食源性疾病是全世界关心的重要公共卫生问题，志贺氏菌病占其中很大一部分[1]，它是由志贺氏菌引发的一种急性肠胃疾病[2]，临床特征包括发烧、腹部疼痛、中度到重度水样腹泻[3]。一旦治疗不及时，可能会导致肠道炎、脱水甚至死亡，严重危害身体健康，特别是儿童和免疫缺陷人群[4]。志贺氏菌主要存在于手工加工的蔬菜沙拉、鲜奶制品或煮熟后的肉制食品中[5]，常引起食物中毒。因此，志贺氏菌的检测在食品安全领域具有重要意义[6]，建立一种新的快速、灵敏、特异性高的检测方法，对于及时检出食品中的志贺氏菌至关重要。
志贺氏菌的检测方法大致分为三大类，即传统培养方法、免疫学方法和分子生物学方法[7]。传统培养方法以GB 4789.5—2012《食品安全国家标准食品微生物检验志贺氏菌检验》方法为主[8]，该方法是鉴定志贺氏菌的现行标准，检测准确度高且稳定。但是传统方法检测志贺氏菌操作繁琐，耗时费力且每次处理的样品数量很少，不能满足快速检测的需求。免疫学方法以酶联免疫吸附技术（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）[9]、胶体金免疫层析技术（immune colloidal gold technique，GICT）[10]较为常见。免疫学方法虽然大大缩短了检测时长[11]，但灵敏度较低[12]。分子检测技术主要包括聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[13]、环介导等温扩增方法（loop mediated isothermal amplification，LAMP）[14]、滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）[15]等。PCR 和实时荧光定量PCR检测技术与传统方法和免疫学方法相比，虽然有许多优点，但是其相对于等温扩增技术LAMP、RCA等扩增效率和灵敏度较低。LAMP和RCA技术可高效扩增DNA，但是LAMP需要4条～6条引物，这些引物的设计和反应体系复杂，引物之间易相互作用，产生非特异性结果，且无法通过对扩增产物测序，判断扩增结果的正确性。RCA技术扩增线性DNA则需要锁式探针和连接酶[16]，且需要探针环化，操作过程复杂，耗时长约4 h。
近年来，跨越式滚环等温扩增（saltatoryrollingcircle amplification，SRCA）技术被用于多种病原菌检测[17-20]，该方法克服了等温扩增技术的缺点，仅需要2条引物，在Bst DNA聚合酶的作用下，不需人为环化，即可实现线性DNA的扩增[21]。本研究以期在SRCA方法的基础上，根据志贺氏菌特异性基因ipaH设计筛选引物，建立一种高效、灵敏的实时荧光跨越式滚环等温扩增（real-time fluorescence saltatory rolling circle amplification，RF-SRCA）方法对志贺氏菌进行检测，以有效检出病原菌，保障食品安全和消费者健康。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验菌株
本研究采用32株菌进行RF-SRCA方法特异性检测，其中志贺氏菌13株，非志贺氏菌19株。菌株名称及其来源如表1所示。
表1 试验菌株
Table 1 The strains list in this study
序号 菌株名称 菌株编号1 褔氏志贺氏菌（Shigella flexneri） CMCC51107 2 褔氏志贺氏菌（Shigella flexneri） CICC51571 3 福氏志贺氏菌（Shigella flexneri） CICC21534 4 福氏志贺氏菌（Shigella flexneri） ATCC12022 5 福氏志贺氏菌（Shigella flexneri） LP S1 6鲍氏志贺氏菌（Shigella boydii） LP S3 7 痢疾志贺氏菌（Shigella dysentery） LP S5 8鲍氏志贺氏菌（Shigella boydii） CICC 21680 9鲍氏志贺氏菌（Shigella boydii） CMCC51522 10 宋内氏志贺氏菌（Shigella sonnei） CMCC51334 11 宋内氏志贺氏菌（Shigella sonnei） CICC21535 12 痢疾志贺氏菌（Shigella dysentery） CMCC51135 13 痢疾志贺氏菌（Shigella dysentery） CICC23829 14 沙门氏菌（Salmonella） LP No.1 15 沙门氏菌（Salmonella） LP No.2 16 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC25923 17 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） CICC21648 18 斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri） CICC21671 19 威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri） CICC21672 20 表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis） CICC23664 21 丙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi-C） CICC21512
