶囊技术将其包埋，从而提高其稳定性和水溶性。
微胶囊技术是新兴的保护芯材技术，选择最合适的包壁材料在微胶囊技术中是一个至关重要的问题，并且决定着微胶囊产品的理化性质。从其来源分类，可选的壁材主要有天然的、半合成的以及合成的高分子材料[2]。
鉴于β-胡萝卜素的水溶性差和不稳定性的特点，国内外许多专家学者对β-胡萝卜素的微胶囊化进行了广泛深入的研究，Desobry[3]使用麦芽糊精作为壁材，对β-胡萝卜素进行包埋，并且测定其在喷雾干燥、滚筒干燥和冷冻干燥条件下的保存效果，并且研究其在不同湿度和贮藏温度下的稳定性，得到的主要结论是滚筒干燥的方法是最好的；胡富强等[4]使用明胶、阿拉伯胶作为壁材，采用复凝聚法制备β-胡萝卜素微胶囊。以光照试验考察了β-胡萝卜素微胶囊的稳定性，发现在室温贮藏条件下，光照对β-胡萝卜素稳定性有较大影响[1]，将β-胡萝卜素包埋之后，微胶囊可以保护里面的β-胡萝卜素不被氧化变质，可增加其稳定性；Wagner[5]研究不同取代度的淀粉水解产物对喷雾干燥后的β-胡萝卜素稳定性的影响，结果发现高取代度（36.5）的淀粉比其他 3 种低取代度（4、15、25）的淀粉对β-胡萝卜素有更好的保留效果。果胶是一种具有黏胶性的多糖，在食品和医药生产中都有广泛的利用，为此，在研究了不同壁材及配比对β-胡萝卜素包埋的影响后，选择了乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）单独进行包埋和乳清分离蛋白果胶混合物包埋两种制备工艺。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
β-胡萝卜素晶体粉末（96%）、乳清分离蛋白：景竹生物科技有限公司；中链甘油三酯、果胶：上海源叶生物科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、丙酮、石油醚、氯仿、环己烷（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
离心机（TDL-5-A）：上海安亭科学仪器厂；电子天平（EL204-IC）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；pH计（PHS-25）：上海圣科仪器设备有限公司；水浴恒温振荡器（DSHZ-300A）：苏州培英实验设备有限公司；磁力搅拌器（85-2）：郑州长城科工贸有限公司；均质器（PT MR 2100）：瑞士 Kinewmatica公司；激光颗粒度分布仪（APA2000）、Zeta电位仪（Zetasizer Nano）：英国马尔文仪器有限公司；真空冷冻干燥机（ALPHA1-4LD）：德国M.CHRIST；高压微射流纳米均质机（M-110L）：美国安捷伦公司；扫描电镜（JSM-6390LV）：日本NTC公司；透射电镜（H-7650）：日本 HITACHI公司；傅里叶变换红外光谱仪（Nexus 470）：美国Nicolet公司。
1.2 方法
1.2.1 β-胡萝卜素标准曲线的制作
1.2.1.1 β-胡萝卜素测定波长的选择
采用洪清等[6]的方法：准确称取β-胡萝卜素晶体粉末0.002 5 g于100 mL棕色容量瓶中，加入少量氯仿溶解后，用环己烷定容至100 mL。取10 mL溶液于另一个100 mL棕色容量瓶中，用环己烷定容至100 mL，配制成2.5μg/mL的溶液，以环己烷为空白，在400 nm～500 nm波长下扫描检测β-胡萝卜素的吸收光谱，确定最大吸收峰的波长。
1.2.1.2 β-胡萝卜素含量的测定
参照韩宁[7]的方法，用分光光度法制作β-胡萝卜素标准曲线：准确称取β-胡萝卜素晶体粉末0.025 0 g（纯度96%）于50 mL棕色容量瓶中，先加入1 mL氯仿溶解，用丙酮∶石油醚（1∶1，体积比）混合有机剂定容至50 mL；再将此溶液稀释10倍，分别准确取0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL 于 25 mL 棕色容量瓶中，定容至25 mL；以丙酮∶石油醚（1∶1，体积比）混合有机溶剂为空白对照，分别在最大吸收波长455nm处测定OD455nm，绘制β-胡萝卜素标准曲线。
1.2.2 β-胡萝卜素微胶囊的制备
