柿叶为柿树科柿树属植物柿（Diospyros kaki L.f.）的新鲜或干燥叶[1]。我国柿树有50多种[2]，是世界上最主要的柿树生产国。柿叶资源丰富，具有较高的营养价值和医疗保健作用，因此引起了学者的广泛关注，国内外对柿叶的化学成分和功效作用做了大量研究。柿叶中含有丰富的维生素C、有机酸、多种氨基酸和微量元素等营养成分，以及黄酮类化合物、三萜类化合物、香豆素类、植物甾醇类等功效成分[3-7]。研究表明，柿叶具有抗菌消炎、生津止渴、润肺强心、镇咳止血等功效[8-10]。随着提取分离技术的发展，在柿叶中，发现了多种黄酮类化合物[11]。在柿叶多种活性物质的开发中，含量较高、最具研究价值的是黄酮类物质[12]。柿叶黄酮有抗过敏、抗氧化、抗炎、抑菌、抗肿瘤、降血压、降血脂、保肝和增强免疫力等多种作用[13-16]。目前，以柿叶原叶为原料开发出柿叶饮料[17]、柿叶晶[18]、柿叶茶[19-20]、柿叶蛋糕[21]等，尚未见以柿叶功效成分提取物为原料制备口服片剂的相关报道。
本研究采用超声微波协同萃取法提取柿叶中的活性成分，并以柿叶提取物为原料，制成片剂产品，提高产品中活性成分的含量，为消费者提供一种方便、快捷的功能性食品，且提高柿叶利用率，减少资源的浪费。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜柿叶：天津蓟州区；芦丁标准品：中国食品药品检定研究院；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；β-环糊精、柠檬酸、甘露醇、淀粉（均为食品级）：上海申光食用化学品有限公司；交联聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、食用酒精（均为食品级）：天津市博迪化工有限公司。
1.2 仪器与设备
CW-2000微波-超声协同萃取仪：上海新拓分析仪器科技有限公司；UV1000紫外可见分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；RE-1001VH旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；BSA 124S精密电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DZ-2BE真空干燥箱：天津泰斯特仪器有限公司；FW-4A粉末压片机：天津市拓普仪器有限公司；YD-35片剂硬度仪、FT-2000AE脆碎度检查仪、ZB-1E智能崩解仪：天津市天大天发科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 柿叶提取物片剂制备工艺
新鲜柿叶→清洗→干燥→粉碎→过筛→柿叶粉→微波-超声协同萃取→提取物→浓缩→干燥→粉碎过筛→柿叶黄酮干粉+辅料（填充剂、崩解剂等）→混合均匀→制软材→造粒→干燥+辅料（润滑剂）→压片→成品→灭菌→粗包装
1.3.2 柿叶黄酮的提取及干粉制备
干燥柿叶粉与70%食用酒精以固液比1∶45(g/mL)混合，置于微波-超声协同萃取仪，在功率700 W、温度45℃的条件下，提取25 min。在60℃下，用旋转蒸发仪将提取液蒸发浓缩，浓缩液于真空干燥箱中干燥15 h后，粉碎过100目标准筛，即得到柿叶黄酮干粉。
1.3.3 黄酮含量测定
黄酮含量测定采用芦丁标准曲线法[22]。
1.3.4 柿叶黄酮口服片制备
1.3.4.1 制软材与造粒
将主料柿叶黄酮干粉及辅料β-环糊精、交联聚乙烯吡咯烷酮、甘露醇、柠檬酸、淀粉过100目筛。将辅料依次加入主料中，混合均匀，边加辅料边用食用酒精作为润湿剂，不断搅拌，使其润湿均匀，调整物料湿度，制成手捏成团、轻压则散的软材。将制好的软材过20目标准筛，制得湿颗粒。
1.3.4.2 干燥
制好的湿颗粒均匀平铺于托盘中，颗粒层厚度2 cm～3 cm，55℃干燥1 h，每隔15 min翻动一次，以加快干燥速度并保证干燥均匀，至含水量3%以下即可。
1.3.4.3 压片、灭菌、包装
将干燥后颗粒再次过筛、整粒，混入一定量的润滑剂硬脂酸镁，放入压片机进行压片。将压好的片剂于紫外灯下照射15 min，包装得到成品。
1.3.5 感官评价
由15位感官评审员组成评定小组，根据评分标准（表1），分别对柿叶黄酮口服片的色泽、组织形态、口感、风味进行综合评分，采用轻松感官分析系统5.0进行统计分析。感官评价标准见表1。
表1 感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation criteria
