茶色素[1]（tea pigment，TP）是从茶叶中提取的一类水溶性酚性色素，包括茶黄素（theaflavin，TF）、茶红素（thearubigin，TR）、茶褐素（theabrownin，TB）等，在茶叶加工过程中，由多酚类物质经酶促氧化聚合缩合反应形成的水溶性有色氧化产物。茶色素是具有抗氧化性[2-4]、调节神经功能[5-6]、抗性血管疾病[7-8]、减肥[9]等众多保健功效的一类茶叶特有的加工过程中形成的色素。随着科研水平的不断发展，天然色素取代人工合成色素已成为趋势[10]，因此如何从茶叶中高效绿色提取茶色素变得十分重要。
亚临界水（subcritical water，SW）提取是以亚临界水为提取溶剂，在一定压力范围内，将水加热至100℃～374℃时依然能保持液体状态[11]。目前亚临界条件已广泛应用于食品加工和植物天然产物提取[12-15]。此技术具有环境友好、提取效率高、操作方便等优点，因此利用亚临界水提取茶色素能达到提取过程绿色环保，且操作方便的目的[16]。本研究以红茶为对象，通过亚临界水提取其中的茶色素，通过响应面试验设计优化茶色素提取工艺，为茶叶天然产物提取的产业链提供一个技术参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
红茶：福建省安溪县惜缘茶业；DPPH、乙酸乙酯、95%乙醇、无水乙醇、正丁醇（均为分析纯）：国药集团上海化学试剂有限公司；超氧阴离子试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 试验仪器
恒温水浴锅（HH-6）：国华电器有限公司；水浴摇床（MQS-30S）：旻泉仪器有限公司；可见分光光度计（721N）：上海精密科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9123A）：上海齐欣科学仪器有限公司；真空冷冻干燥机（LGJ-12）：北京松源华兴科技发展有限公司；AVATAR370型傅里叶红外光谱仪：美国赛默飞世尔科技公司。
1.3 试验方法
1.3.1 茶色素的提取
将红茶样品粉碎过60目筛，放入-20℃冰箱备用。称取红茶粉末3.000 g，加入含有120 mL水的亚临界反应釜中，料液比为1∶40（g/mL），设置提取条件为100 r/min、160℃、30 min，过滤后得上清液，记为SW组茶色素。以普通沸水提取作为对照，记为BW组茶色素。
1.3.2 总茶色素含量的测定
参照Roberts等[17]的系统分析法，进行茶叶提取液中TF、TR、TB的含量的测定，所有试验重复3次，结果取平均值。其中总茶色素含量计算方式如下。
TP/%=TF+TR+TB
式中：TP表示总茶色素含量，%；TF表示茶黄素含量，%；TR表示茶红素含量，%；TB表示茶褐色含量，%。
1.3.3 单因素试验
对亚临界水提法进行响应面优化设计，首先进行单因素试验。分别考察料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]、亚临界提取温度（120、130、140、150、160 ℃）和亚临界提取时间（5、10、15、20、25 min）对茶汤中茶色素含量的影响。
1.3.4 亚临界水提取茶色素的响应面试验
以总茶色素含量（TP）、茶黄素含量（TF）、茶红素含量（TR）、茶褐素含量（TB）为响应值。采用三水平三因素的Box-Behnken试验设计，研究利用亚临界水提取茶色素的最佳提取参数。选取A料液比、B提取温度、C提取时间3个因素，并设置3个水平，以-1、0、+1编码，具体水平因素设计见表1。
表1 因素与水平设计
Table 1 Factors and horizontal design
水平 因素A料液比/（g/mL）B提取温度/℃C提取时间/min-1 1∶50 120 5 0 1∶30 140 15 1 1∶10 160 25
1.3.5 傅里叶红外光谱分析
取1 mg干燥的茶色素样品粉末与100 mg KBr固体粉末一起研磨，压片机压片，放入AVATAR370型的傅里叶红外光谱仪中，在4 000 cm-1～400 cm-1范围内进行扫描，观察峰谱情况。
1.3.6 总茶色素的体外抗氧化活性研究
采用DPPH·比色法进行测定，参照Yang等[18]方法，检测DPPH自由基的清除率；利用超氧阴离子试剂盒检测总茶色素的超氧阴离子的清除率。以普通沸水提取的总茶色素的抗氧化活性做对照，所有试验重复3次，结果取平均值。
1.3.7 茶粉物理形态观察
取适量经亚临界水处理后经冷冻干燥的固态茶色素粉粒和沸水提取后的茶粉固态茶色素粉粒，通过阴极喷涂将样品金覆盖，在扫描电镜上放大1 000倍，观察样品微观结构。
