芦笋（Asparagus officinalis L.），属于百合科、天门冬属，富含有纤维素、木质素、蛋白质、矿物质等营养成分[1]，还含有多酚、皂苷、多糖等功效成分[2]，具有抗癌[3]、抗衰老、抗紫外线[4]等作用。平菇（Pleurotus ostreatus），从属侧耳科、侧耳属，氨基酸种类丰富[5]，含有人体所必需的8种氨基酸，矿物质元素含量高[6]，营养均衡[7]，其具有的多糖能调节人体免疫能力[8]，抵抗结肠癌细胞的侵袭[9]，也有利于预防肠胃、心脑血管等疾病[10]。
平菇人工栽培时间较长，限制了其营养价值的充分利用。随着食用菌发酵技术的不断进步，可以通过液体发酵方式获得食用菌菌丝体和活性成分。常规液体发酵培养基多以化学试剂配制而成，加大了后续发酵液再利用、活性物质提取纯化等工序的难度。一些植物例如芦笋、牛蒡中除富含纤维素和木质素外[11]，还含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质等营养成分[12]，因为平菇具有分解、利用纤维素和木质素的能力，因此可以利用芦笋、牛蒡作为液体发酵的原料。因此以芦笋为培养基液体发酵平菇，利用其发酵液进一步制备饮料，则融合了植物和食用菌的优势，有利于发挥芦笋和平菇的价值。目前国内外市场畅销的饮料中，对人体健康有益的发酵饮料、食用菌饮料占比较小，且局限于直接采用子实体为原料[13]，不利于食用菌营养和功能的全面发挥。因此植物-食用菌发酵型饮料还具有很广阔的开发和应用空间。
本文以芦笋为主要原料，平菇为发酵菌种，采用液体深层发酵技术，制备芦笋-平菇发酵型饮料，能很好地保持平菇的营养，同时芦笋中的一些营养成分被降解，形成新的有效成分和风味物质，为提升芦笋和平菇深加工产品的科技含量和市场竞争力提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料、试剂和仪器
1.1.1 试验材料和试剂
芦笋：徐州山崎农产品研发有限公司；平菇菌种：江苏省高校食品资源开发与质量安全重点建设实验室保存；柠檬酸、蔗糖、蜂蜜：兰溪市鸿香生物科技有限公司；酵母浸膏、琼脂、羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）、黄原胶、β-环状糊精：江苏佰耀生物科技有限公司；单糖标准品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、岩藻糖、半乳糖）、17种氨基酸标准品、乙腈（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 试验仪器
XFS-260高压蒸汽灭菌锅、HC-1016离心机：浙江中友实业有限公司；THZ-98AB恒温摇床、HH-1电热恒温水浴锅、DHP-420S电热恒温培养箱：宜邦科析仪器有限公司；721G可见分光度计：上海谱元仪器有限公司；1 200液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；iCAPQ电感耦合等离子体质谱仪：美国Thermo公司。
1.2 培养基的配制
1.2.1 马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基
称取葡萄糖10 g，琼脂5 g～10 g，土豆100 g，加入500 mL纯水，pH值为自然，高压灭菌后使用。
1.2.2 液体发酵培养基
称取1%酵母膏和1%粉碎后的芦笋，装入250 mL三角瓶中，高压灭菌后使用。
1.3 平菇菌种的活化
在无菌操作台内将平菇菌种接入PDA斜面培养基中，28℃培养箱培养6d～8d。挑选长势好的菌种，接种在液体发酵培养基中，28℃，120r/min摇床培养7d～9d。
1.4 稳定剂的单因素试验
培养好的发酵菌液放入液体搅拌机，搅拌10 min，混合液4 000 r/min离心10 min，取上清液备用。
1.4.1 β-环状糊精的添加量
向上清液中分别加入0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%的β-环状糊精，充分溶解静止12 h以上，计算沉淀率，每次试验重复3次取其平均值。