项目 评分标准 评分色泽 淡褐色，有光泽，色泽均匀，无杂色点 17～20淡褐色，较有光泽，色泽较均匀，有杂色点 13～16淡褐色，无光泽，色泽不均匀，略有花斑 9～12褐色，无光泽，色泽不均匀，有严重花斑 4～8组织形态 形态完整，表面光滑，断面组织细腻紧密 17～20形态基本完整，表面欠光滑，断面组织较紧密 13～16形态略不完整，稍有碎裂，表面略粗糙，断面组织不够紧密9～12形态不完整，有碎裂，表面粗糙，断面组织松软 4～8口感 入口顺滑，细腻，无糊口，无粉粒感 26～30稍显粗糙，稍显糊口，稍有粉粒感 21～25较粗糙，较糊口，较有粉粒感 16～20粗糙，糊口，较重粉粒感 11～15风味 无苦味，酸甜协调，甜味适中 26～30稍有苦味，或酸甜较协调，甜味或酸味略浓或略淡 21～25有苦味，或酸甜基本协调，甜味或酸味较浓或较淡 16～20有苦味，或酸甜不协调，甜味或酸味过浓或过淡 11～15
1.3.6 柿叶黄酮口服片配方优化
经预试验筛选β-环糊精、淀粉作为片剂填充剂，交联聚乙烯吡咯烷酮作为崩解剂，硬脂酸镁作为润滑剂。因柿叶黄酮提取物有苦涩味，因此添加甘露醇和柠檬酸作为矫味剂。
为提高口服片的感官品质，通过单因素试验，考察主辅料添加量对口服片感官品质的影响。固定β-环糊精、甘露醇、柠檬酸、交联聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁的添加量分别为9%、20%、3%、7%、1.5%，补充淀粉，考察分别添加15%、20%、25%、30%、35%柿叶黄酮干粉对片剂感官品质和黄酮含量的影响。固定主料及其它辅料添加量，考察分别添加6%、9%、12%、15%、18%的 β-环糊精，10%、15%、20%、25%、30%的甘露醇，1%、2%、3%、4%、5%的柠檬酸，0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的硬脂酸镁，对片剂感官品质的影响。在单因素试验基础上，设计正交试验，优化片剂的配方。
1.3.7 柿叶黄酮口服片质量分析
参照2020版药典[23]，分别对提取物片剂进行片重差异、硬度、脆碎度、崩解时限的检测。
2 结果与分析
2.1 柿叶提取物中的黄酮含量
采用超声微波协同萃取技术提取柿叶中黄酮类物质，绘制芦丁标准曲线，得到曲线方程为y=16.87x+0.000 4（R2=0.999 7），通过计算，得到柿叶中黄酮类物质的提取率为7.95%。
2.2 柿叶黄酮口服片配方优化
2.2.1 主辅料添加量对柿叶黄酮口服片感官品质的影响
2.2.1.1 柿叶黄酮干粉添加量的考察
柿叶黄酮干粉添加量对片剂中黄酮含量及感官品质的影响见图1。
图1 柿叶黄酮干粉添加量对片剂中黄酮含量及感官品质的影响
Fig.1 Effects of supplemental amount of flavonoids in persimmon leaves on flavonoids content and sensory quality of tablets
由图1可以看出，随着柿叶黄酮干粉添加量的增加，片剂中功效成分黄酮类物质的含量随之增加。但由于柿叶黄酮提取物呈苦涩味道，是片剂口感、风味的主要影响因素。当柿叶黄酮干粉添加量为25%及以上时，片剂苦涩味加重，风味不好；当添加量增加到35%，片剂颜色略有加深。结合感官评分得出，柿叶黄酮干粉的最佳添加量为20%。
2.2.1.2 β-环糊精添加量的考察
β-环糊精添加量对片剂感官品质的影响见图2。
图2 β-环糊精添加量对片剂感官品质的影响
Fig.2 Effect of β-cyclodextrin supplemental amount on the sensory quality of tablets
由图2可以看出，当β-环糊精的添加量大于9%时，感官评分随着β-环糊精的添加量增加而降低。β-环糊精对片剂的外观和口感影响很大，因其具有包埋作用，减少了苦涩味，使口感变好。由于β-环糊精具有很强的黏合性，当添加量大于9%时，片剂表面出现麻点，并影响片剂的崩解与溶出速度，且添加量过多时，会使片剂有较重的糊口味，粉粒感增强，降低了片剂的感官品质。由此得出，β-环糊精的添加量为9%较适宜。
2.2.1.3 甘露醇添加量的考察
甘露醇添加量对片剂感官品质的影响见图3。
图3 甘露醇添加量对片剂感官品质的影响
Fig.3 Effect of mannitol supplemental amount on the sensory quality of tablet
由图3可以看出，当甘露醇添加量为20%时，感官评分最高，甘露醇具有一定甜味，在口腔中溶解产生凉爽感，削弱苦涩味，并且在口中无砂砾感，口感和风味好，但当甘露醇的添加量大于20%时，片剂甜味过重，酸甜不协调，使得片剂风味不好。由此得出甘露醇的添加量为20%较适宜。
2.2.1.4 柠檬酸添加量的考察
