豆类种子在一定条件下浸水发芽形成豆芽，也称豆芽苗、芽菜等。豆芽具有良好的抗氧化能力，口感多汁清脆，深受广大消费者的喜爱。研究表明，绿豆种子发芽后其活性物质如酚类和黄酮类化合物的含量显著提高[1]。多酚类化合物具有良好的清除体内自由基、抗氧化以及抗癌等特性[2]，因此提高豆类发芽过程中多酚类化合物的含量，成为豆类科研领域中的一项热门研究。提高绿豆芽中总酚的含量的确会增加绿豆芽的营养价值和可食用价值，但是这些研究同样也会带来一些问题。例如，绿豆芽具有高含水量、低组织强度等特点，在贮藏过程中容易出现微生物污染、褐变以及失水皱缩等不良反应，因此本文将对褐变的机理、褐变对绿豆芽的影响以及绿豆芽防褐变技术的研究现状等进行分析和阐述，以期对绿豆芽防褐变技术的相关研究提供一定的理论参考。
1 绿豆芽概述
1.1 绿豆芽的营养价值
绿豆是一种富含淀粉、纤维素、蛋白质、钾、钙、锌、铁、镁、硒等多种营养素和黄酮类化合物的豆科植物[3]。绿豆具有生长周期短，适应能力强，播种次数多，抗逆性好等优点，在我国有几千年的栽培史，具有清热解毒，消暑利尿的功效[4]分。此外国内外许多研究发现，绿豆还具有抗肿瘤、保护肝脏、降血脂、降血糖以及抗氧化[5-6]的功能特性，而且这些功能特性都与绿豆中的多酚类化合物相关。
绿豆芽是绿豆在适宜条件下萌发而成的幼嫩芽苗菜，可食用部分主要是下胚轴。绿豆发芽后不仅外观会发生变化，其内部营养成分也会发生变化。绿豆发芽期间组织内的蛋白质、淀粉等大分子物质会降解形成氨基酸和多糖等易于吸收的小分子物质，同时多酚类化合物含量增多，并释放许多原绿豆中没有的新物质，如维生素C[7]等。萌芽后的绿豆显然比没有萌芽的绿豆更具营养价值，产生许多次生代谢产物[8]，功能性成分如多肽、酚类、左旋多巴、γ-氨基丁酸等的含量上升，长期食用绿豆芽具有清热除湿、防止冠心病、保护血管及皮肤、增强免疫力等功效[7-9]。此外，这些在萌芽过程中新产生、新合成的物质往往都具有更为显著的生物活性，因此不仅在食品领域中广受欢迎，而且在医学、制药、化妆品等领域也有广泛的应用。绿豆发芽前后5 d的主要营养成分对比见表1[10]。
表1 绿豆发芽前后营养成分对比
Table 1 Comparison of nutritional components of mung bean before and after germination
主要营养成分脂肪/（g/100 g）还原糖/（g/100 g）蛋白质/（g/100 g）维生素A/（μg/100 g）维生素C/（mg/100 g）异黄酮/（g/100 g）发芽前 0.99 0.68 25.01 25.48 0 0.29发芽5 d 0.81 0.58 40.21 45.04 6.01 0.75
1.2 绿豆芽的研究进展
随着人们生活水平提高和对营养健康食品的追求，绿豆芽及其加工产物因具有丰富的营养价值受到消费者的广泛关注。绿豆在浸水萌芽的过程中原有的胰蛋白抑制素、植酸、单宁等有害成分在酶的作用下被除去，更多的钙、磷、铁等矿物质被释放出来[1，11]，酚类化合物、维生素和纤维素类化合物含量显著升高[5]，使得绿豆芽具有更高的生物价值。目前已有多位学者对绿豆芽萌芽过程中产生的微量元素或者生物活性物质的富集进行研究，以增强绿豆芽的保健功能和利用价值。
