酪蛋白酶解液是营养型食品添加剂，可用于提高调味品的鲜度和游离氨基氮的含量。其所含的酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）可作为功能性食品添加剂，是酪蛋白发生酶促水解后得到的一种含成簇磷酸丝氨酸基团的生物活性短肽[1-2]，它可以促进小肠对钙的吸收[3-4]，促进骨骼对钙的利用[5-6]，促进牙齿对钙的利用[7-8]，促进锌、硒、铁的吸收与利用[9-10]，还可增强精卵的结合率[11-12]、增强动物机体免疫力[13]以及具有细胞凋亡诱导作用[14-15]。关于磷酸肽/磷酸蛋白的分析鉴定，可以提供蛋白/肽的翻译后信息。目前最行之有效，并且被广泛采用的是分离富集结合质谱技术[16-20]。Miquel等采用阴离子交换高效液相色谱法从婴幼儿配方奶中富集磷酸肽，利用电喷雾液相色谱-串联质谱技术测定了CPPs与钙等金属离子的结合位点[21]。黄漩等采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析鉴定了骆驼乳和羊乳中的磷酸肽[22-23]。然而，和大多数蛋白一样，酪蛋白的磷酸化丰度小，酶解产物中磷酸化肽段的含量低[24]。与此同时，磷酸化肽的离子化效率也低，在进行质谱检测时，其信号会被高丰度的非磷酸化肽段的信号干扰和抑制[25]，甚至无法进行检测。所以在检测磷酸肽前，需将其从样品中选择性地分离富集出来[26-27]，对磷酸肽的分析更具有实际意义。
本研究采用溶胶-凝胶法合成了具有较高比表面积的多孔钛胶微球[28-29]，并考察了所制得的钛胶微球的选择性以及材料的稳定性，并用于分离富集酪蛋白酶解液中的磷酸肽，利用钛胶固定相的反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）技术，评价了多孔的钛胶微球对CPPs的分离富集效果。进一步利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）对酪蛋白酶解液中的肽类化合物结构进行了鉴定，对CPPs的分离富集以及结构鉴定提供了科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酪蛋白、胰蛋白酶（250 U/mg）：美国Sigma公司；甲醇（色谱纯）、碳酸氢铵（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；浓盐酸（分析纯）：天津化学试剂厂；氢氧化钠（分析纯）：天津化学试剂三厂；蒸馏水：广州屈臣氏食品饮料有限公司。
1.2 主要仪器
G6410A型液质联机、1200系列高效液相色谱仪：美国Agilent公司；Sachtopore-RP（250mm×4.6mm×5μm，30 nm）色谱柱：美国Zirchrom公司；JEOL场发射扫描电子显微镜：日本电子株式会社；F-Sorb 3400全自动比表面积及孔径测试仪：北京金埃谱科技有限公司；HSS-1B型恒温浴槽：成都仪器厂；80-1离心机：上海手术器械厂；FA1104N电子天平：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 酪蛋白酶解液的制备
参照文献的方法利用胰蛋白酶对酪蛋白进行水解[30]，制备酪蛋白的水解液。酶解结束后，沸水浴5 min杀酶，冷却至室温（25℃），3 000 r/min离心5 min，用0.45 μm微孔滤膜过滤上清液，滤液于4℃冰箱保存备用。
1.3.2 多孔钛胶微球的制备
参考文献[28-29]，采用溶胶-凝胶法结合均匀沉淀法制备多孔钛胶微球，并利用扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察材料表面状态、测量其粒径，采用氮气吸附脱附法测定其比表面积、累积孔体积、平均孔直径以及孔径分布。
1.3.3 酪蛋白酶解液中磷酸肽的富集
将适量的钛胶微球装入玻璃层析柱（1 cm×15 cm），先用0.1 mol/L NaOH溶液（50倍柱体积）以较小流速冲洗，再用水（20倍柱体积）洗至中性。然后用0.1mol/L HCl溶液（100倍柱体积）过柱，之后再用水（100倍柱体积）洗至中性。最后用甲醇（20倍柱体积）以较小流速过柱。
在酸性、室温（25℃）条件下保持较小流速（0.5 mL/min）进行酪蛋白酶解液上样，接流出液，然后用水（3倍～4倍柱体积）洗去未吸附的肽类及其它成分，最后用0.3 mol/L pH10.5氨水将结合在钛胶材料上的成分洗脱下来，接洗脱液，于4℃冰箱保存备用。
1.3.4 酪蛋白酶解液中磷酸肽的鉴定
对酪蛋白酶解液原液、流出液和洗脱液进行RPHPLC及LC-MS/MS分析。色谱条件：流动相A（20 mmol/L氟化铵）∶B（甲醇）体积比60∶40，等梯度洗脱；流速0.8 mL/min；进样量 5 μL；检测波长 220 nm；柱温 45℃。质谱条件：采用电喷雾负离子源，离子源电压3 500 V，辅助气流速8 L/min，离子源温度400℃。
2 结果与分析
2.1 多孔的钛胶微球材料的表征
图1为所合成的多孔钛胶微球的SEM图。
图1 钛胶微球材料的SEM图
Fig.1 SEM images of titania microsphere materials
由图1可以看出，所制得的钛胶微球材料颗粒圆润饱满，无塌陷碎裂现象，表面光滑平整，粒径均匀，SEM显示其平均粒径为6 μm。通过氮气吸附脱附法测得微球的比表面积为75.9 m2/g，平均孔直径为11.9 nm，累计孔体积为0.2 mL/g。
2.2 酪蛋白酶解液中磷酸肽富集效果的RP-HPLC分析
按照方法1.3.4的色谱条件进样分析，自制的钛胶微球材料对酪蛋白酶解液中磷酸肽富集前后的RPHPLC分析效果见图2。
