硒是人体必需的微量元素，其不仅是谷胱甘肽过氧化物酶、碘甲腺原氨酸脱碘酶、硒磷酸酯合成酶等代谢酶活性中心组成部分，还具有清除自由基、调节免疫系统、保护心血管等作用[1-3]。人体中硒的摄入主要来源于日常饮食，但日常饮食中摄入硒含量不能满足55 μg/d的推荐摄入量[4-5]。因此，可通过增加食品中硒含量来补充硒的摄入量。硒的补充形式主要有无机硒和有机硒两种，有机硒相比无机硒具有生物利用度高和低毒等特性[1，3]。因此，寻找准确、科学、廉价且高效的补硒方法是当今的研究热点。
研究表明，一些乳酸菌能快速积累无机硒并将无机硒转化为纳米硒及有机硒[2，5]，这表明乳酸菌可作为将硒输送至发酵食品中的良好载体。此外，富硒乳酸菌具有抗氧化、抗突变和抗癌等多种生物活性[2，6]。因此，人们对开发富硒乳酸菌发酵食品越来越感兴趣。
沙棘、胡萝卜和黑枣广泛种植于我国北方地区，三者的果实中富含多种碳水化合物、氨基酸、维生素、脂肪酸和多种微量元素，并含有大量的黄酮和多酚等生物活性物质[7-9]。这三者通常都被生食或榨汁，但由于其涩味明显而不被人们所接受，亟需加大三者的综合加工，提高产品的附加值。利用富硒乳酸菌发酵果蔬汁不仅可以改善果蔬制品的口感和风味，还有助于提高果蔬制品的功能特性[3]。
目前，对于乳酸菌发酵果蔬的研究报道较多，但对以沙棘、胡萝卜和黑枣为原料发酵复合果蔬汁的研究鲜有报道，仍不清楚富硒乳酸菌对该复合果蔬汁的影响。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是食品发酵中常用的发酵剂，具有富集硒的潜力[10]。因此，本研究以沙棘汁、胡萝卜汁和黑枣汁为主要原料，通过接种富硒植物乳杆菌、植物乳杆菌和自然发酵制备3种发酵复合果蔬汁。对发酵复合果蔬汁的理化特性、多酚类物质及抗氧化活性进行评价，为生产高品质富硒发酵果蔬汁提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙棘汁：吕梁野山坡食品有限责任公司；胡萝卜汁、黑枣汁：福建绿泉食品有限公司；植物乳杆菌（L.plantarum）：茂名职业技术学院食品与药品工程微生物实验室保藏。
乳酸细菌液体培养基：北京索莱宝科技有限公司；无水亚硫酸钠、亚油酸、铁氰化钾、亚硒酸钠、硝酸铝、福林酚、氢氧化钠、无水氯化铁（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。乙酸、富马酸、草酸、柠檬酸、苹果酸、莽草酸、乳酸、丙酮酸、琥珀酸标准品（色谱纯）：国家食品药品检测中心；3，3'-二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）、2，4，6-三 （2-吡啶基） 三嗪[2，4，6-tris（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]（分析纯）：上海阿拉丁试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
GL-21M型高速冷冻离心机：长沙平凡仪器厂；ZHJH-C1109C型无菌操作台：上海智城分析仪器制造有限公司；AB-50型电子分析天平、FE28型pH计：瑞士Mettler-Toledo公司；UV1800型紫外可见光分光光度计：日本岛津公司；1260型高效液相色谱仪：美国Agilent公司。
1.3 试验方法
1.3.1 菌悬液制备
将植物乳杆菌接入含2 μg/mL亚硒酸钠的乳酸细菌液体培养基进行活化，置于37℃培养箱培养24 h，5000 r/min离心15 min，弃去上清液，将沉淀重溶于无菌生理盐水中，得到活菌数为2.2×107CFU/mL左右的菌悬液。
1.3.2 复合果蔬汁发酵工艺
