芒果（Mangifera indica Linnaeus）是漆树科芒果属植物的果实，产于热带、亚热带。我国是芒果主要生产国之一，资源丰富[1]。在加工过程中，芒果除了制成干果、罐头外，占芒果总质量20%～60%的果皮和果核一般都被丢弃或用作饲料，造成了极大的浪费和环境污染。通过对芒果的大量研究，发现芒果富含多种酚类物质，而90%的多酚位于工业废弃物芒果核中，果核多酚具有很高的研究价值[2-4]。植物多酚具有清除体内自由基、抗脂质过氧化、预防心血管疾病、延缓机体衰老、预防癌症等生物活性[5-7]。如白藜芦醇、槲皮素、茶多酚等可以提高机体内源性抗氧化防御能力，从而保护机体免受氧化应激损伤[8-10]。Zhi等[11]通过研究昆仑雪菊提取物，发现雪菊多酚能够抑制小鼠肝脏受氧化应激损伤。目前，植物多酚的提取方法主要有溶剂浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法等。超声辅助提取，是利用“空穴作用”破坏植物细胞壁，使得多酚释放，因其温度较低，可以最大程度保持多酚的生物活性[12]。因此，寻找超声辅助提取芒果核多酚的最佳工艺条件具有重要意义。同时，多酚活性是其功能性质的重要体现，研究芒果核多酚抑菌活性可在一定程度上反映超声波辅助提取条件下多酚的生物功能。
因此，本文以芒果核为原料，研究芒果核多酚超声波辅助提取的最佳工艺条件，并从抑菌活性方面评价芒果核多酚的生物活性，以期为芒果的进一步高效开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干燥芒果核：市售；没食子酸、无水碳酸钠、无水乙醇（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；牛肉浸膏：上海德榜化工有限公司；细菌学蛋白胨、技术琼脂：广州市鸿洲实验器材科技有限公；其它试剂均为普通分析纯。大肠杆菌、枯草芽孢杆菌：东莞理工学院微生物实验室。
1.2 仪器与设备
KG-400DE型数控超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；SHZ-D（Ш）型循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；JA1003型电子精密天平：湖南力辰仪器科技有限公司；752N型紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；YM50型高压蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；LRH-250生化培养箱：上海一恒仪器有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台：苏州安泰公司；DFY-1000C小型高速万能粉碎机：大德药机生产厂家。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
将购买的芒果核用小型高速万能粉碎机粉碎，过200目筛，自封袋分装后置于干燥器中备用。
1.3.2 芒果核多酚提取
芒果核多酚提取参照康超等[4]方法，并稍作修改。精确称取预先干燥、粉碎的芒果核粉末2 g，按照料液比 1∶20（g/mL）、乙醇浓度 60%、超声功率 320 W、超声时间60 min，超声萃取芒果核多酚，萃取液3 500 r/min离心10 min后抽滤，于45℃真空旋转蒸发至约5mL，蒸馏水定容至10 mL，得芒果核多酚提取液。
1.3.3 芒果核多酚含量测定
没食子酸标准曲线的制备：方法参照参考文献[13-14]略加修改。准确称取没食子酸5 mg，加入到50 mL容量瓶中，定容，摇匀，得到浓度为0.1 mg/mL的没食子酸标准液。分别取没食子酸标准液0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL于具塞试管中，用蒸馏水补足体积到5 mL。然后分别加入福林酚试剂1.0 mL，充分振荡后静置3 min～4 min。往各具塞试管中加入75 g/L Na2CO3溶液2 mL，50℃恒温水浴反应5 min后取出，降至室温（25℃），于760 nm处测定其吸光度值，以不加没食子酸标准液为参比。以没食子酸质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：y=21.424x-0.005 1，式中y为吸光度值，x为没食子酸质量，相关系数为0.999 6。
图1 没食子酸标准曲线
Fig.1 Gallic acid concentration-absorbance value of the standard curve
芒果核多酚含量测定：取0.2 mL提取液（可作适当稀释），用去离子水补至1 mL，同标准曲线的操作测定芒果核样品多酚含量，结果以每克芒果核粉末中所含没食子酸当量表示（mg GAE/g）。每个样品做3组平行，结果以平均值±标准偏差表示。
1.3.4 芒果核多酚提取单因素试验
1.3.4.1 料液比的筛选
准确称取芒果核粉末 2 g，以料液比 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）分别加入 60%乙醇溶液，于超声功率320 W超声60 min，按1.3.2方法提取多酚，测定多酚含量，并计算多酚提取得率，确定适宜料液比。