1.4.2 CMC-Na的添加量
向上清液中分别加入0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的CMC-Na，充分溶解静止12 h以上，计算沉淀率，每次试验重复3次取其平均值。
1.4.3 黄原胶的添加量
向上清液中分别加入0.04%、0.05%、0.06%、0.07%、0.08%的黄原胶，充分溶解静止12 h以上，计算沉淀率，每次试验重复3次取其平均值。
1.4.4 沉淀率的测定
将加入不同比例的稳定剂发酵液倒入离心管，在离心机中4 000 r/min离心20 min，去上清液，将离心管与沉淀物放入电热鼓风干燥器中烘干至恒重，称量质量，按照公式（1）计算每组沉淀率。
1.5 调配剂的单因素试验
以蔗糖、蜂蜜、柠檬酸3种调味剂作为3个单因素，进行感官评价，重复3次，取平均值。
1.5.1 蜂蜜的添加量
将1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的蜂蜜加入含有稳定剂的发酵液中，溶解后灭菌冷却，品尝并评分。
1.5.2 蔗糖的添加量
将6%、7%、8%、9%、10%的蔗糖加入含有稳定剂的发酵液中，溶解后灭菌冷却，品尝并评分。
1.5.3 柠檬酸的添加量
将0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%的柠檬酸加入含有稳定剂的发酵液中，溶解后灭菌冷却，品尝并评分。
1.6 响应面试验设计
采用Design-Expert 8软件，选取三因素和感官评价得分较高的3个水平，进行试验。设计方案见表1。
表1 试验的因素与水平
Table 1 Response surface experiment
水平 代号 因素蜂蜜/% 蔗糖/% 柠檬酸/%-1 X1 1.5 7 0.25 0 X2 2.0 8 0.30 1 X3 2.5 9 0.35
1.7 感官评价指标
感官评价表见表2。
表2 芦笋-平菇发酵饮料感官评价表
Table 2 Sensory evaluation of Asparagus officinalis L.-Pleurotus ostreatus fermented beverage
甜度（25分） 酸度（25分） 香味（25分） 色泽（25分）甜度适宜（20～25） 酸度适宜 芦笋、平菇清香，蜂蜜香气 液体澄澈，色泽均匀偏甜（14～19） 偏酸 芦笋、平菇香味较淡，无异味 色泽均匀，肉眼下无杂质较甜（8～13） 较酸 芦笋、平菇香味淡，稍许异味 色泽较均匀，有少许杂质过甜（4～7） 过酸 无香味、难闻气味 色泽不均匀，杂色多极甜（1～3） 极酸 无香味，气味难闻 色泽极其不均匀，杂质过多
感官评价分值=25%甜度评分＋25%酸度评分＋25%香味评分+25%色泽评分。邀请15位具有一定食品感官评定基础的食品专业人士组成评定小组[14]，依照评分指标对饮料进行感官评定。
1.8 多糖的提取和测定
1.8.1 粗多糖的提取
将发酵液4000r/min离心10min，取上清置于50℃烘箱中烘至原体积五分之一，再加入5倍体积95%乙醇，4℃冰箱中过夜醇沉后，4 000 r/min离心5 min，取沉淀于50℃烘箱烘干，得粗多糖。
1.8.2 粗多糖纯化
Sevag法脱蛋白：将1 g粗多糖加入10 mL纯水溶解，加入2.5 mL Sevag试剂（氯仿∶正丁醇体积比=5∶1），将混合溶液装入分液漏斗中振荡18 min～20 min，取上层溶液4 000 r/min离心15 min，弃下层液体，上清液再次加入Sevag试剂，重复脱蛋白操作，至无蛋白质层，合并上清液备用。透析：取截流分子量为6 000 Da～8 000 Da的半透膜袋，沸水水浴5 min，纯水将其冲开，封住一端，将上述得到的上清液倒入后封住开口的另一端，置于装有纯水的烧杯中，用磁力搅拌器进行透析，每2 h换一次水，2 d后得到烘干样品即为精制多糖。
1.8.3 多糖测定
将1 g粗多糖加入100 mL蒸馏水充分溶解，取2 mL多糖溶液，加1 mL 6%苯酚，5 mL浓硫酸，混匀，100℃水浴15 min，冷却至室温（25℃），于490 nm处测定吸光度值，对照组为蒸馏水。经标准曲线计算多糖含量。
