我国柑橘资源丰富，在柑橘食用和加工过程中产生的废弃橘皮资源数量巨大[1-2]，橘皮中富含橘皮黄酮、橘皮色素、香精油、果胶等多种天然活性成分[3]。橘皮黄酮具有抗氧化、抗衰老、抗辐射等功效[4-6]，并有降压、降脂、降胆固醇、抗肿瘤等多种生理功能[7]。橘皮色素不仅具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化等生物活性[8-10]，还是安全无毒的着色剂、香味剂和强化营养剂[11]。橘皮黄酮和色素作为功能性添加剂[12]，已经广泛应用于食品、保健品、日化、医药等行业，应用前景广阔。
有关利用橘皮资源提取橘皮黄酮、色素、果胶等的报道很多[13]，但因缺乏高效的综合开发技术[14]，导致产品单一、经济效益不高[15]，丰富的橘皮资源难以得到有效利用，绝大部分被作为废弃物处理，而且还污染环境[16]。本试验兼顾黄酮和橘皮色素的溶解性能，以乙醇为提取溶剂，采用高压脉冲电场技术从橘皮渣中同步提取橘皮黄酮和色素，并对提取工艺进行优化，以期为合理、高效利用橘皮资源提供新方法。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
橘皮：南柑20号温州蜜柑新鲜果皮，湖南熙可食品有限公司柑橘罐头加工废弃料；芦丁对照品：中国食品药品检定研究院；乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、盐酸（均为分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。
LDT-100/4-25型中药高压脉冲电场提取装置：长春华迪生物科技公司；2-16PK高速冷冻离心机：德国Siva公司；DZF-6050E真空干燥箱：无锡玛瑞特科技公司；UVl601-PC紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；FA2104万分之一电子天平：上海舜宇恒平公司；M-50真空抽滤器：巩义瑞德仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 提取工艺流程
压榨取汁后的新鲜橘皮渣与乙醇溶液胶磨匀质，泵入高压脉冲电场装置进行提取、过滤，滤液经碱溶、酸沉处理后，离心分离出黄酮类成分，上清液调至中性，经回收溶剂后浓缩，真空干燥得浸膏。
1.2.2 含量测定
1.2.2.1 橘皮总黄酮的测定
参照文献[17]的方法采用NaNO2·Al（NO3）3·NaOH显色测定法，以芦丁为对照品，试剂空白为参比，在510 nm波长处测定吸光度，计算橘皮总黄酮的含量，并按下式计算总黄酮得率。
1.2.2.2 橘皮色素的测定
精密取离心分总离黄酮后的上清液2.0 mL于100 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，以提取溶剂空白为参比，在430 nm波长处测定吸光度，以吸光度表示橘皮色素得率，吸光度越大，色素得率越高[18]。
1.2.2.3 浸膏得率的测定
离心分离总黄酮后的浓缩液置于干燥至恒重的蒸发皿中，于电热真空干燥箱中干燥至恒重，干燥器内冷却30 min后精密称定质量，计算浸膏得率[19]。
浸膏得率/%=（浸膏质量/橘皮料质量）×100
1.2.3 综合评分的确定与计算
采用橘皮总黄酮、色素和浸膏得率3个指标的综合评分法，考虑橘皮中各指标成分的丰度及其对橘皮色素分离的影响，分别赋予总黄酮、橘皮色素和浸膏得率三者50%、35%和15%的权重，按下式计算提取的综合评分[20]。
综合评分=（50%×总黄酮得率/总黄酮得率最大值+35%×橘皮色素吸光度值/橘皮色素吸光度最大值+15%×浸膏得率/浸膏得率最大值）×100。
1.2.4 Box-Behnken响应面优化试验
前期针对乙醇浓度、液料比、电场强度和脉冲数4个单因素对高压脉冲电场提取橘皮中有效成分综合评分的影响进行了考察试验，综合成本和效益因素，确定了乙醇浓度控制 50%～70%、液料比 25∶1（mL/g）～35:1（mL/g）、电场强度 12 kV/cm～18 kV/cm、脉冲数 8个～12个之间的合适水平。在此基础上，选取乙醇浓度、液料比、电场强度和脉冲数4个因素，以综合评分为响应值，设计响应面分析试验，试验因素水平见表1。
表1 响应面分析因素水平设计
Table 1 The factors and levels of response surface analysis