1.4 数据处理
利用SPSS软件进行数据差异性分析，运用Excel 2010进行表格的绘制，Prism进行图像绘制，同时利用Design-Expert 10软件进行回归模型建立、方差分析及绘制响应曲面图。
2 结果与分析
2.1 不同提取剂提取茶色素的含量比较
茶色素在不同提取剂中的溶解性不同，得到的色素溶液颜色也不同。以沸水提取得到的茶色素溶液颜色为深棕色，而在亚临界条件下水提取得到的色素颜色稍浅为棕色，但溶液较浓且不黏稠。检测其TF、TR、TB、TP含量结果如图1所示。
图1 不同提取剂提取的茶色素含量
Fig.1 The content of tea pigment extracted by different extraction agent
a.不同方法提取的TF含量；b.不同方法提取的TR、TB、TP含量。
由图1可知，SW组4种茶色素含量高于普通沸水提取法，且TF、TR、TB的含量增加较为明显。
2.2 单因素试验
2.2.1 料液比对茶色素含量的影响
不同料液比提取对茶色素含量的影响见图2。
图2 不同料液比提取的茶色素含量
Fig.2 The content of tea pigment extracted by different solidliquid ratio
a.不同料液比提取的TF含量；b.不同料液比提取的TR、TB、TP含量。
由图2可知，反应前期，随着溶剂增加，茶黄素有增大的趋势，在料液比为 1∶20（g/mL）～1∶30（g/mL）时有降低的趋势，而后继续上升，在料液比为1∶50（g/mL）时，茶黄素含量达最高为2.9%。茶红素和茶褐素的含量也随溶剂增加而逐渐增大，在料液比1∶40（g/mL）时含量分别达到12.49%、16.22%。这可能是由于在溶剂较少时，茶色素溶解较少，使得各种茶色素提取率变化不大；随着溶剂增加，茶粉与溶剂的接触面积增大，茶色素的溶解量增加，从而所得到的各种茶色素含量升高。继续增加溶剂，部分茶色素降解，导致提取率降低。所以最适料液比为1：40（g/mL），此时总茶色素含量为30.04%。
2.2.2 亚临界水提取温度对茶色素含量的影响
提取温度的改变可以通过影响原料黏度和溶解速度来影响提取率，不同提取温度提取的茶色素含量见图3。
图3 不同提取温度提取的茶色素含量
Fig.3 The content of tea pigment extracted by the different temperature of extraction
a.不同温度提取的TF含量；b.不同温度提取的TR、TB、TP含量。
由图3可知，在120℃～160℃之间，随着温度的升高茶黄素含量先减小后增大又减小，在150℃时达到2.39%。随着温度升高茶红素含量有略微升高再下降的趋势，在130℃时达到15.94%。茶褐素含量在120℃～140℃时变化不大，在温度大于140℃后含量明显下降，猜测其变化原因是由于非提取成分形成泡沫包裹在原料的表面，降低提取率，将温度调至合适的范围可以加速分子的运动从而提高溶解度，或者由于茶色素不耐高热，开始降解所致。因此选择140℃为最适提取温度。
2.2.3 亚临界水提取时间对茶色素含量的影响
不同提取时间提取的茶色素含量见图4。
图4 不同提取时间提取的茶色素含量
Fig.4 The content of tea pigment extracted by different extraction time
a.不同提取时间的TF含量；b.不同提取时间的TR、TB、TP含量。
由图4可以看出，随着提取时间延长，茶黄素的含量呈先升高后降低趋势，在提取时间为20 min时茶黄素含量为2.05%。随着提取时间延长茶红素和茶褐素也是呈先升高后降低的波动变化趋势。在10 min～15 min之间茶红素和茶褐素含量变化起伏不大。推测在提取15 min左右提取环境达到固液相平衡，在平衡前适当地延长提取时间有利于更多成分析出；而随着时间逐渐延长，茶色素开始降解，导致提取率下降。因此选择15 min为最适提取时间。
2.3 亚临界水提取茶色素的响应面试验结果
采用三因素三水平的Box-Behnken试验设计，以料液比、提取温度、提取时间为独立变量，以TF、TR、TB、TP的含量为响应变量的17个试验，结果见表2。
表2 响应面试验设计与茶色素含量
Table 2 Response surface experiment design and tea pigment content