将沙棘汁、胡萝卜汁和黑枣汁按一定比例混合后装入已灭菌玻璃瓶中，分别接种植物乳杆菌（记为LP组）和富硒植物乳杆菌（记为LP-Se组），接种量为2%菌悬液，混匀后37℃静置发酵36 h。另外，设置自然发酵的复合果蔬汁（记为NF组）作为发酵对照。每隔6 h收集样品，置于-20℃保存待测。
1.3.3 乳酸菌菌落总数的测定
参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》测定乳酸菌菌落总数[11]。
1.3.4 理化特性的测定
使用pH计直接测定pH值；参照GB5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》测定总滴定酸的含量（以乳酸计）[12]；参照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》测定还原糖的含量（以葡萄糖计）[13]；用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白的含量[14]。
采用高效液相色谱法测定复合果蔬汁中有机酸的含量[15]。取适量复合果蔬汁发酵液，4 500 r/min离心10 min，将离心后的上清液稀释5倍微滤（0.45 μm）过膜后待用。采用Agilent C18色谱柱，进样量为10 μL，流动相为甲醇-水-磷酸溶液（A 相体积比 80∶15∶5；B相体积比为 5∶90∶5），柱温 30 ℃，柱流速 0.5 mL/min，检测波长210 nm[15]。流动相梯度洗脱条件（时间，体积比）：0～5 min，A∶B=0∶100；15 min，A∶B=10∶90；45 min～55 min，A∶B=100∶0；65 min～75 min，A∶B=0∶100[15]。
1.3.5 硒含量的测定
硒含量测定参考YANG等[16]的方法，吸取适量复合果蔬汁发酵液，加入混合酸（硝酸∶高氯酸=9∶1，体积比）进行消化，直至变为无色，将消化后的溶液与10 mL 0.5%DAB混合，最后使用10 mL甲苯萃取混合物，萃取3次，于420 nm下测定萃取物吸光度。
1.3.6 总黄酮和总多酚含量的测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮的含量[17]，总黄酮含量用芦丁当量表示；采用Folin-Ciocalteu比色法测定总多酚的含量[18]，总多酚含量用没食子酸当量表示。
1.3.7 体外抗氧化能力的测定
脂质过氧化抑制率测定参考CHEN等[19]的方法，0.5 mL复合果蔬汁发酵液与0.5 mL磷酸盐缓冲溶液（0.02 mol/L，pH 7.4）、1 mL亚油酸乳化液和1 mL硫酸亚铁溶液（0.05 mol/L）混合，置于37℃水浴保温1.5 h，依次加入0.2 mL 4%三氯乙酸，0.2 mL 0.4%丁基化羟基甲苯和2 mL 0.8%硫代巴比妥酸，置于沸水浴加热25 min，冷却后4500 r/min离心10 min收集上清液，于532 nm下测定吸光度，纯水代替样品作空白对照。脂质过氧化抑制率计算公式如下。
脂质过氧化抑制率/%=[1-A1/A0]×100
式中：A0和A1分别为空白和样品的吸光度值。
亚铁离子螯合率测定参考CHEN等[19]的方法，0.5mL复合果蔬汁发酵液与0.1 mL 1%抗坏血酸、0.1 mL 0.4%硫酸亚铁、1 mL氢氧化钠（0.2 mol/L）混合，置于37℃水浴反应25 min，4500 r/min离心10 min收集上清液，取0.2 mL上清液与2 mL 1%O-菲啰啉混合，静置10 min后于510 nm下测定吸光度，纯水代替样品作空白对照。亚铁离子螯合率计算公式如下。
亚铁离子螯合率/%=[1-A1/A0]×100
式中：A0和A1分别为空白和样品的吸光度值。
1.4 数据分析
每组试验均重复3次，采用GraphPad Prism 8软件绘图，使用SPSS 19.0软件进行方差分析（ANOVA），用于分析组间差异。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌菌落总数的动态变化