参考崔健等[8]的方法，做适当改变后如下：将0.2%果胶溶解于50 mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）中，4℃冷藏备用；将1%乳清分离蛋白溶于50 mmol/L磷酸缓冲液中（pH7.0），25℃下磁力搅拌至完全溶解，制备成水相；将β-胡萝卜素溶于0.2%中链甘油三酯（medium chain triglycerides，MCT），磁力搅拌至完全溶解，制备成油相；将油相与水相按质量比1∶9混合，利用均质器于19 000 r/min下高速剪切2 min；向初级乳状液中分别加入磷酸缓冲液（pH7.0）和果胶溶液，初乳占总体积一半；将混合溶液磁力搅拌30 min，再用1 mol/L的HCl调节混合液的pH值至3.0，得到二级乳状液；将二级乳状液在0.076 MPa下高压微射流均质3次；将乳状液冷冻干燥后得到两种β-胡萝卜素微胶囊粉末。
1.2.3 β-胡萝卜素包埋率的测定
参照许波[9]的方法，略作调整后，进行β-胡萝卜素微胶囊包埋率的测定。准确称取0.1 g β-胡萝卜素微胶囊样品于25 mL离心管中，加入10 mL丙酮∶石油醚（1∶1，体积比）混合有机溶剂，剧烈振荡 2 min；然后高速离心 5 min（4℃，转速 6 000 r/min）；吸取 5 mL上清液于 50 mL棕色容量瓶中，用丙酮∶石油醚（1∶1，体积比）混合有机剂定容至 50 mL；以丙酮∶石油醚（1∶1，体积比）为空白对照，455 nm处测定吸光值。参照β-胡萝卜素含量标准曲线，测得微胶囊表面β-胡萝卜素含量。包埋率按以下公式计算。
1.2.4 Zeta电位仪测定电位和粒径
为了降低多重光散射效应，在测定前用蒸馏水将β-胡萝卜素微胶囊乳状液稀释100倍[10]。用Zeta电位仪分别测定WPI单独包埋和WPI果胶混合物包埋的β-胡萝卜素微胶囊的平均粒子直径（25℃），并分别测定乳清分离蛋白和果胶的Zeta电位。
1.2.5 红外光谱分析
通过傅里叶红外光谱，比较物质在红外光区对光的吸收，分析β-胡萝卜素包埋前后在微胶囊中的形态和壁材间的相互作用，以判断包埋物是否形成。如果形成了包埋物，分子间的非共价键作用，如疏水作用、范德华力和氢键，其键能会降低，相应基团的吸收强度会减弱，由此来判断壁材的包埋作用[10]。
样品在检测前要在红外光下烘干至少1 h，取少量烘干后的样品和干燥的溴化钾粉末一起研磨，直至无晶体存在，然后压制成均匀无裂缝的薄片。
1.2.6 用透射电镜观察
将β-胡萝卜素微胶囊乳液稀释至微透明状，捞片晾干，用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察两种不同β-胡萝卜素微胶囊的形态，比较差异，同时验证用光散射粒径分析的粒径大小。
2 结果与分析
2.1 β-胡萝卜素标准曲线
2.1.1 β-胡萝卜素最大吸收波长
β-胡萝卜素晶体粉末光谱扫描图见图1所示。
图1 β-胡萝卜素晶体粉末光谱扫描图
Fig.1 Spectral scanning of carotene crystal powder
如图1所示，光谱扫描β-胡萝卜素晶体粉末粉（纯度96%）在455 nm处有最大吸收波长，故选择OD455nm作为β-胡萝卜素的吸光值。
2.1.2 β-胡萝卜素含量测定
β-胡萝卜素含量标准曲线图见图2所示。
图2 β-胡萝卜素含量标准曲线
Fig.2 Standard curve of carotene content
如图 2所示，浓度在 1 μg/mL～3 μg/mL 范围内，β-胡萝卜素晶体粉末吸光度值与浓度呈现良好的线性关系，线性回归方程为y＝0.204x+0.009。
2.2 β-胡萝卜素微胶囊的包埋率
两种微胶囊表面β-胡萝卜素含量见表1。
表1 两种微胶囊表面β-胡萝卜素含量
Table 1 Carotene content on the surface of two kinds of microcapsules
编号WPI包埋/（μg/mL）WPI加果胶包埋/（μg/mL）1 0.738 0.625 2 0.744 0.609 3 0.744 0.599平均 0.742 0.611
由包埋率公式计算得乳清分离蛋白（WPI）、乳清分离蛋白果胶（WPI加果胶）混合物作为壁材的包埋率分别为85.6%和88.2%。说明乳清分离蛋白果胶混合物的双重壁材，可以提高β-胡萝卜素微胶囊的包埋率。
2.3 Zeta电位和粒径
乳清分离蛋白和果胶的电位值见表2。
表2 乳清分离蛋白和果胶的电位值
Table 2 Potential values of whey isolate protein and pectin
样品 Zeta电位/mV 1 2 3 平均果胶 -43.2 -44.6 -45.0 -44.3±1.2乳清分离蛋白 53.1 55.4 52.8 53.8±1.2