CEVALLOS-CASALS等[12]对绿豆、蚕豆等13种可食种子在萌芽过程中多酚化合物含量及活性的变化进行分析研究，结果发现发芽后13种种子的活性物质及抗氧化活性均有提高。EBERT等[13]比较了多种改良品种的成熟绿豆谷物和其绿豆芽中的植物营养素水平，结果表明，与成熟绿豆谷物相比，发芽绿豆中维生素C的含量提高了2.7倍，异黄酮的含量和抗氧化性也有明显提升。AMITRANO等[14]在不同光照和湿度下培养绿豆芽，通过分析其抗氧化性、可溶性糖和淀粉含量，发现相对低的湿度和光照下会改善绿豆芽的水分传输并提升抗氧化性。Alkaltham等[15]研究了发芽和加热对绿豆的生物活性、酚类化合物和矿物质含量的影响，结果表明，热处理是改变绿豆芽中酚类含量的主要原因，短期微波加热处理的绿豆发芽后酚类化合物的含量会明显增加，抗氧化性活性较好，烘焙处理则会导致发芽绿豆中总黄酮含量和抗氧化性活性显著降低。Zhou等[16]在绿豆发芽的过程中添加外源亚精胺和二环己胺，增加了绿豆芽中总酚和抗坏血酸的含量，增强抗氧化系统，改善能量代谢，提高了绿豆芽的功能性。AMPOFO等[17]利用超声波辅助诱导豆类种子发芽，结果表明，超声波辅助诱导发芽会增加豆芽内部酚类物质含量和抗氧化能力，可以作为一种绿色的方法来生产富含酚类的有机营养豆芽。孟君等[18]以黄豆、绿豆为原料，通过单因素和正交试验考察黄豆和绿豆发芽过程中的富硒能力，试验表明，黄豆和绿豆在发芽过程中对不同浓度的硒元素都有一定的富集作用，且绿豆芽的富硒能力强于黄豆芽。史铀等[19]以豆芽为载体，通过豆类发芽的过程使无机铁、锌转换为有机铁、锌。在发芽之前通过控制培养基添加剂的方式形成高铁和高锌豆芽，使豆芽成为一种更容易被人们接受的铁源和锌源，为锌、铁微量元素缺乏症的治疗与预防提供新的治疗手段。
2 绿豆芽褐变研究进展
2.1 褐变概述
2.1.1 褐变机理
褐变现象从本质上可分为酶促褐变和非酶促褐变两种。酶促褐变是指在酶的作用下发生的褐变作用，主要发生在水果、蔬菜等新鲜植物性食物中。其发生机制是多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）在有氧条件下把酚类化合物氧化生成醌，醌类物质进一步聚合形成难溶的黑褐色高分子聚合物[20]，机理见图1[21]。此外，根据酶促褐变发生所需要的时间，又可以把酶促褐变分成立即型和延迟型[21]。立即型酶促褐变既是指如苹果制成苹果汁后会立刻生成褐色的现象，或者切碎的苹果在空气中放置数分钟内发生的褐变。与此相反，延迟型酶促褐变就是指需要几天甚至更长时间才会出现的褐变，比如生菜、豆芽等的褐变。
图1 酶促褐变的发生机理
Fig.1 Mechanism of enzymatic browning
非酶促褐变是指由于非酶作用引起的褐变，大多发生在食品的热加工及长期贮存过程中。非酶促褐变主要有3种类型，即羰氨反应褐变、焦糖化褐变和抗坏血酸氧化褐变。羰氨反应褐变又称美拉德反应，是指蛋白质、氨基酸的氨基与游离羰醛基反应，最终形成类黑素的过程；焦糖化褐变是指加热情况下没有氨基存在时糖发生的焦糖化反应；抗坏血酸氧化褐变是抗坏血酸自身氧化引起的褐变，酚类物质在一些条件下发生的自动氧化变色过程[22]。
2.1.2 褐变发生条件
从酶促褐变的机理中可看出酶促褐变必须具有3个条件，即有氧环境、PPO的作用以及存在酚类底物[23]。正常植物细胞中的酚类物质存在于细胞液泡中，PPO存在于类囊体内腔（包括叶绿体、有色体等）中，二者相互分离，如图2所示，所以完整的植物细胞不会发生酶促褐变[24-25]。只有当细胞膜结构受到损坏，酶原被氧气激活并与底物大面积接触时，才会引起褐变反应而且是立即型酶促褐变反应[21]。
图2 植物细胞中PPO与多酚物质的分布以及褐变反应的原因
Fig.2 The distribution of PPO and polyphenols in plant cells and the cause of browning reaction