续表1 试验菌株
Continue table 1 The strains list in this study
注：中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）；美国模式菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；中国医学细菌菌种保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collections，CMCC）；实验室保藏菌株（laboratory preserved，LP）。
序号 菌株名称 菌株编号22 火鸡沙门氏菌（Salmonella meleagridis） CICC21511 23 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium） CICC21484 24 鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium） CMCC50115 25 肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis） CMCC50041 26 阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii） ATCC21544 27 丙二酸盐克罗诺杆菌（Cronobacter malonaticus） CICC21551 28 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） ATCC25922 29 莫金斯克罗诺杆菌（Cronobacter muytjensii） CICC23943 30 都柏林克罗诺杆菌（Cronobacter dubliniensis） CICC21564 31 尤尼沃斯克罗诺杆菌（Cronobacter universalis） CICC 21570 32 小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）CMCC52302
1.1.2 样品与试剂
试验所用60种食品样品：当地各超市和农贸市场随机购买。
细菌DNA提取试剂盒：天根生化科技有限公司（北京）；RF-SRCA引物：北京华大基因有限公司；Eva－Green染料：安诺伦生物科技公司（北京）；Bst DNA聚合酶（large fragment）（8 000 U/mL）：美国 NEB 有限公司；Luria-Bertani液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（xylose lysine desoxycholate agar，XLD）琼脂：陆桥技术股份有限公司（北京）。
1.1.3 主要仪器设备
Archimed实时荧光定量PCR仪：鲲鹏基因科技公司（北京）；Nanodrop 2000蛋白质核酸分析仪：美国Thermo Scientific公司；BINDA2020D凝胶成像仪：北京宾达英创有限公司；DYY-8C型电泳仪：北京市六一仪器厂；DK-8D三孔电热恒温水槽：上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 引物的设计
在NCBI中选取同源性最高的志贺氏菌特异性基因ipaH的基因序列，利用Primer premier 6.0和DNAMAN进行引物的筛选与设计。引物由北京华大基因有限公司合成，引物信息如表2所示。
表2 RF-SRCA和SRCA方法的引物
Table 2 Primers of RF-SRCA and SRCA methods
引物名称 序列（5'-3'） 目的片段大小/bp 序列号ipaH基因引物F-GCCTTCTGATGCCTGATGGA 83 LC111504.1 R-CCACTGAGAGCTGTGAGGAC
1.2.2 菌株培养和DNA提取
将志贺氏菌菌株（ATCC12022）划线于XLD琼脂培养基中，37℃培养20 h～48 h，挑取单菌落接种于Luria-Bertani液体培养基中培养12 h，取1 mL菌液使用提取细菌DNA试剂盒进行DNA提取。使用Nanodrop 2000蛋白质核酸分析仪测定提取的DNA纯度和浓度。表1中其它菌株同上操作，提取的DNA于-20℃保存备用。另取1 mL志贺氏菌菌液用9 mL无菌生理盐水10倍梯度稀释，选取可计数范围内的3个稀释度菌液，每个稀释度3个平行，用平板计数的方法进行初始菌落计数。
1.2.3 反应体系与反应条件