柠檬酸添加量对片剂感官品质的影响，结果见图4。
图4 柠檬酸添加量对片剂感官品质的影响
Fig.4 Effect of citric acid supplemental amount on the sensory quality of tablet
由图4可以看出，当柠檬酸添加量达到3%时，感官评分最高，柠檬酸主要对片剂的风味有影响，适量添加可以使口服片呈现酸甜味，但添加量过多会使片剂过酸、过涩，从而降低感官品质。由此得出柠檬酸的添加量为3%时较适宜。
2.2.1.5 硬脂酸镁添加量的考察
硬脂酸镁添加量对片剂感官品质的影响见图5。
图5 硬脂酸镁添加量对片剂感官品质的影响
Fig.5 Effect of magnesium stearate supplemental amount on the sensory quality of tablet
由图5可以看出，当硬脂酸镁的添加量为1.5%时，感官评分最高，硬脂酸镁可以增加物料的流动性，使颗粒混合均匀，减少物料对压片机的黏合，使片剂表面完整光洁。如果其添加量过少，会使颗粒粘在压片机上，导致片剂形态不完整，添加量过多，影响片剂口感。由此得出硬脂酸镁的添加量为1.5%时较适宜。
2.2.2 正交试验优化配方
在单因素试验基础上，以β-环糊精添加量、甘露醇添加量、硬脂酸镁添加量、柠檬酸添加量为考察因素进行四因素三水平L9（34）正交试验，优化柿叶黄酮口服片的配方，得到更优的感官品质。因素水平见表2，正交试验结果见表3。
表2 正交试验因素水平
Table 2 Orthogonal factors and levels
水平D柠檬酸添加量/%1 6 15 1.0 2因素A β-环糊精添加量/%B甘露醇添加量/%C硬脂酸镁添加量/%2 20 1.5 3 3 12 25 2.0 4 9
表3 正交试验结果
Table 3 Results of orthogonal test
试验号 A β-环糊精添加量B甘露醇添加量C硬脂酸镁添加量D柠檬酸添加量 评分1 1 1 1 1 85.3 2 1 2 2 2 93.7 3 1 3 3 3 80.3 4 2 1 2 3 82.7 5 2 2 3 1 80.7 6 2 3 1 2 81.3 7 3 1 3 2 88.0 8 3 2 1 3 86.0 9 3 3 2 1 75.7 K1 259.3 256.0 252.6 241.7 K2 244.7 260.4 252.1 263.0 K3 249.7 237.3 249.0 249.0 k1 86.43 85.33 84.20 80.57 k2 81.57 86.80 84.03 87.67 k3 83.23 79.10 83.00 83.00 R 4.86 7.70 1.20 7.10因素主次 B＞D＞A＞C最优方案 B2D2A1C1
由表3可知，4个因素对柿叶提取物片剂感官评分影响的主次顺序为：B＞D＞A＞C，即甘露醇添加量＞柠檬酸添加量＞β-环糊精添加量＞硬脂酸镁添加量，其最优水平为A1B2C1D2，即β-环糊精添加量6%、甘露醇添加量20%，硬脂酸镁添加量1.0%，柠檬酸添加量3%。
对表3中各因素的R值进行比较可得，C因素对柿叶提取物片剂感官评分影响较小，因此，以该因素作为方差分析空白列，对正交试验结果进行方差分析，结果见表4。
表4 正交试验方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal
注：*表示差异显著（P＜0.05）。
因素 偏差平方和 自由度 F F临界值 显著性A 36.702 2 14.472 19.000 B 100.296 2 39.549 19.000 *C 2.536 2 1.000 19.000 D 78.109 2 30.800 19.000 *误差 2.54 2
由方差分析表4可知，B、D因素对柿叶提取物片剂的感官品质有显著的影响，A、C因素对柿叶提取物片剂的感官品质无显著的影响。
2.2.3 验证试验
按照最优工艺方案，添加20%柿叶黄酮干粉、6%β-环糊精、20%甘露醇、3%柠檬酸、7%交联聚乙烯吡咯烷酮、1.0%硬脂酸镁、淀粉填充，制备3批次柿叶黄酮口服片，3次感官评分的平均值为96.5，高于正交试验中的第2组结果，相对标准偏差为0.68%。说明该工艺条件制备的片剂感官品质好，而且稳定性较高。每批次取6片成品，测定黄酮含量，平均黄酮含量为3.13%，相对标准偏差0.92%。
2.3 产品质量分析
2.3.1 片重差异分析
取20片成品，测定成品平均片重为0.697 1 g，所测成品的片重差异在±2.73%以内，小于药典规定的±5%，表明质量合格，工艺稳定。
2.3.2 硬度分析
取5片成品，测定硬度。平均值为30.3 N，相对标准偏差为0.98%，成品的硬度较高，差异较小。平均径向直径为13.11 mm。