试验号 A B C TF/% TR/% TB/% TP/%1 -1 0 -1 1.28 14.78 15.14 31.20 2 0 0 0 0.79 10.56 11.84 23.19 3 0 0 0 0.75 11.24 12.63 24.62 4 0 0 0 0.70 11.28 11.91 23.89 5 0 -1 -1 0.40 8.78 9.98 19.16 6 1 1 0 0.78 10.39 9.45 20.62 7 -1 -1 0 1.01 14.11 13.54 28.66 8 0 1 1 0.62 9.89 10.98 21.49 9 0 1 -1 0.59 8.56 9.56 18.71 10 0 0 0 0.80 11.56 11.92 24.28 11 1 0 -1 0.42 9.12 11.45 20.99 12 -1 1 0 1.12 12.89 13.88 27.89 13 1 0 1 0.63 9.78 10.46 20.87 14 -1 0 1 0.92 12.23 13.74 26.89 15 0 -1 1 0.53 8.65 10.61 19.79 16 1 -1 0 0.39 7.69 9.04 17.12 17 0 0 0 0.71 10.96 11.33 23.00
2.3.1 茶黄素及茶红素的Box-Behnken试验
通过对试验数据进行多元回归分析，得到茶黄素（TF）和茶红素（TR）含量的二阶方程式如下。
YTF=1.08-0.52A+0.081B-0.077C+0.3AB+0.26AC+0.063BC+0.29A2-0.28B2-0.17C2。
YTR=11.12-2.13A+0.31B-0.086C+0.98AB+0.80AC+0.36BC+1.33A2-1.18B2-0.97C2。
方差分析常被用于评估独立变量和响应变量之间的关系以及提取方法的最佳条件，茶黄素和茶红素的结果见表3。
表3 茶黄素及茶红素含量方差分析
Table 3 Variance analysis of theaflavin and thearubigin contents
注：P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。
来源 TF含量 TR含量均方 F值 P值 均方 F值 P值模型 0.11 24.09 0.000 2 6.73 25.14 0.000 2 A料液比 0.56 126.58 <0.000 1 36.25 135.36<0.000 1 B提取温度 0.076 17.3 0.004 2 0.78 2.92 0.131 4 C提取时间 0.048 0.71 0.959 0.06 0.22 0.651 7 AB 0.36 4.46 0.072 6 3.84 14.34 0.006 8 AC 0.081 18.48 0.003 6 2.58 9.62 0.017 3 BC 0.016 0.57 0.475 4 0.53 1.99 0.201 2 A2 0.13 29.75 0.001 7.43 27.76 0.001 2 B2 0.043 9.82 0.016 5 5.85 21.84 0.002 3 C2 0.054 12.39 0.009 7 3.97 14.83 0.006 3残差 0.3 0.27失拟值 0.28 3.67 0.120 6 0.43 3.03 0.156 R2 0.968 7 0.97images/BZ_82_1842_1637_1858_1674.png
由表3可知，茶黄素的模型P值达到极显著水平且R2为0.968 7，说明该试验设计成功。对茶红素而言，模型的F值为25.14，P<0.01说明模型达到极显著水平，具有统计学意义。茶红素的失拟项P值为0.156为不显著，R2为0.97，进一步表明该模型选择合适。在TR方差分析中，各项的P值表明该因素对响应值的影响程度，从表中可以看出一次项A料液比和交互项AB的P值都达到极显著水平，说明其对茶红素含量影响较大。
响应面3D图能直观的看出各个因素对响应值的交互作用，各因素对茶黄素和茶红素响应面3D图见图5。
图5 各因素对茶黄素和茶红素响应面3D图
Fig.5 Theaflavin and thearubigin response surface 3D diagram
a～c为料液比、提取温度、提取时间对茶黄素含量的3D图；d～f为料液比、提取温度、提取时间对茶红素含量的3D图。
由图5a～图5c中看出，当茶粉成分越低时，茶黄素的含量逐渐升高，各项因子对茶黄素提取的作用影响：料液比>提取温度>提取时间。在此体系茶黄素最优提取条件：料液比 1∶50（g/mL），提取温度 144.3 ℃，提取时间11.46 min。