图2 富集前后酪蛋白酶解液的RP-HPLC图
Fig.2 RP-HPLC profiles of casein hydrolysate monitored before and after enrichment
由图2可以看出，洗脱液在9 min后出现一个较明显的峰，而流出液中却没有出现此峰，这是含磷酸基团的磷酸蛋白/肽、磷脂、天门冬氨酸等在钛胶微球上的特异性选择吸附所致[31]。因此，此峰可初步推断为磷酸肽成分，在后续的LC-MS/MS分析中将确定此成分是否为磷酸肽及其是否能被自制的钛胶微球材料富集。
2.3 酪蛋白酶解液中磷酸肽的LC-MS/MS鉴定
利用LC-MS/MS技术分别对酪蛋白酶解液原液、经钛胶柱得到的流出液和洗脱液进行分析，所鉴定出的各物质的保留时间、碎片离子见表1。
表1 酪蛋白胰蛋白酶解液的主要成分
Table 1 Components of casein hydrolysate by trypsin
注：√代表存在；×代表不存在；*代表磷酸化位点。
序号 氨基酸序列 分子离子（M+）保留时间/min 质荷比（m/z） 水解液 流出液 洗脱液1 His-Pro-Ile-Lys 494.2 5.466 235.5，259.8 √ √ ×2 Glu-Val-Val-Arg 502.3 5.555 103.5，229.1，273.7 √ √ ×3 His-Ile-Gln-Lys 525.8 5.556 252.0，275.1，387.9 √ √ ×4 Leu-His-Ser-Met-Lys 615.9 5.561 252.3，277.8，339.0，365.2 √ √ ×5 Glu-Ala-Met-Ala-Pro-Lys 645.2 5.565 244.2，332.0，403.3，445.6 √ √ ×6 Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val 741.8 5.614 58.2，231.2，441.0，587.6 √ √ ×7 Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp 747.4 5.641 203.3，318.0，415.3，431.2 √ √ ×8 Glu-Met-Pro-Phe-Pro-Lys 748.0 5.646 260.2，357.9，390.7，488.4，505.2 √ √ ×9 Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg 830.0 5.646 130.1，245.1，303.7，344.2，586.5 √ √ √10 Pro 116.2 5.652 116.2 √ √ ×11 His 156.2 5.656 156.2 √ √ ×12 Ala 90.1 5.657 90.1 √ √ ×13 Val 118.2 5.662 118.2 √ √ ×14 Asp 134.1 7.427 134.1 √ × √15 Val-Asn-Glu-Leu-SerP*-Lys 769.2 7.523 214.0，314.1，342.7，555.9 × × √16 Thr-Val-Asp-Met-Glu-SerP*-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-Lys 1 466.2 7.63 101.9，248.2，316.0，493.5，575.7，743.2，890.6 × × √
由表1可以看出，酪蛋白酶解液的主要成分中1号～9号为非磷酸肽组分；10号～14号组分为氨基酸；15号和16号组分为磷酸肽组分。15号和16号组分的保留时间较其余成分有明显增大是因为它们与钛胶柱的作用较强，这与RP-HPLC分析的推断结果吻合（图2洗脱液中9 min后出现较明显的峰）。酪蛋白水解液经钛胶柱处理后，低丰度的磷酸肽Val-Asn-Glu-Leu-SerP*-Lys及Thr-Val-Asp-Met-Glu-SerP*-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-Lys被完全吸附到了钛胶微球表面，流出液中没有检测到它们的存在，说明利用钛胶微球材料富集磷酸肽是切实可行的。因此可证明磷酸肽确实可被钛胶微球材料富集，并且只在酪蛋白酶水解液的洗脱液中检出了这两种成分，而水解液和流出液中未检出，说明已经达到预期的富集效果。另外，非磷酸肽成分Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg和天门冬氨酸在洗脱液中被检出，这是因为Glu-Asp-Val-Pro-Ser-Glu-Arg的末端精氨酸残基以及天门冬氨酸也会被钛胶特异性吸附所致[14]。
从肽键中间断裂是多肽链3种断裂方式中最主要的1种，断裂之后-C端部分通常被称为b，而-N端部分被称为y。酪蛋白水解得到的多肽结构及其断裂方式如图3所示。
图3 多肽链断裂结构解析图
Fig.3 Fracture structure analysis of polypeptide chain
3 结论
酪蛋白的胰蛋白酶解液为5种游离氨基酸（Pro、His、Ala、Val、Asp）和 11 种多肽构成的混合物。其中Val-Asn-Glu-Leu-SerP*-Lys和Thr-Val-Asp-Met-Glu-SerP*-Thr-Glu-Val-Phe-Thr-Lys为磷酸肽。本研究所建立的方法可用于酪蛋白酶解液成分和低丰度的CPPs的分离富集及结构鉴定，提供了一种有效的方法，有望在蛋白质、磷酸蛋白、糖蛋白、磷脂、肽组学等研究领域发挥重要作用。
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