非酶促褐变的褐变因子有总酚、抗坏血酸、5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）、游离还原糖以及氨基酸等，果蔬贮运、加工过程中的光照、氧环境、温度、湿度、包装容器以及不同的处理方式，都会对果蔬的非酶褐变产生不同程度的影响[26-27]。研究表明，新鲜果蔬贮藏前期的非酶促褐变主要是抗坏血酸氧化分解造成的，贮藏中后期，当抗坏血酸被大量消耗后，多酚物质的自氧化就会占据非酶褐变主要地位，同时美拉德反应缓慢进行，焦糖化反应对果蔬非酶促褐变没有显著影响[28]。
2.2 绿豆芽褐变机理
采后的绿豆芽依旧是有一定生命活动的有机体，其组织内部仍会进行一系列的生理代谢活动，比如呼吸作用[29]。此外，绿豆芽褐变、变质、腐烂等现象都与豆芽的贮藏温度有关[30]，随着贮藏温度升高，绿豆芽的呼吸速率不断增大。采后贮藏期间呼吸作用增强，会加速绿豆芽中营养物质的消耗，促进老化和变色。同时，绿豆芽褐变也与许多酶的活性密切相关，比如多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）以及过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等。此外，绿豆芽褐变还与绿豆芽中多酚、抗坏血酸（ascorbicacid，AA）以及过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）含量有很大关系[22]。研究表明绿豆芽在储藏过程中SOD的含量会降低，褐变（hard black，HB）发生率与AA、总抗氧化剂活性（total antioxidant activity，TAA）、总酚（total phenols，TP）、总黄酮（total flavonoids，TF）以及SOD之间呈负相关[31]。同时POD和PPO含量会升高，褐变发生率与PPO、POD以及CAT活性之间呈正相关。
2.3 褐变对绿豆芽的影响
绿豆芽含水量高达95%[32]，质地清脆，组织娇嫩，不耐贮藏，在采后保鲜、贮运、销售过程中，极易因温度影响出现老化褐变、失水皱缩以及微生物污染产生黏腐、变味等现象，这些现象会影响绿豆芽的营养价值，带来严重的经济损失，其中最易产生感官价值损失且最常见的生理生化反应就是褐变[33]。果蔬褐变主要是由多酚类物质通过氧化聚合反应引发的，是食品颜色随时间逐渐变为褐色或深褐色的一个过程。绿豆芽褐变主要是因为组织内部发生了酶促褐变和抗坏血酸氧化反应[34]，这些反应是绿豆芽贮藏期间最不希望出现的现象，不仅会影响绿豆芽的外观给消费者带来不良的视觉感受，还会产生有毒物质，导致绿豆芽品质下降，一旦误食很可能会影响误食者的身体健康，引起一系列的食品安全问题[32，35]。
3 防褐变技术的研究进展
褐变会对新鲜果蔬产生品质下降，贮藏期缩短等不良影响，如果没有良好的解决方法则会加速食品的变质和腐烂，防止褐变的方法本质上就是抑制褐变的发生条件。
3.1 酶促褐变的抑制方法
酶促褐变的速率取决于PPO的活性[36]，目前防止酶促褐变的研究方法比较完善，可以通过控制PPO的活性抑制酶促褐变的产生[37]。常用的方法可分为物理方法和化学方法，物理方法包括热处理法[38]、高压处理法[39]、电场处理法[33]、辐照法[40]、隔绝氧气法[35]和低温保藏法[41]等，化学方法有无机盐法[42]、酸化剂法[43]、抗氧化剂法[42]、螯合剂法[44]和天然提取物法[45]等。热水漂烫、微波处理或二者的结合、压力处理、脉冲电场处理或者辐照处理都可以迅速降低果蔬中多酚氧化酶的活性，从而降低褐变指数，减少抗氧化剂损失，达到较好的酶促褐变抑制效果。隔绝氧气和低温保藏限制了酶促褐变的反应条件和反应速率，能达到延长贮藏时间、减缓褐变速率的目的。其次，偏重亚硫酸钠、硫酸铵盐、SO2、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸以及 Ca2+、Mg2+等金属离子都是多酚氧化酶活性的抑制剂；低pH值环境下酚类氧化的速率会明显降低，天然含羧酸类的物质对酶也有抑制效应，使用这些化学试剂处理也可以有效减缓酶促褐变的发生。