由图5d～图5f可知，随着溶剂的增加，茶红素的含量逐渐升高，这可能是由于提取溶剂太少时，茶粉与提取溶剂接触不充分、不均匀，影响TR析出。各项因子对茶红素含量的影响顺序为料液比>提取温度>提取时间，与茶黄素趋势大致相同。提取时间对提取率影响最小，与前人结果相似[19-20]。在此体系中茶红素最优提取条件：料液比1∶50（g/mL），提取温度132.72℃，提取时间9.74 min。
2.3.2 茶褐素及总茶色素的Box-Behnken试验
通过对试验数据进行多元回归分析，得到茶褐素（TB）和总茶色素（TP）含量的二阶方程式如下。
YTB=12.14-2.23A+0.099B+0.21C-0.23AB+0.10AC-0.29BC+0.98A2-1.91B2-0.44C2。
YTP=23.80-4.38A+0.50B-0.13C+1.07AB+1.05AC+0.54BC+2.94A2-2.71B2-1.30C2。
茶褐素和总茶色素的方差分析结果见表4。
表4 茶褐素及总茶色素含量的方差分析
Table 4 Variance analysis of theabrownin and total tea pigment contents
注：P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。
TP含量均方 F值 P值 均方 F值 P值模型 4.91 8.86 0.004 4 25.24 16.49 0.000 6 A料液比 31.6 56.97 0.000 1 153.48 100.29 <0.000 1 B提取温度 0.061 0.11 0.749 4 1.98 1.29 0.292 8 C提取时间 0.014 0.026 0.876 3 0.13 0.085 0.779 1 AB 0.21 0.18 0.963 8 4.56 2.98 0.128 AC 0.042 0.076 0.791 1 4.39 2.87 0.134 2 BC 0.16 0.28 0.612 3 1.16 0.76 0.413 6 A2 4.07 7.34 0.030 2 26.07 17.04 0.004 4 B2 8.63 15.56 0.005 6 30.96 20.23 0.002 8 C2 0.19 0.34 0.577 9 7.08 4.63 0.068 5残差 0.55 1.53失拟值 1.01 4.7 0.084 6 2.93 6.09 0.056 7 R2 0.919 3 0.955来源 TB含量images/BZ_84_1352_474_1366_508.png
茶褐素模型的F值为8.86，P<0.01且失拟项P值为0.084 6不显著，R2值为0.919 3，表明该模型拟合成功。从表中得到一次项A料液比和二次项B2都存在极显著差异。其中料液比、提取温度、提取时间3者的交互作用对茶褐素含量影响不大。总茶色素（TP）模型的F值为16.49，P<0.001，模型达到极显著水平，失拟项P值为0.056 7不显著，R2为0.955，该模型拟合成功。其中一次项A料液比和二次项A2、B2，都达到极显著水平，说明其影响趋势与茶褐素相似。
各因素对茶褐素和总茶色素的响应面3D图见图6。
图6 各因素对茶褐素和总茶色素的响应面3D图
Fig.6 Theabrownin and total tea pigment response surface 3D diagram
a～c为料液比、提取温度、提取时间对茶褐素含量的3D图；d～f为料液比、提取温度、提取时间对总茶色素含量的3D图。
由图6可知，由于TB含量的变化影响了TP含量的变化，因此TP图形的变化趋势与TB相似。随着提取温度的增加，TB含量和TP含量都有逐渐降低的趋势，可能因为温度过高茶色素热敏导致茶色素溶解减少。各项因子对TB含量和TP含量的影响为料液比>提取温度>提取时间。响应面试验选择提取茶褐素的最佳提取条件为料液比为1∶50（g/mL），提取温度为140℃，提取时间为11.57 min；而Box-Behnken试验选择提取总茶色素的最佳提取条件：料液比为1∶50（g/mL），提取温度为136.96℃，提取时间为10.16 min。
根据本研究目的，提取3种茶色素的含量最大化和最大限度的得到总茶色素，响应面试验选择TF、TR、TB和TP的最大值，软件分析得到的提取条件：料液比1∶50（g/mL），提取温度 138.1 ℃，提取时间 9.87 min。
2.3.3 结果验证
通过响应面试验，以筛选出来的提取条件进行茶色素提取，预测能得到的TF含量为1.23%、TR含量为14.85%、TB含量为14.91%、TP含量为30.98%。通过实际提取后对提取液进行检测得到TF含量为1.31%、TR含量为14.37%、TB含量为13.34%、TP含量为29.02%。与模型预测值大致相同，说明模型拟合成功。
2.4 总茶色素的红外光谱结果