RF-SRCA 的反应体系：dNTPs（2.5 mmol/L）添加量为 4.5 μL，Bst DNA 聚合酶添加量为 1.0 μL，Bst DNA聚合酶反应缓冲液添加量为2.5 μL，20×EvaGreen染料添加量为1.0μL，MgSO4（20mmol/L）添加量为2.0μL，正反向引物（10 μmol/L）添加量各为 1.0 μL，模板 DNA添加量为1.0 μL，无菌双蒸水补足体积到20 μL。阴性对照用无菌双蒸水代替模板DNA。
RF-SRCA的反应条件：首先将模板DNA在PCR仪中94℃预变性3 min，4℃冷却2 min。预变性后的模板与 dNTPs、MgSO4、10 × Thermo Pol Reaction Buffer、引物、Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水添加到200 μL离心管中，并于避光环境下加入1 μL EvaGreen（20×）染料，最后放入实时荧光定量PCR仪中。实时荧光定量PCR仪程序为64℃进行15 s，64℃进行1 min，每次循环结束采集一次信号，循环40次。结果以扩增曲线为“S”型且循环阈值（cycle threshold，Ct值）在 5～30之间为阳性，否则为阴性。对扩增后的产物进行64℃～96℃的熔解曲线分析，熔解曲线为单峰且熔解温度（melt temperature，Tm值）在80℃～90℃之间说明引物特异性较好，扩增产物单一。
SRCA反应体系如上述RF-SRCA反应体系，反应过程使用水浴锅64℃加热60 min；82℃灭酶活2 min以终止反应。将SRCA反应扩增产物用浓度为2.0%的琼脂糖凝胶进行电泳验证，凝胶电泳图出现清晰的梯形条带为阳性，否则为阴性。
1.2.4 RF-SRCA方法特异性试验
本研究使用32株菌株对RF-SRCA方法进行特异性验证，其中包括13株志贺氏菌和19株非志贺氏菌。实时荧光曲线法确定RF-SRCA的特异性。
1.2.5 RF-SRCA方法灵敏度试验
经测定，1.2.2中提取的志贺氏菌DNA纯度A260/A280为1.858，浓度为5.97×107fg/μL。将其使用无菌DNA稀释液进行10倍梯度稀释至5.97×10-1fg/μL。分别使用RF-SRCA和SRCA方法进行检测，根据实时荧光曲线法测定RF-SRCA方法灵敏度，凝胶电泳图测定普通SRCA灵敏度，将RF-SRCA的灵敏度同SRCA方法进行比较。
1.2.6 RF-SRCA方法检出限试验
取1 mL 1.2.2中过夜培养的志贺氏菌菌液（8.6×109CFU/mL）加入到9 mL灭菌后的牛奶中，混匀后从中取1 mL加入9 mL无菌牛奶中连续10倍梯度稀释至8.6×10-1CFU/mL。使用试剂盒提取DNA，各取1 μL作为反应模板，分别进行RF-SRCA和SRCA试验，将RF-SRCA的检出限同SRCA方法进行比较。
1.2.7 RF-SRCA方法对实际样品的检测与评估
为了评估RF-SRCA方法检测志贺氏菌的适用性，在当地各超市和农贸市场采集60份食品样品，包括25份蔬菜和蔬菜沙拉、20份牛奶、15份肉制品。将样品均质后于37℃培养8 h，取1 mL的均质液使用试剂盒提取DNA。以提取的DNA为模板，以GB/T 47895—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》为参考，用SRCA方法和RF-SRCA方法进行实际样品检测。并用敏感性、特异性和符合率对RF-SRCA方法评估，计算公式参考文献[22]。
2 结果与分析
2.1 RF-SRCA方法特异性分析
RF-SRCA方法引物的设计筛选决定检测方法的特异性。本研究选择32株菌株进行RF-SRCA反应，包括13株志贺氏菌和19株沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特杆菌等非志贺氏菌。RF-SRCA方法的特异性结果见图1。
图1 RF-SRCA方法的特异性结果
Fig.1 Specificity results of RF-SRCA method
A为扩增曲线图；B为熔解曲线图；1～13为志贺氏菌属；14～32为非志贺氏菌属；NC为阴性对照。
如图1A所示1～13号志贺氏菌Ct值在13左右且曲线为“S”型，故确定为阳性结果，而14～32号非志贺氏菌没有扩增为阴性结果。图1B所示1～13号志贺氏菌的熔解曲线呈单峰Tm值在85℃左右，14～32号非志贺氏菌无单峰出现，证明该方法的特异性良好。
2.2 RF-SRCA方法灵敏度分析
按照1.2.3方法进行RF-SRCA和SRCA反应，灵敏度扩增结果见图2。
图2 RF-SRCA和SRCA灵敏度扩增结果
Fig.2 RF-SRCA and SRCA sensitivity amplification results
A为RF-SRCA扩增曲线；B为SRCA扩增曲线凝胶电泳结果；1为5.97×106fg/μL；2为5.97×105fg/μL；3为5.97×104fg/μL；4为 5.97×103fg/μL；5为5.97×102fg/μL；6为5.97×101fg/μL；7为5.97×100fg/μL；8为 5.97× 10-1fg/μL；M 为 100 bp DNA Ladder；NC 为阴性对照。