3.2 非酶促褐变的抑制方法
非酶促褐变比酶促褐变更难控制，而且作用范围比酶促褐变更加广泛。非酶促褐变不仅可以和酶促褐变一同作用，甚至在酶钝化失活后，依旧可以保持较高的反应活性[46]。果蔬中含有丰富的多酚物质和抗坏血酸，由抗坏血酸氧化和多酚引起的非酶促褐变是影响果蔬品质的重要因素[27，47]，虽然非酶促褐变的研究没有酶促褐变成熟完善，但依然有许多相关的报道。总体来说，果蔬非酶促褐变的抑制方法与酶促褐变相似，也可以分成物理方法和化学方法，常用的物理方法有低温贮藏法[28]、避光干燥保存法[48]和蒸汽预处理法[49]等；化学方法有螯合剂法、抗氧化剂法和抑制剂法[46-47，50]等。此外，多项研究表明酸化剂法可以有效抑制PPO引起的酶促褐变，但是Pham等[51]发现pH值过低，即在pH1.5左右时，反而会显著提高抗坏血酸的降解率，提高5-羟甲基糠醛的形成速率，显著增加非酶促褐变强度，因此果蔬及其果蔬制品长时间保存时，不宜使用酸化剂法。
4 绿豆芽防褐变技术的研究进展
随着人们对食品安全的重视，绿豆芽的贮藏保鲜技术也越来越受大家关注，目前绿豆芽贮藏技术的研究重点大多还停留在延长豆芽的贮藏时间上，采用合理的保鲜技术和条件，豆芽可以保鲜1周～2周[32]，常用的保鲜技术有：预冷处理、全程微生物控制、全程冷链管理、改良包装方式、清洗沥干以及控制贮藏温度和湿度等。这些技术基本都可以延缓绿豆芽的腐烂和变质，但对于绿豆芽的褐变情况却没有深入研究，现在防止绿豆芽褐变的研究体系尚不完善，下面将对一些国内外防豆芽褐变的相关报导进行阐述见表2。
表2 豆芽防褐变技术的阐述
Table 2 Explaination of bean sprouts anti-browning technology
研究原料 处理方法 研究内容 研究结论 参考文献新鲜黄豆芽制品改良工艺法 改良豆芽系列产品加工过程的关键工序，对烫漂时间、护色剂组成和包装方式进行研究烫漂时间2.5 min时，豆芽变色程度较小。护色剂为柠檬酸10%+异抗坏血酸钠1.5%+乙二胺四乙酸二钠2%时，护色效果较好。以铝箔袋保存豆芽小菜，保色效果较好[52]新鲜绿豆芽下胚轴制成的豆芽罐头热处理法 研究绿豆芽加工产品的漂烫护色工艺对绿豆芽产品品质的影响95℃热水中添加2%的柠檬酸、0.15%的抗坏血酸、0.15%的L-半胱氨酸，烫漂1 min，对防止绿豆芽下胚轴褐变有较好的效果[53]新鲜绿豆芽 酸化剂法 研究抗坏血酸处理鲜绿豆芽对绿豆芽酶促褐变、酚类以及抗氧化能力的影响用浓度为2mmol/L和20mmol/L的抗坏血酸处理绿豆芽，其PPO活性降低，酶促褐变显著减少。在贮藏3d和7d时，用20mmol/L抗坏血酸处理的绿豆芽，总酚的含量会有所提高，增加了酚类化合物的潜在生物利用度，且通常对抗氧化能力没有影响。但是，用20 mmol/L抗坏血酸洗涤会使绿豆芽的还原电位明显提高，过高的抗坏血酸容易导致非酶褐变产生。总之，一定剂量的抗坏血酸处理可以提高绿豆芽的感官质量[54]
续表2 豆芽防褐变技术的阐述
Continue table 2 Explaination of bean sprouts anti-browning technology