1.8.4 葡萄糖标准曲线制作
精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1 g于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容。分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 的葡萄糖溶液于试管中，并编号为1～9，加蒸馏水定容到2.0 mL，再在试管中加入1 mL 6%的苯酚溶液与5 mL的浓硫酸，充分混匀后放入100℃的水浴锅中水浴15 min，冷却后于波长490 nm处测量各个试管中溶液的吸光度值。标准曲线回归方程为y=0.015 3x+0.014 5，R2=0.990 2。
1.9 单糖的高效液相色谱检测
1.9.1 完全酸水解
先向多糖样品中加入0.5 mL浓度为2 mol/L的三氟乙酸溶液，然后在120℃下进行100 min的水解，最后用氮吹仪将其吹干即得到单糖样品。
标准品处理：配制10 mg/mL的单糖标准品，吸取5 mL于密封的玻璃管中，摇匀后向其中加入0.5 mL浓度为2 mol/L的三氟乙酸溶液，与样品一起在120℃下进行100 min的水解，使用空气泵吹干。
1.9.2 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）衍生化
向单糖样品中加入0.5 mL浓度为0.5 mol/L的PMP试剂以及0.5 mL浓度为0.3 mol/L的NaOH溶液，将其摇匀后放进60℃的水浴锅中水浴20 min，冷却到室温（25℃）后加入0.5 mL浓度为0.3 mol/L的HCl和0.5 mL的氯仿，充分振荡萃取后在5 000 r/min的离心机中离心5 min，去除氯仿层后再进行两次萃取。最后得到的水层用0.22 μm的滤膜进行过滤后使用高效液相色谱仪进行测定。
1.9.3 仪器条件
柱温25℃，流速1.0 mL/min，波长245 nm，进样量10 mL，流动相是0.1 mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲液∶乙腈为82∶18（体积比），色谱柱是 SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。
1.10 矿物质元素检测
Mg、Fe、Se、Ca、Zn 等元素含量采用电感耦合等离子体-质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）[15]。取适量饮料样品放入聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL硝酸。静置，反应完结后，盖盖密封，放入微波消解仪，温度冷却到50℃以下，取出消解罐放入通风橱中，打开消解罐，用超纯水润洗，转移至50 mL容量瓶中，润洗3次～4次，用超纯水稀释、定容至刻度，待测。空白对照同法处理。ICP-MS仪器参数：射频功率为1 550 W，泵速为40 r/min，雾化室温度为2.7℃，采样深度5 mm，冷却气流速14 L/min，辅助气流速为0.8 L/min，雾化气流速为1.122 L/min。
1.11 高效液相色谱检测氨基酸
适量饮料样品中加入20 mL盐酸，干燥，110℃水解，降温，比色管中定容。取1 mL在85℃下吹干，加水1 mL，吹干。加入10 mL 0.02 mol/L盐酸，振荡。分别取500 μL，加 250 μL 0.1 mol/L 异硫氰酸苯酯乙腈和250 μL 1mol/L三乙胺乙腈，衍生1 h。加2 mL正己烷，振荡，静置，取下层，过0.45 μm有机膜上机。SHISEIDO C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为：0.1 mol/L 无水乙酸钠：乙腈=97：3（调 pH 6.5）；流速1.0 mL/min；柱温 40℃；进样量 10 μL，波长 245 nm。用外标法测定氨基酸种类，并计算质量百分比。