RF-SRCA扩增曲线如图2A，DNA浓度为5.97×106fg/μL～5.97 × 100fg/μL（曲线 1～7）扩增曲线呈“S”型为阳性结果；DNA浓度为5.97×10-1fg/μL（曲线8）时为阴性结果。故RF-SRCA扩增曲线方法检测志贺氏菌的灵敏度为5.97×100fg/μL。普通SRCA扩增产物通过凝胶电泳进行判断，由图2B可知凝胶电泳条带随着模板浓度变低条带亮度变暗，在DNA浓度小于5.97×101fg/μL（图 2B 序号 7、8）时没有条带产生，故可知SRCA凝胶电泳的灵敏度为5.97×101fg/μL。由此可知，RF-SRCA的灵敏度比普通SRCA反应灵敏度高10倍。
2.3 RF-SRCA方法检出限分析
RF-SRCA方法检测人工污染志贺氏菌的牛奶检出限，由平板计数法测得志贺氏菌纯培养物的活菌数为8.6×109CFU/mL，进行10倍梯度稀释至8.6×10-1CFU/mL。RF-SRCA和SRCA检出限扩增结果见图3。
图3 RF-SRCA和SRCA检出限扩增结果
Fig.3 RF-SRCA and SRCA detection limit amplification results
A为RF-SRCA扩增曲线；B为SRCA扩增曲线凝胶电泳结果；1为8.6×106CFU/mL；2为 8.6×105CFU/mL；3为8.6×104CFU/mL；4为8.6×103CFU/mL；5为 8.6×102CFU/mL；6为8.6×101CFU/mL；7为8.6×100CFU/mL；8为8.6× 10-1CFU/mL；M 为100bp DNA Ladder；NC为阴性对照。
如图3A所示，牛奶中志贺氏菌浓度小于8.6×100CFU/mL时（曲线8）为阴性结果，故RF-SRCA检测牛奶中的志贺氏菌的检出限为8.6×100CFU/mL。SRCA方法检出限结果如图3B，当人工污染牛奶中的志贺氏菌浓度小于8.6×101CFU/mL（序号7、8）时，没有出现梯形条带，故判定为阴性。因此，普通SRCA凝胶电泳检测人工污染的牛奶检出限为8.6×101CFU/mL。经过比较RF-SRCA检出限比普通SRCA低10倍。
2.4 实际样品检出率分析
RF-SRCA、SRCA和国标法检测60份实际样品结果如表3所示。
表3 3种方法60份实际样品检出率比较
Table 3 Comparison of detection rates of 60 samples of three methods
检测方法 样品检测结果 纯牛奶类（15份）奶粉类（5份）肉制品（15份）蔬菜类（5份）蔬菜沙拉类（20份）阳性检出率/%检测时间/h RF-SRCA 阳性 0 0 0 0 2 3.33 0.17～0.50阴性 15 5 15 5 18 SRCA 阳性 0 0 0 0 2 3.33 2阴性 15 5 15 5 18国标法 阳性 0 0 0 0 1 1.67 72阴性 15 5 15 5 19
RF-SRCA和传统SRCA方法阳性样品检出率和检出样品一致。RF-SRCA一般反应0.17 h～0.50 h即可出现扩增结果，而传统SRCA反应1 h后进行凝胶电泳确定扩增结果，需要2.0 h左右，RF-SRCA比SRCA的检出时间更短。RF-SRCA和SRCA方法检测60份食品样品中的志贺氏菌结果相同，检出的阳性样品是蔬菜沙拉，而经过高温灭菌的熟食和牛奶中没有检出。
以GB/T 4789.5—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》为参考，RF-SRCA比其多一份阳性，没有假阴性，可得阳性检出率为3.33%，敏感性为100%，特异性为98.31%，符合率为98.33%。可能是该方法灵敏度较高或样品中存在活的但不可培养（viable but non-culturable，VBNC）状态的志贺氏菌。综上，RF-SRCA方法满足实际样品检测的需要，灵敏度高且检测时间较短。
3 结论与讨论
本研究针对志贺氏菌特异性基因ipaH设计了一对引物，进行RF-SRCA扩增反应。对RF-SRCA法进行特异性检测：志贺氏菌为阳性检测结果，其它非志贺氏菌为阴性结果，证明该方法特异性良好。RF-SRCA的灵敏度为 5.97×100fg/μL，检出限为 8.6×100CFU/g，灵敏度比普通SRCA方法高10倍，检出限比普通SRCA低10倍。RF-SRCA方法检测实际样品比国家标准方法检出率高1.66%，进一步说明该方法灵敏度较高。
根据文献报道qPCR方法和实时荧光LAMP（realtime fluorescence LAMP，RF-LAMP） 检测志贺氏菌，检出限均为102CFU/mL数量级[23-24]。RF-SRCA与其相比，检出限在数量级上低100倍。与实时荧光重组酶聚合酶扩增技术（real-time fluorescence recombinase polymerase amplification，RF-RPA）[25]相比，RF-SRCA 只需要Bst DNA聚合酶参与反应，而RF-RPA需要重组酶和聚合酶完成扩增反应，检测成本较高。因此，RFSRCA检测方法灵敏度高、简便经济、准确高效。
综上，本研究建立检测志贺氏菌的RF-SRCA方法是一种操作简单、高特异性、高灵敏度、低检出限的快速检测方法，在致病菌检测方面具有很广阔的应用前景，为致病菌检测提供了新的思路，在食品检验领域具有较高的应用价值。
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