2.4.1 普通沸水提取总茶色素得红外光谱扫描结果
总茶色素在4 000 cm-1～0范围内进行红外光谱扫描，结果见图7。
图7 BW组总茶色素红外光谱图
Fig7 Infrared spectra of BW total tea pigment
由图7可知，3 361 cm-1处有吸收峰，说明是由OH的伸缩振动引起的；1 704 cm-1处有吸收峰，说明是由-C=O 的伸缩振动引起的；1 656、1 583、1 458 cm-1有吸收峰，表明结构中可能含苯环结构；1 337 cm-1处有吸收峰，为O-H键的面内弯曲振动；1 166 cm-1处有吸收峰，说明有=C-OH的存在，表明结构中含有含有=C-OH结构。
2.4.2 亚临界水提总茶色素的红外光谱扫描结果
总茶色素在4 000 cm-1～0范围内进行红外光谱扫描，结果见图8。
图8 SW组总茶色素红外光谱图
Fig.8 Infrared spectra of SW total tea pigment
图8中3384cm-1处有吸收峰，说明是由O-H的伸缩振动引起的；1 704 cm-1处有吸收峰，说明是由-C=O的伸缩振动引起的；1 655、1 581、1 458 cm-1有吸收峰，表明结构中可能含苯环结构；1 371 cm-1处有吸收峰，为O-H键的面内弯曲振动；1 151 cm-1处有吸收峰，说明有=C-OH的存在，表明结构中含有含有=C-OH结构。
2.5 总茶色素的体外抗氧化性研究结果
2.5.1 总茶色素对DPPH自由基清除率的测定结果
体内过多的自由基积累会造成细胞衰老和组织损伤[21-22]。茶色素为多酚氧化物，具有较强的抗氧化能力[23-24]。总茶色素对DPPH自由基清除率见图9。
图9 总茶色素对DPPH自由基的清除率
Fig.9 The clearance of DPPH free radicals by total tea pigment
由图9可知，总茶色素对DPPH自由基的清除率呈正相关，即随着总茶色素浓度的升高，其DPPH自由基的清除率也随之升高。当总茶色素浓度达到5 g/mL时，BW茶色素对DPPH自由基清除率达到55.90%，此时SW的清除率为88.10%。当总茶色素浓度为最小值0.5 g/mL时，SW组茶色素的DPPH自由基清除率已超过50%，此时BW组对DPPH自由基的清除率为12.66%。说明SW组提取得到的总茶色素对DPPH自由基具有较好的清除效果，且优于普通沸水提取的茶色素。
2.5.2 总茶色素对O2-自由基清除率的测定结果
O2-·是生物体内氧分子受单一电子还原产物，性质活泼，具有很强的氧化性和还原性。其不发生化学改变对生物体没有危害，但与羟基结和后的产物会导致细胞DNA损坏破坏机体功能。总茶色素对超氧阴离子自由基的清除率见图10。
图10 总茶色素对超氧阴离子自由基的清除率
Fig.10 The clearance of super oxide anion free radicals by total tea pigment
由图10可知，两组色素对O2-自由基的清除效果较为一致。当色素浓度为5 g/mL时SW组对O2-自由基的清除率达到39.69%。两组色素对O2-自由基的最大清除率都未超过50%。茶色素是茶多酚氧化聚合形成的酚性水溶性色素，其酚羟基活性较之茶多酚有所下降，因此对O2-自由基的清除率较低，与邢珂慧等[25]研究结果相似。
2.6 电镜扫描结果
沸水提取的总茶色素粉粒和亚临界水提取的总茶色素粉粒表观形态图如图11所示。
图11 不同提取方式提取后的茶粉电镜扫描结果
Fig.11 SEM results of tea powder extracted by different extraction methods
沸水提取的茶色素为平滑的片状表面，表面凹凸不平，颗粒之间紧密聚集，而通过亚临界水提取得到的茶色素粉粒，为不规则的微孔结构，自身出现空隙，产物叠堆变得疏松，结构变得更疏松，空隙更大色素粉粒分布更均匀。
3 结论
本研究探索了通过亚临界水处理得到茶色素的提取方法，并评估其抗氧化活性，且与沸水提取得到的茶色素生物活性进行比较。研究发现利用亚临界水能高效绿色的提取得到茶色素成品。通过响应面试验进行亚临界水提取茶色素工艺的优化，最终筛选确定亚临界水提取的最佳条件：料液比为 1∶50（g/mL），提取温度为138.1℃，提取时间为9.87 min。SW提取的总茶色素对的DPPH自由基清除率显著高于BW组，表现出良好的抗氧化活性。利用亚临界水提取茶色素表现优势明显，亚临界水在天然产物的提取方面有巨大的潜力。
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