1.12 数据分析
采用Origin 9.0软件处理数据并作图，所有数据用平均值±标准差表示。
2 结果与讨论
2.1 稳定剂的单因素试验
2.1.1 黄原胶添加量的确定
在黄原胶添加量不同时，发酵液的沉淀率结果见图1。
图1 不同黄原胶添加量下发酵液的沉淀率
Fig.1 Sedimentation rate of fermentation broth with different amounts of xanthan gum
如图1所示，当黄原胶添加量为0.06%时有最小沉淀率0.09%。马鹏利等[16]研究珍珠油杏杏汁发现，当黄原胶用量为0.06%时最为稳定，与本文研究结果基本一致。
2.1.2 CMC-Na添加量的确定
在CMC-Na添加量不同时，发酵液的沉淀率结果见图2。
图2 不同CMC-Na添加量下发酵液的沉淀率
Fig.2 Sedimentation rate of fermentation broth with different addition of sodium carboxymethyl cellulose
如图2所示，当CMC-Na添加量为0.15%时有最小沉淀率0.12%。秦丹丹等[17]黑木耳黑枸杞复合饮料发现，当CMC-Na用量为0.08%时最为稳定，与本文研究结果基本一致。
2.1.3 β-环状糊精添加量的确定
在β-环状糊精添加量不同时，发酵液的沉淀率结果见图3。
图3 不同β-环状糊精添加量下发酵液的沉淀率
Fig.3 Sedimentation rate of fermentation broth with different amounts of β-cyclodextrin
如图3所示，当β-环状糊精添加量为0.40%时有最小沉淀率0.11%。苗敬芝等[18]研究灵芝、金针菇混合发酵饮料发现，当β-环状糊精用量为0.50%时最为稳定，与本文研究结果基本一致。
2.2 稳定剂复配试验
采用上述单因素试验最佳工艺：黄原胶的添加量为0.06%，CMC-Na添加量为0.15%，β-环状糊精添加量为0.40%，进行稳定剂复配试验，测得发酵液沉淀率为0.09%。
2.3 调配剂的单因素试验
2.3.1 蜂蜜添加量
添加不同量的蜂蜜时，饮料感官鉴评的结果如图4所示。
图4 不同蜂蜜添加量下的饮料感官评分结果
Fig.4 Sensory score of beverage with different honey content
从图4可知，当蜂蜜添加量是2.0%时评分最高，为92分。杨晶晶等[19]研究玫瑰花、玫瑰茄复合饮料发现，当蜂蜜用量为2.1%时效果最佳，与本文研究结果基本一致。
2.3.2 蔗糖添加量
在蔗糖的添加量不同时，饮料感官鉴评的结果如图5所示。
图5 不同蔗糖添加量下饮料感官的评分结果
Fig.5 Sensory scoring results of beverages with different amounts of sucrose
从图5可知，当蔗糖添加量是8%时有最高评分93分。因此初步选择7%、8%、9%作为蔗糖的添加量。张锋等[20]研究苹果-绿茶复合饮料发现，当蔗糖用量为8%时效果最佳，与本文研究结果基本一致。
2.3.3 柠檬酸添加量
在柠檬酸的添加量不同时，饮料感官鉴评的结果如图6所示。
图6 不同柠檬酸添加量下饮料感官的评分结果
Fig.6 Sensory score of beverage with different amount of citric acid
从图6可知，当柠檬酸添加量是0.30%时有最高评分91分。因此初步选择0.25%、0.30%、0.35%作为柠檬酸的添加量。刘海燕等[21]研究人参植物饮品发现，当柠檬酸用量为0.33%时效果最佳，与本文研究结果基本一致。
2.4 响应面试验设计结果
根据响应面软件进行分析处理得出方案，感官评分结果如表3所示。
表3 响应面试验设计和结果
Table 3 Response surface experimental design and results