2.3.3 脆碎度分析
取10片成品，测定成品脆碎度，测定前样品总重6.990 8 g，测定之后样品总重6.984 3 g，质量减少0.65%，小于药典规定的1%，无断裂、龟裂现象，质量合格。
2.3.4 崩解时限分析
取6片成品，测定成品崩解时限，平均崩解时限为13.4 min，各片均能在15 min内崩解，符合国家药典规定。
3 结论
以柿叶黄酮提取物为主要原料，感官品质为评价指标，确定柿叶黄酮口服片的制备工艺和最优配方，即20%柿叶黄酮干粉、6%β-环糊精、20%甘露醇、3%柠檬酸、7%交联聚乙烯吡咯烷酮、1.0%硬脂酸镁、淀粉填充。在此配方下制得的成品色泽均匀、表面光滑、组织形态好、口感佳、酸甜协调、感官品质高，并且成品中黄酮含量高达3.13%。
对片剂成品进行质量分析，成品的平均片重为0.6971g，平均硬度为30.3N，平均径向直径为13.11mm，脆碎度良好，均能在15 min内崩解。片剂产品具有剂量准确、体积小、质量稳定、携带、服用方便等优势。
利用蓟州区得天独厚的柿叶资源，以柿叶中活性成分黄酮类提取物为原料，对柿叶黄酮片剂制备工艺及配方开展研究，为新型功能食品的研发、新生产工艺的建立提供一定基础性依据。
[1] 国家中医药管理局.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社,1999.State Administration of Traditional Chinese Medicine.Chinese materia medica[M].Shanghai:Shanghai Science and Technology Press,1999
[2] 周鑫堂,王丽莉,韩璐,等.柿叶化学成分和药理作用研究进展[J].中草药,2014,45(21):3195-3203.ZHOU Xintang,WANG Lili,HAN Lu,et al.Research progress on chemical constituents and pharmacological effects of Diospyros kaki leaves[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs,2014,45(21):3195-3203.
[3] 李羽晗,王欣,石继祥,等.柿叶的化学成分研究[J].华西药学杂志,2018,33(4):388-392.LI Yuhan,WANG Xin,SHI Jixiang,et al.Study on the chemical components of the leaves of Diospyros kaki[J].West China Journal of Pharmaceutical Sciences,2018,33(4):388-392.
[4] 乔金为,黄顺旺,宋少江,等.柿叶化学成分研究[J].中药材,2016,39(11):2513-2517.QIAO Jinwei,HUANG Shunwang,SONG Shaojiang,et al.Study on chemical constituents of the leaves of Diospyros kaki[J].Journal of Chinese Medicinal Materials,2016,39(11):2513-2517.
[5] 傅建敏,梁晋军,周道顺.柿叶有效成分研究综述[J].中南林业科技大学学报,2013,33(11):66-72.FU Jianmin,LIANG Jinjun,ZHOU Daoshun.Review on effective constituents of persimmon leaves[J].Journal of Central South University of Forestry&Technology,2013,33(11):66-72.
[6] HONG I K,PARK B R,JEON G S,et al.Extraction of flavonoid components from persimmon leaf,thistle and new green[J].Applied Chemistry for Engineering,2016,27(3):276-279.
[7]CUI C,BIN L,LIN H,et al.Chemical composition and antimicrobial activities of persimmon(Diospyros kaki)leaf extracts[J].Allelopathy Journal,2017,41(1):141-152.