如表2所示，乳清分离蛋白带正电荷，果胶带负电荷，说明两者之间能形成静电吸引，为两者能形成微胶囊壁材且能增加微胶囊稳定性提供了理论基础。表3所示为WPI包埋的β-胡萝卜素微胶囊、WPI和果胶包埋的β-胡萝卜素微胶囊的平均粒径测定值。
表3 WPI包埋的微胶囊、WPI和果胶包埋的微胶囊的粒径
Table 3 Particle sizes of whey protein isolate embedded microcapsules whey protein isolate and pectin embedded microcapsules
样品 粒径/nm 1 2 3 平均WPI包埋的微胶囊 267 289 254 270±14.4 WPI和果胶包埋的微胶囊 208.7±4.9 208 215 203
从表3可以看出，选择用WPI和果胶混合包埋的β-胡萝卜素微胶囊的粒径更小，并且对于WPI包埋的β-胡萝卜素微胶囊而言，其平行性较好，因此可以认为对于大小和平行性，混合包埋的效果更好。
2.4 红外光谱
β-胡萝卜素晶体粉末、WPI包埋的微胶囊、WPI和果胶包埋的微胶囊的红外光谱图见图3所示。
图3 β-胡萝卜素晶体粉末、WPI包埋的微胶囊、WPI和果胶包埋的微胶囊的红外光谱图
Fig.3 Infrared spectra of β-carotene crystal powder，WPI encapsulated microcapsules,WPI and pectin encapsulated microcapsules
如图3所示，a为β-胡萝卜素晶体粉末红外光谱图，图中有几处强度较大的吸收峰：2 925.53 cm-1处是-CH3的伸缩振动引起的，1720.221cm-1和1631.51cm-1处的吸收峰为-C=C-伸缩振动；1 631.51 cm-1和1454.08cm-1则是苯环骨架C=C的伸缩振动；1454.08cm-1和1384.66cm-1则是由于甲基面内弯曲振动；966.18cm-1处吸收峰为反式碳碳双键面外摇摆振动。而在b和c中，这些官能团的吸收均减弱，说明乳清分离蛋白和果胶对β-胡萝卜素的结构产生了影响，即形成了包埋物。同时，WPI果胶混合物包埋的微胶囊在官能团处的吸收峰减少幅度更大，说明混合物包埋的程度更高，效果更好，能更多包埋活泼基团来提高稳定性。
2.5 透射电镜观察的结果
WPI包埋的β-胡萝卜素微胶囊在透射电镜下的形态图见图4所示，WPI和果胶包埋的β-胡萝卜素微胶囊在透射电镜下的形态图见图5所示。
图4 WPI包埋的β-胡萝卜素微胶囊在透射电镜下的形态
Fig.4 Morphology of WPI encapsulated β-carotene microcapsules under transmission electron microscope
图5 WPI和果胶包埋的β-胡萝卜素微胶囊在透射电镜下的形态
Fig.5 Morphology of WPI and pectin encapsulated β-carotene microcapsules under transmission electron microscope
从图4、图5中可以看到，无论是乳清分离蛋白还是乳清分离蛋白果胶混合物，都形成了包埋物，但是单一包埋的比较混杂，有些β-胡萝卜素还游离在外或夹杂在微胶囊之间，但是混合物包埋得到的微胶囊分布较均一，颗粒大小较稳定。
3 讨论与结论
本试验通过搅拌、高速剪切、高压微射流纳米均质和冷冻干燥，用乳清分离蛋白、乳清分离蛋白果胶混合物分别包埋β-胡萝卜素形成纳米级微胶囊，通过对两种微胶囊粒径的测量以及包埋率的比较，可以看出混合物包埋优于单一的乳清分离蛋白的包埋效果。并且混合物包埋的平行性较好，可以认为相对一段时间内的稳定性较好。
从红外光谱图分析的结果可以看出，官能团的变化证明了β-胡萝卜素包埋在微胶囊里面，不同材料的β-胡萝卜素微胶囊都有相应的振动覆盖，证明β-胡萝卜素被包埋在微胶囊里面。
透射电镜结果显示：两种β-胡萝卜素微胶囊都为完整的形态，但是乳清分离蛋白包埋的β-胡萝卜素微胶囊表面不圆滑，大小不均一，这也证明了之前测定粒径的时候，平行性不好的原因；但乳清分离蛋白和果胶混合物包埋的β-胡萝卜素微胶囊颗粒大小更为均匀，并且可以看到其表面更光滑，同时验证了粒径测定时，其平行性较好的原因。
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