序号 X1 X2 X3评分实际值 预测值1 1.50 7.00 0.30 72.00 72.75 2 2.50 7.00 0.30 81.00 81.25 3 1.50 9.00 0.30 77.00 76.75 4 2.50 9.00 0.30 83.00 82.25 5 1.50 8.00 0.25 73.00 73.50 6 2.50 8.00 0.25 82.00 83.00 7 1.50 8.00 0.35 71.00 70.00 8 2.50 8.00 0.35 75.00 74.50 9 2.00 7.00 0.25 80.00 78.75 10 2.00 9.00 0.25 85.00 84.75 11 2.00 7.00 0.35 76.00 76.25
续表3 响应面试验设计和结果
Continue table 3 Response surface experimental design and results
序号 X1 X2 X3评分实际值 预测值12 2.00 9.00 0.35 74.00 75.25 13 2.00 8.00 0.30 93.00 94.20 14 2.00 8.00 0.30 95.00 94.20 15 2.00 8.00 0.30 95.00 94.20 16 2.00 8.00 0.30 93.00 94.20 17 2.00 8.00 0.30 95.00 94.20
2.5 回归模型的建立和检验
对表2中的数据进行分析处理，把X1蜂蜜、X2蔗糖、X3柠檬酸3个因素进行回归拟合，可以得出相关的回归方程，见公式（2）。
方差分析及可靠性分析见表4。
表4 回归模型方差分析
Table 4 Analysis of variance in regression model
注：**表示 P<0.01，差异极其显著；*表示 0.01
方差来源 离均差平方和 自由度 均方 F值 P值模型 1 226.08 9 136.23 80.82 <0.000 1**X1 98.00 1 98.00 58.14 0.000 1**X2 12.50 1 12.50 7.42 0.029 6*X3 72.00 1 72.00 42.71 0.000 3**X1X2 2.25 1 2.25 1.33 0.285 9 X1X3 6.25 1 6.25 3.71 0.095 6 X2X3 12.25 1 12.25 7.27 0.030 8*X12 398.21 1 398.21 236.23 <0.000 1**X22 163.16 1 163.16 96.79 <0.000 1**X32 358.32 1 358.32 212.56 <0.000 1**残差 11.80 7 1.69失拟向 7.00 3 2.33 1.94 0.264 3纯误差 4.80 4 1.20总和 1 237.88 16
回归模型P＜0.01，达到了极显著水平；失拟项P值大于0.05，不显著，试验无失拟因素存在，能充分反映实际情况；决定系数R2为0.990 5，说明实际结果与模型预测结果的一致性良好；R2adj=0.978 2，试验结果有93.33%受试验因素影响。该模型拟合程度好，可以用该模型对芦笋-平菇发酵型饮料制备工艺进行分析和预测。由回归方程和方差分析可知，模型中X1、X3、X12、X22、X32对芦笋-平菇发酵型饮料多糖含量的影响为极显著（P＜0.01），X2对芦笋-平菇发酵型饮料多糖含量的影响为显著（P＜0.05）。各因素对牛蒡茶多糖含量的影响依次为 X1＞X3＞X2，即蜂蜜＞柠檬酸＞蔗糖。
2.6 两因素间的交互作用分析
各影响因素两两作用对牛蒡茶多糖含量的交互影响见图7。
图7 响应面分析图和等高线图
Fig.7 Response surface analysis chart and contour map
在所选范围内各影响因素的相互作用存在极大值，既是响应面的最高点，同时也是等值线最小椭圆的中心点。由表4数据分析可知，蔗糖与柠檬酸两两交互作用显著（P<0.05），蜂蜜与蔗糖、蜂蜜与柠檬酸两两交互作用不显著（P>0.05）。
2.7 调味剂最优配比和结果验证