水平因素A乙醇浓度/%B液料比/（mL/g）C电场强度/（kV/cm） D脉冲数-1 50 25∶1 12 8 0 60 30∶1 15 10 1 70 35∶1 18 12
1.3 数据处理
采用Design-Expert.8.0软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 响应面法试验结果分析
2.1.1 响应面试验结果及分析
运用Box-Behnken进行试验设计，提取工艺的响应面试验设计及试验结果见表2，对回归模型及系数进行的显著性检验结果见表3。
表2 响应面试验设计及结果
Table 2 Experiment plan and result of response surface method
试验号 A B C D 总黄酮得率/%综合评分1 0 0 0 0 2.27 0.977 5.94 87.18 2 1 1 0 0 1.89 0.845 6.59 73.68 3 1 0 0 -1 1.82 0.926 5.36 72.32 4 1 0 -1 0 1.59 0.827 4.93 64.16 5 -1 1 0 0 2.01 0.963 6.71 79.64 6 -1 0 -1 0 1.38 0.902 5.08 62.42 7 0 0 0 0 2.31 0.975 6.01 84.61 8 0 0 -1 1 1.64 0.927 5.35 68.78 9 0 -1 0 -1 1.52 0.881 5.56 65.48 10 -1 -1 0 0 1.71 0.915 6.31 71.60 11 0 0 0 0 2.25 0.975 5.97 83.35橘黄素吸光度浸膏得率/%
续表2 响应面试验设计及结果
Continue table 2 Experiment plan and result of response surface method
试验号 A B C D 总黄酮得率/%综合评分12 0 0 0 0 2.33 0.978 5.99 85.06 13 1 0 0 1 2.11 1.187 7.43 89.34 14 0 1 -1 0 1.49 0.784 5.23 61.51 15 0 -1 0 1 1.94 1.074 7.04 82.04 16 1 -1 0 0 1.78 0.769 5.71 67.71 17 0 1 0 -1 1.66 0.897 5.63 68.84 18 -1 0 0 -1 1.79 1.005 5.42 74.09 19 -1 0 1 0 1.85 1.157 8.07 84.54 20 0 0 1 -1 1.67 1.006 7.01 74.71 21 0 1 0 1 2.02 1.106 7.25 84.92 22 0 0 0 0 2.28 0.976 5.98 83.99 23 1 0 1 0 1.84 1.102 7.74 82.16 24 -1 0 0 1 1.83 1.228 7.92 85.89 25 0 1 1 0 2.01 0.994 7.88 82.70 26 0 -1 -1 0 1.55 0.754 4.69 60.84 27 0 0 1 1 1.94 1.185 8.34 87.62 28 0 0 -1 -1 1.27 0.746 4.57 54.86 29 0 -1 1 0 1.73 0.967 6.89 74.56橘黄素吸光度浸膏得率/%
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression equation
注：** 表示差异极显著，P＜0.01。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 2 556.8 14 182.63 33.27 ＜0.000 1 **A 6.47 1 6.47 1.18 0.296 B 70.42 1 70.42 12.83 0.003 **C 1 077.53 1 1 077.53 196.28 ＜0.000 1 **D 649.39 1 649.39 118.29 ＜0.000 1 **AB 1.07 1 1.07 0.19 0.666 2 AC 4.23 1 4.23 0.77 0.395 AD 6.82 1 6.82 1.24 0.283 7 BC 13.95 1 13.95 2.54 0.133 2 BD 0.055 1 0.055 0.010 0.921 6 CD 0.26 1 0.26 0.047 0.832 3 A2 54.85 1 54.85 9.99 0.006 9 **B2 332.76 1 332.76 60.62 ＜0.000 1 **C2 525.15 1 525.15 95.66 ＜0.000 1 **D2 48.83 1 48.83 8.89 0.009 9 **残差 76.85 14 5.49失拟项 68.33 10 6.83 3.2 0.136 5纯误差 8.53 4 2.13总误差 2 633.65 28 R2 0.970 8 R2Adj 0.941 6