1.3.4.2 乙醇浓度的筛选
准确称取芒果核粉末 2 g，以料液比 1∶20（g/mL）分别加入20%、40%、60%、80%乙醇溶液，于超声功率320 W超声60 min，按1.3.2方法提取多酚，测定多酚含量，并计算多酚提取得率，确定适宜乙醇浓度。
1.3.4.3 超声时间的筛选
准确称取芒果核粉末 2 g，以料液比 1∶20（g/mL）加入60%乙醇溶液，于超声功率320 W分别超声60、80、100、120 min，按1.3.2方法提取多酚，测定多酚含量，并计算多酚提取得率，确定适宜超声时间。
1.3.4.4 超声功率的筛选
准确称取芒果核粉末 2 g，以料液比 1∶20（g/mL）加入60%乙醇溶液，分别于超声功率160、240、320、400 W超声60 min，按1.3.2方法提取多酚，测定多酚含量，并计算多酚提取得率，确定适宜超声功率。
1.3.5 正交试验
以单因素结果为参考，对料液比、乙醇浓度、超声时间、超声功率进行四因素三水平试验，以芒果核多酚得率为指标，用L9（34）正交试验确定最佳提取工艺。
1.3.6 芒果核多酚抑菌活性试验
采用滤纸圆片法测定芒果核多酚对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌生长的抑制作用。将已灭菌的直径为5 mm小滤纸片分别浸入浓度为0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/mL的芒果核多酚溶液，每个样品浸入3张小滤纸片。浸透18 h后，将滤纸片贴入均匀涂布大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的牛肉膏蛋白胨琼脂平板中，将平板倒置放入恒温箱，37℃培养24 h，用游标卡尺测定抑菌圈直径。抑菌能力以抑菌圈的直径表示，抑菌圈越大，表明抑菌效果越强。同时试验以无菌蒸馏水为空白对照。
1.3.7 数据处理
所有结果均表示为平均值±标准偏差（
±SD），并采用SPSS 20.0软件进行单因素ANOVA分析和Duncan多重比较分析，P<0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 芒果核多酚提取工艺研究
2.1.1 料液比对芒果核多酚得率的影响
料液比是影响提取效率的重要因素，适当的料液比不仅能使得提取效率增高，也可减少浪费和节省成本。料液比对芒果核多酚得率的影响见图2。
图2 料液比对芒果核多酚得率的影响
Fig.2 The effect of solid-liquid ratio on the yield of mango core polyphenols
从图2可知，随着料液比的降低，芒果核多酚得率逐渐增大，在料液比为 1∶40（g/mL）时，得率达到最大，当料液比进一步降低，得率下降。其原因可能是溶剂不足时原料中酚类物质提取不充分，随着溶剂增多，多酚溶出率增加，当溶剂达到一定值时，多酚基本溶出[15]。此时增加溶剂多酚溶出率不再改变，而溶剂过量时蒸发时间太长，可能导致多酚在溶剂蒸发时损失。因此，本试验确定1∶40（g/mL）为最佳提取料液比。
2.1.2 乙醇浓度对芒果核多酚得率的影响
研究表明，不同来源多酚因其组成不同，起抗氧化作用的物质结构和性质也不同[16-17]，导致在不同极性溶剂中的分散程度差异。水的极性比乙醇大，不同浓度的乙醇极性不同。乙醇浓度对芒果核多酚得率的影响见图3。
图3 乙醇浓度比对芒果核多酚得率的影响
Fig.3 The effect of ethanol concentration on the yield of mango core polyphenols
从图3可知，随着乙醇浓度的增加，芒果核多酚得率先增加后降低，在乙醇浓度为40%时多酚提取得率达到最大，继续增加乙醇浓度提取率开始下降。这可能与芒果核多酚的组成及溶剂的性质有关。因此，本试验确定40%乙醇为最佳溶剂浓度。
2.1.3 超声时间对芒果核多酚得率的影响
超声时间比对芒果核多酚得率的影响见图4。
图4 超声时间比对芒果核多酚得率的影响
Fig.4 The effect of extraction time on the yield of mango core polyphenols
由图4可知，随着超声时间的增加，芒果核多酚提取得率先升高后降低，在超声时间为100 min时，得率达到最大，当超声时间进一步增加，得率开始显著下降。这可能是因为随着超声时间的延长，温度升高，破坏了多酚结构，从而导致多酚得率下降。因此，本试验确定最佳超声时间为100 min。
2.1.4 超声功率对芒果多酚得率的影响
超声功率比对芒果核多酚得率的影响见图5。
图5 超声功率比对芒果核多酚得率的影响
Fig.5 The effect of ultrasonic power on the yield of mango core polyphenols
由图5可知，在160 W～320 W范围内，随超声功率的增加，多酚得率提高，当功率达到320 W时，得率达到最大，而继续增大超声功率时得率却降低。这可能是由于随着功率的增加，超声波的空化效应和机械效应能量不断增加，加强了细胞内物质的扩散及溶解，增强多酚的释放，使得多酚得率升高。当超声功率达到320 W时，多酚已基本析出，而超声功率过大时可能破坏多酚结构，使得多酚得率下降。因此，本试验确定最佳超声功率为320 W。