复合果蔬汁发酵过程中乳酸菌菌落总数的动态变化见表1。
表1 复合果蔬汁发酵过程中乳酸菌菌落总数的动态变化
Table 1 Dynamic changes in the total numbers of colonies during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
注：表中数据为平均值±标准差；不同字母和数字表示相应乳酸菌菌落总数在不同发酵时间的含量存在显著差异（n=3，P<0.05）；大写字母代表NF组；小写字母代表LP组；数字代表LP-Se组。
发酵时间/h 乳酸菌菌落总数/[lg（CFU/mL）]NF组 LP组 LP-Se组0 2.57±0.08F 5.65±0.31e 5.65±0.315 6 2.61±0.11F 6.12±0.28d 6.34±0.424 12 2.94±0.14E 7.05±0.24c 7.45±0.383 18 3.78±0.18D 7.52±0.21b 7.89±0.3423 24 4.53±0.22C 7.95±0.36ab 8.31±0.371 30 5.29±0.29B 8.21±0.42a 8.37±0.411 36 6.12±0.36A 8.15±0.35a 8.28±0.4512
由表1可知，NF组乳酸菌菌落总数呈持续上升的趋势，说明乳酸菌可在以沙棘、胡萝卜和黑枣为原料的复合果蔬汁中迅速生长繁殖。与NF组相比，LP组和LP-Se组乳酸菌菌落总数随发酵时间延长均呈先增大后基本保持稳定的变化趋势，与吴万林等[20]研究结果相一致。LP-Se组在发酵12 h时乳酸菌菌落总数迅速增加至7.45 lg（CFU/mL），远高于LP组的7.05 lg（CFU/mL）。此外，LP-Se组乳酸菌菌落总数在发酵24 h就能达到稳定，可达8.31 lg（CFU/mL），而LP组则需要30 h才能达到稳定，其乳酸菌菌落总数只有8.21 lg（CFU/mL）。上述结果表明，富硒乳酸菌在果蔬汁中的生长繁殖速率要高于不富硒的乳酸菌，进一步说明少量的硒可以促进乳酸菌的生长，与CHEN等[19]的结论一致。
2.2 理化特性和有机酸含量的动态变化
复合果蔬汁发酵过程中理化特性的动态变化见图1。
图1 复合果蔬汁发酵过程中理化特性的动态变化
Fig.1 Dynamic changes in the physiochemical properties during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
（A）pH 值；（B）总酸；（C）还原糖；（D）可溶性蛋白；同组字母和数字不同表示显著差异（P<0.05）。
根据图1（A）可知，3种不同发酵工艺均会使复合果蔬汁的pH值在发酵过程中呈逐渐下降的变化趋势，与XU等[3]研究结果相一致。其中，LP-Se组的下降速率最快，从pH4.07下降至pH3.49；且LP-Se组在发酵36 h的pH值最低，与表1菌落总数的结果相一致，说明硒会促进乳酸菌的生长，增加发酵体系中营养物质的消耗，产生酸性代谢产物，加速复合果蔬汁的酸化。如图1（B）所示，复合果蔬汁中总酸含量的变化与pH值的变化相反，这是由于原料中有机酸的溶出及乳酸菌在生长代谢中产生了乳酸等有机酸[7]。NF组的总酸含量由最初的2.72 g/L增加至12.21 g/L，而LP组和LP-Se组的总酸含量始终高于NF组，其发酵36 h时总酸含量分别是NF组的1.61倍和1.67倍，说明接种乳酸菌可加速发酵体系总酸的积累，缩短发酵时间。由图1（C）可知，除NF组还原糖含量呈先上升后逐渐下降的变化趋势外，LP-Se组和LP组还原糖含量大致呈先上升后迅速下降再维持稳定的变化趋势。还原糖含量上升是由于乳酸菌生长代谢过程中产生的酶可将复合果蔬汁中其它类型糖类化合物分解成还原糖，从而增加发酵初期还原糖含量。