通过Design-Expert软件对表2的响应面试验数据进行多元回归和二项式分析，得到编码自变量A乙醇浓度、B液料比、C电场强度、D脉冲数对响应值Y综合评分的回归拟合方程为Y=84.84-0.73A+2.42B+9.48C+7.36D-0.52AB-1.03AC+1.31AD+1.87BC-0.12BD-0.25CD-2.91A2-7.16B2-9.00C2-2.74D2。
表3的方差分析结果表明，以综合评分为响应值时，所建模型高度显著（P＜0.000 1），说明模型与真实试验拟合度良好；二次多元回归方程失拟项不显著（P＞0.05），表明误差小；响应值与自变量之间的相关系数R2=0.970 8，校正系数R2Adj=0.941 6，进一步表明数学模型与真实试验结果拟合度高。因此，拟合的模型对于高压脉冲电场提取橘皮中总黄酮和橘皮色素工艺的分析和预测是完全适用的。
由表3中P值的大小可以看出，一次项B液料比、C电场强度、D脉冲数对综合评分的影响极为显著（P＜0.01）；二次项 A2、B2、C2、D2的影响均达到极显著水平（P＜0.01）；各因素的交互作用对综合评分的影响均表现出不显著（P＞0.05）。各因素对综合评分的影响程度依次为C电场强度＞D脉冲数＞B液料比＞A乙醇浓度。
2.1.2 各因素的交互作用分析
运用Design-Expert软件绘制三维响应曲面，见图1。
图1 两因素的交互作用对综合评分的响应面图
Fig.1 Response surface plot showing the effect of operating parameters on comprehensive scoring
由图1（A）可知，当乙醇浓度恒定时，综合得分随液料比的增大呈现先增大后减小的趋势。由图1（B）和图1（C）可以看出，当乙醇浓度不变时，综合得分随电场强度及脉冲数的增大呈现快速上升，而后保持相对稳定；但在其他因素不变时，乙醇浓度的改变对综合评分的影响不显著，表明乙醇浓度不是显著性影响因素。图1（D）表明，当液料比不变时，综合得分随电场强度的增大呈现先增加后降低的趋势；固定电场强度不变，综合得分亦随着液料比的增大先升后降，且变化明显。由图1（F）可知，相对于液料比，脉冲数的影响更为显著。图1（E）表明，电场强度和脉冲数对综合得分的影响都极为显著。图1中各响应面的形状均开口向下、中心区域凸起且都具有最大值，说明各组中的两因素交互作用对综合得分均有影响，但因各图中两因素的等高线均呈圆形，说明各组中两因素的交互作用对综合得分影响不显著[20]，这与方差分析结果一致。
2.2 最佳工艺响应面优化与验证
利用Design-Expert软件，根据回归方程分析得出总黄酮、色素提取的最优工艺为乙醇浓度59.81%、液料比 31.16∶1（mL/g），电场强度 16.61 kV/cm，脉冲数12个，理论综合得分可达到92.19。考虑到实际操作的方便及可行性，将理论最佳工艺调整为乙醇浓度60%、液料比 31∶1（mL/g）、电场强度 17 kV/cm、脉冲数12个，并在此条件下进行3次平行验证试验，最终得到提取工艺的平均综合评分为90.86分，与理论值非常接近，相对误差为1.44%，说明响应面法优化所得到的高压脉冲电场提取橘皮中总黄酮和色素的工艺准确、可靠。
3 结论与讨论
高压脉冲电场作为一种非热提取技术，具有高效、快速、能耗低、对热敏性成分破坏少等优点[21]，已逐步应用于天然活性成分的提取[22]。本试验在单因素试验的基础上，借助响应面试验设计所建立的高压脉冲电场提取橘皮中总黄酮和色素的数学模型拟合度良好，通过对回归模型分析优化和验证，确定了高压脉冲电场提取橘皮中总黄酮和色素的最佳工艺参数为乙醇浓度 60%、液料比 31∶1（mL/g）、电场强度 17 kV/cm、脉冲数12个，在此提取条件下的总黄酮得率为2.18%、橘皮色素吸光度值为1.103、浸膏得率为7.03%，综合评分达到90.86分。结果表明，该方法工艺稳定、可靠，为柑橘皮资源的综合开发利用提供了新的技术参考。
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