[8]HOSSAIN A,MOON H K,KIM J K.Antioxidant properties of Korean major persimmon(Diospyros kaki)leaves[J].Food Science and Biotechnology,2018,27(1):177-184.
[9] XIE C Y,XIE Z S,XU X J,et al.Persimmon(Diospyros kaki L.)leaves:a review on traditional uses,phytochemistry and pharmacological properties[J].Journal of Ethnopharmacology,2015,163:229-240.
[10]彭孟凡,刘保松,苗明三.柿叶现代医疗应用探讨[J].中南药学,2018,16(3):373-376.PENG Mengfan,LIU Baosong,MIAO Mingsan.Modern medical ap－plication of persimmon leaves[J].Central South Pharmacy,2018,16(3):373-376.
[11]LIU L,LIU R L,ZHANG J,et al.Study on the PEG-based microwave-assisted extraction of flavonoid compounds from persimmon leaves[J].Journal of Separation Science,2012,35(23):3412-3420.
[12]林国荣,罗素丽.柿叶总黄酮的分离及对油脂抗氧化的研究[J].中国粮油学报,2015,30(3):62-65,79.LIN Guorong,LUO Suli.Separation and antioxidation efficacy of persimmon leaf flavonoid[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2015,30(3):62-65,79.
[13]马新博,宫汝飞.柿叶黄酮药理作用研究进展[J].中医药学报,2012,40(4):130-132.MA Xinbo,GONG Rufei.Research progress on pharmacological effects of flavonoids from persimmon leaves[J].Acta Chinese Medicine and Pharmacology,2012,40(4):130-132.
[14]袁秀平,王云云.柿叶黄酮的药理作用及在药剂中的应用现状[J].科技视界,2018(36):80-81.YUAN Xiuping,WANG Yunyun.Pharmacological effects of flavonoids in persimmon leaves and their application in preparation[J].Science&Technology Vision,2018(36):80-81.
[15]CHEN L,MA X B,LIANG Y H,et al.Effects of persimmon leaf total flavonoid on enzyme of lipoprotein metabolism and antioxidation in hyperlipidemia rats[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2011,9(1):74-77.
[16]CHEN L,GUO Y H,ALSAIF G,et al.Total flavonoids isolated from Diospyros kaki L.f.leaves induced apoptosis and oxidative stress in human cancer cells[J].Anticancer Research,2020,40(9):5201-5210.
[17]林娇芬,林河通,陈绍军,等.柿叶的开发与利用[J].现代食品科技,2005,21(2):199-201.LIN Jiaofen,LIN Hetong,CHEN Shaojun,et al.The development and utilization of persimmon leaves[J].Modern Food Science and Technology,2005,21(2):199-201
[18]郑皓,鲁周民,刘月梅,等.柿叶的药理作用研究进展及开发利用现状[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2007,35(12):81-86.ZHENG Hao,LU Zhoumin,LIU Yuemei,et al.Review of medicinal function of persimmon leaves and their development and utilization[J].Journal of Northwest A&F University(Natural Science Edition),2007,35(12):81-86.
[19]杨恒,赵萍,刘裕慧,等.柿子资源开发利用现状[J].生物资源,2019,41(5):402-410.YANG Heng,ZHAO Ping,LIU Yuhui,et al.Current status of development and utilization of persimmon resources[J].Biotic Resources,2019,41(5):402-410.
[20]杨绍兰,范小红,张新富,等.柿叶复合茶的开发研究[J].食品研究与开发,2014,35(17):21-24.YANG Shaolan,FAN Xiaohong,ZHANG Xinfu,et al.Development and research of persimmon compound tea[J].Food Research and Development,2014,35(17):21-24.
[21]夏红,曹卫华,王珏伟,等.柿树资源综合利用——柿叶蛋糕的研制[J].食品科技,2005(2):12-14.XIA Hong,CAO Weihua,WANG Juewei,et al.Utilization of persimmon leaf in cake production[J].Food Science and Technology,2005(2):12-14.
[22]卢鑫,张琳.柿叶黄酮超声辅助提取工艺及其抗氧化性研究[J].食品研究与开发,2016,37(23):99-103.LU Xin,ZHANG Lin.Study on the extraction technology by ultrasonic assisted and antioxidant activity of total flavonoids from persimmon leaves[J].Food Research and Development,2016,37(23):99-103.
[23]国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部[M].北京:中国医药科技出版社,2020.Chinese Pharmacopoeia Commission.Chinese pharmacopoeia:Four divisions[M].Beijing:Chinese Medical Science and Technology Press,2020.