研究原料 处理方法 研究内容 研究结论 参考文献新鲜绿豆芽 改良包装方式法研究豆芽包装对绿豆芽褐变和黏腐的影响，采用不同的温度、包装材料以及打孔数和充气包装，通过正交试验对豆芽的保鲜进行研究温度是影响豆芽贮藏期间褐变与黏腐产生的最主要原因，其次为打孔数和包装材料及气体组分。绿豆芽出现褐变的最迟条件是0℃、0.03 mm聚乙烯、0打孔，黏腐出现最迟条件是0℃、拉伸聚丙烯、0打孔；充气包装绿豆芽褐变和黏腐现象出现最迟的条件都是0 ℃、1%O2、15%CO2[55]新鲜绿豆芽 辐照法 利用紫外辐照的方法，研究低剂量的紫外线B（ultraviolet-B，UV-B）辐射对绿豆芽品质和保鲜效果的影响UV-B处理对绿豆芽褐变指数有显著影响，低剂量的UV-B能够抑制绿豆芽褐变指数，而高剂量的UV-B处理会增大褐变指数，豆芽前3 d生长期内每天用0.738 kJ/m2UV-B处理1 h，绿豆芽中多酚氧化酶的活性下降，下胚轴表面气孔封闭，能最大程度抑制绿豆芽失水率、微生物含量、褐变上升指数，延长绿豆芽存储期的同时也提高了绿豆芽中酚类物质的含量。为绿豆芽的储存找到一种低成本、环保且无污染的物理技术[56]新鲜绿豆芽 低温贮藏法 使用低温结合真空包装的方式对采后绿豆芽进行处理4℃条件下以相对真空度-0.04 MPa包装绿豆芽保鲜效果最佳，酚类物质、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性处于相对较低水平，细胞膜的完整性维持较好，可以抑制采后绿豆芽褐变的发生，同时单一因素处理发现4℃下贮藏对绿豆芽的保鲜效果比-0.04 MPa真空包装后于20℃贮藏的保鲜效果明显，说明温度对采后绿豆芽的影响更大[35]新鲜黄豆芽 控制微生物法研究温度环境、清洗剂处理、及充气气调小包装处理对黄豆芽主要污染微生物及品质的影响0℃贮藏会造成豆芽冻害，使其发生褐变。低温4℃处理时黄豆芽保鲜效果最佳，对黄豆芽中主要腐败微生物有明显的抑制作用，并可显著抑制黄豆芽在贮藏期间可溶性固形物含量、VC含量、感官品质的下降，减缓褐变程度。用质量分数为0.02%的次氯酸钠溶液清洗黄豆芽5 min，或用5%O2、10%CO2的气调条件对豆芽进行包装时也能较好地保持黄豆芽的可溶性固形物含量、VC含量、感官品质以及抑制黄豆芽褐变[57-58]斑豆 控制湿度法以及气调保藏法使用定量核磁共振法和超高效液相色谱高分辨率质谱法研究不同气调条件和相对湿度对斑豆褐变的影响气调条件O2浓度降低为1.5%，CO2浓度调至9%时，可以延长斑豆的货架期。40%相对湿度保藏时斑豆会显示出较低的色度值，说明变色情况不明显，低相对湿度可以有效地减缓斑豆的褐变现象[59]
5 结论和展望
绿豆芽褐变主要包括绿豆芽体内含有的多酚类物质和PPO引起的酶促褐变和部分多酚类物质和抗坏血酸导致的非酶促褐变，褐变的影响因素复杂，贮藏温度、湿度、光照强度、时间、气调比例、采后的预处理、运输方式、加工方法以及包装的方式等均能影响褐变，任意一种因素的不良改变都会对绿豆芽的褐变情况造成不一样的影响。在实际生产销售过程中不可能对这些因素达到完全控制，所以研究出最佳的豆芽防褐变处理技术对整个绿豆芽生产及加工都具有重要的意义和研究价值。采用化学抑制剂防止褐变的方法固然有效，但是会产生大量化学残留物，干扰因素多，实际大规模生产中难以控制和操作。物理防褐变的方法相比化学方法而言成本更低、没有多余残留物，绿色环保、更易于控制操作。但目前绿豆芽的防褐变技术没有更深入或更加系统的研究，绿豆芽的物理防褐变技术具有很大的研究空间，值得进一步深入探索。本文详细地介绍了绿豆芽褐变的原因、机理、影响因素，总结了相关的方法和技术，为之后的深入研究提供思路和理论依据。
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