2.1.5 正交试验
根据单因素试验结果，采用L9（34）正交试验确定最佳提取工艺，试验设计见表1。以多酚提取得率为指标，通过试验方案对得率的数据进行分析，结果见表2。
表1 正交试验设计的因素及水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal test design
水平D超声功率/W 1 1:35 35 80 280 2 1:40 40 90 320 3 1:45 45 100 360因素A料液比/（g/mL）B乙醇浓度/%C超声时间/min
表 2 L9（34）正交试验结果
Table 2 L9（34）orthogonal test program and results
试验号 因素 多酚得率/%A B C D 1 1 1 1 1 8.18 2 1 2 2 2 7.69 3 1 3 3 3 7.98 4 2 1 2 3 7.51 5 2 2 3 1 7.79 6 2 3 1 2 7.63 7 3 1 3 2 8.06 8 3 2 1 3 7.79 9 3 3 2 1 7.88Ⅰ 23.85 23.75 23.60 23.86Ⅱ 22.93 23.27 23.08 23.38Ⅲ 23.74 23.49 23.83 23.28 K1 7.95 7.92 7.87 7.95 K2 7.64 7.76 7.69 7.79 K3 7.91 7.83 7.94 7.76 R 0.30 0.07 0.17 0.16 T=70.52
由表2可知，料液比、超声时间、超声功率、乙醇浓度对超声波辅助提取芒果核多酚的影响的主次顺序为料液比（A）＞超声时间（C）＞超声功率（D）＞乙醇浓度（B）。其中，对得率的影响因素料液比＞提取时间＞乙醇浓度与微波辅助提取中一致[18]。从芒果核多酚的提取得率可知，超声提取的最佳工艺条件为A1B1C1D1，即料液比为 1∶35（g/mL）、乙醇浓度为 35%、超声时间为80min、超声功率为280W，此条件下多酚得率为8.18%。
2.2 芒果核多酚的抑菌活性研究
芒果核多酚对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌生长繁殖的抑制作用如表3所示。
表3 芒果核多酚对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果
Table 3 The mango core polyphenols antibacterial activity test results（mm，n=3）
注：同列相同字母间表示无显著差异（P>0.05），不同字母表示有显著差异（P<0.05）；同行*表示显著差异，P<0.05；#表示极显者差异，P<0.01；-表示无抑菌效果；+表示有抑菌效果。
芒果核多酚浓度/（mg/mL）大肠杆菌 枯草芽孢杆菌抑菌效果 抑菌圈直径/cm 抑菌效果 抑菌圈直径/cm 0- 5±0.00a - 5±0.00a 0.025 - 5.13±0.04a - 5.09±0.02a 0.050 + 6.04±0.17b + 5.16±0.02b#0.100 + 6.88±0.03c + 5.66±0.08c#0.200 + 7.50±0.07d + 7.11±0.15d*0.400 + 8.71±0.21e + 8.53±0.26eimages/BZ_67_1886_2607_1899_2641.png
由表3可知，当芒果核多酚浓度达到0.05 mg/mL时，芒果核多酚对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有显著抑制作用（P<0.05），且抑菌圈直径随多酚浓度的增加而增大。多酚浓度为0.05 mg/mL～0.2 mg/mL时，芒果核多酚抑制枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径显著低于大肠杆菌（P<0.05），而多酚浓度为0.400 mg/mL时，两者抑菌圈直径无显著差异（P>0.05）。这表明，芒果核多酚浓度为0.050 mg/mL～0.200 mg/mL时对大肠杆菌的抑制作用强于枯草芽孢杆菌，而多酚浓度为0.400 mg/mL时对二者抑制作用相当。综上，芒果核多酚浓度大于0.050 mg/mL时具有显著抑菌活性，且对大肠杆菌的抑制作用强于枯草芽孢杆菌。这与文献报道芒果核多酚具有一定抑菌活性相一致[18-19]。另外，研究报道，芒果核多酚具有较强的抗氧化活性[20]，其抑菌活性可能与其抗氧化活性具有一定的相关性。
3 结论
本试验采用超声波辅助提取芒果核多酚，通过单因素及正交试验确定最佳提取工艺为：料液比1∶35（g/mL），超声时间 80 min，乙醇浓度 35%，超声功率280 W，该条件下芒果核多酚的提取率为8.18%。通过进一步对芒果核多酚活性的研究，发现芒果核多酚浓度大于0.050 mg/mL时具有显著抑制大肠杆菌和枯草芽孢杆菌活性，且对大肠杆菌的抑制作用强于枯草芽孢杆菌。本文研究结果可在一定程度上为芒果核的进一步利用提供理论依据。
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