回归模型确定的最佳制备工艺为蜂蜜、蔗糖、柠檬酸的最佳添加量分别为2.09%、8.11%、0.29%，此条件下对饮料最高的感官评分是94.88分。为了验证此最佳方案，根据实际操作情况将3种调味剂的添加量分别微调为蜂蜜2.0%、蔗糖8.0%、柠檬酸0.3%，此时饮料的最高感官评分是94分，与所预期的分值接近，说明通过响应面设计方法对调配剂配方进行优化处理具有可靠性。
2.8 多糖的含量
采用上述最佳工艺条件：黄原胶0.06%、CMC-Na 0.15%、β-环状糊精0.4%、蜂蜜2.09%、蔗糖8.11%、柠檬酸0.29%，制备芦笋-平菇发酵型饮料，测得饮料中多糖含量是6.40 mg/mL。
2.9 饮料成分检测
平菇多糖中单糖组分色谱图见图8，氨基酸组分见图9，饮料中组分含量测定结果见图10。
图8 平菇多糖中单糖组分的高效液相色谱图
Fig.8 High performance liquid chromatogram of monosaccharide components in Pleurotus ostreatus polysaccharides
图9 氨基酸组分高效液相色谱图
Fig.9 High performance liquid chromatography of amino acids
图10 饮料成分检测结果
Fig.10 Detection results of beverage composition
从图10可以看出，饮料多糖含葡萄糖、甘露糖等6种单糖，葡萄糖含量最高。Yang等[22]发现平菇多糖的单糖成分由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和阿拉伯糖组成，以葡萄糖为主；Daba等[23]研究平菇菌丝体中的多糖组成，发现除葡萄糖以外，还含有半乳糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖，其中葡萄糖占比最高。本研究饮料与Yang等相比，缺少鼠李糖，与Daba等相比，缺少木糖，其余组成成分则相同。
饮料中的矿物质元素主要为Ca、Mg、Zn、Se等，Mg的含量高达160 mg/kg，Se元素含量最少为0.01mg/kg。关云静等[24]对绿芦笋进行营养成分研究发现含有多种矿物质元素，其中K、Ca、Mg、Fe等元素含量较高，赖姗姗等[25]研究不同平菇营养成分发现Ca、Zn含量较高，与本文研究结果基本一致。
饮料中富含精氨酸、丝氨酸、甘氨酸等17种氨基酸。其中丝氨酸含量最高，为3 040 mg/kg，呈鲜味氨基酸天冬氨酸、谷氨酸含量占3.48%，9种药效氨基酸含量高达53.07%，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为58.49%，接近联合国粮食和农业组织和联合国世界卫生组织提出的理想蛋白质（60%以上）标准，必需氨基酸与氨基酸总量比值为36.90%，和理想蛋白质（40%左右）较为接近，高于鸡蛋（32.00%）、大豆（32.01%）、核桃（32.63%）和花生（34.93%），低于牛奶（40.17%），说明制备的芦笋-平菇发酵型饮料口感鲜美，营养价值高。田颖刚[26]等研究芦笋欠开发部位发现各部位必需氨基酸含量在27.56%至35.36%。与本文研究结果基本一致。
3 结论
通过进行稳定剂单因素试验，3种稳定剂的最佳配方：黄原胶为0.06%，CMC-Na为0.15%，β-环状糊精为0.4%。调味剂单因素和响应面试验确定最佳配方：蜂蜜2.09%，蔗糖8.11%，柠檬酸0.29%，此时饮料感官鉴评评分最高，为94.88分；每两个因素间的交互作用对饮料口感影响的大小为：蔗糖和柠檬酸＞蜂蜜和柠檬酸＞蜂蜜和蔗糖。
饮料多糖含量为6.4 mg/mL，其单糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，葡萄糖含量最高，为282 579.42 mg/kg；饮料中含有钙、镁、锌3种矿物质元素，镁元素含量最高，为160 mg/kg。氨基酸种类齐全，必需氨基酸与非必需氨基酸的比值为58.49%。
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