随着发酵的不断进行，乳酸菌会利用发酵体系中还原糖作为碳源快速生长繁殖，进而导致还原糖含量迅速下降。而发酵后期还原糖含量不再降低，说明乳酸菌的生物量达到瓶颈，与表1菌落总数的结论相吻合。在发酵36 h时，LP-Se组和LP组还原糖含量相当。如图1（D）所示，复合果蔬汁中可溶性蛋白含量随着发酵的不断进行而逐渐减少，与王越等[15]研究结果一致，可能是由于可溶性蛋白能与脂肪、纤维素等结合形成致密且不溶于水的大分子物质，且发酵环境的不断酸化也会导致可溶性蛋白在大量H+水解作用下分解为多肽和氨基酸[15]。在发酵36 h时，LP-Se组可溶性蛋白含量为0.25 g/L，低于LP组（0.3 g/L）和NF组（0.55 g/L）。
复合果蔬汁中有机酸含量也会影响产品的口感及风味[21]。复合果蔬汁发酵过程中有机酸的变化见表2。
表2 复合果蔬汁发酵过程中有机酸的动态变化
Table 2 Dynamic changes in the content of organic acids during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
注：表中数据为平均值±标准差；ND表示没有检出；不同字母和数字表示相应有机酸在不同发酵时间的含量存在显著差异（P<0.05）；大写字母代表NF组；小写字母代表LP组；数字代表LP-Se组。
分组 发酵时间/h浓度/（g/L）乙酸 草酸 苹果酸 柠檬酸 乳酸 琥珀酸 莽草酸 富马酸 丙酮酸NF 0 0.24±0.03D 0.17±0.02E 3.06±0.33A 0.24±0.10F NDG 0.34±0.04B 0.13±0.02B 0.01±0.01B 0.07±0.02C 6 0.26±0.03D 0.18±0.03E 2.97±0.31A 0.31±0.03F 0.07±0.01F 0.35±0.02B 0.14±0.03AB 0.01±0.01B 0.08±0.03BC 12 0.28±0.03CD 0.24±0.02E 2.64±0.28B 0.52±0.05E 1.37±0.12E 0.37±0.03B 0.15±0.02A 0.01±0.01B 0.09±0.04BC 18 0.34±0.04C 0.31±0.03D 2.31±0.25BC 0.96±0.08D 2.48±0.23D 0.39±0.04AB 0.17±0.02A 0.02±0.01AB 0.10±0.04BC 24 0.41±0.04BC 0.43±0.03C 1.98±0.18C 1.52±0.13C 4.52±0.54C 0.42±0.04A 0.14±0.04AB 0.02±0.01AB 0.12±0.04AB 30 0.49±0.05B 0.55±0.05B 1.76±0.14CD 2.14±0.21B 6.79±0.67B 0.44±0.04A 0.12±0.02B 0.03±0.01A 0.13±0.03A 36 0.61±0.04A 0.67±0.05A 1.49±0.13D 2.78±0.27A 9.25±0.96A 0.45±0.04A 0.12±0.04B 0.03±0.01A 0.15±0.04A LP 0 0.24±0.03e 0.17±0.02d 3.06±0.33a 0.24±0.03e NDf 0.34±0.04d 0.13±0.02b 0.01±0.01b 0.07±0.02c 6 0.35±0.04e 0.29±0.03d 2.74±0.23b 0.98±0.14e 3.07±0.31e 0.37±0.04d 0.12±0.02b 0.01±0.01b 0.09±0.01c 12 0.52±0.06d 0.58±0.07c 2.13±0.21c 2.31±0.27d 8.92±0.67d 0.39±0.04c 0.12±0.02b 0.02±0.01ab 0.12±0.02b 18 0.66±0.07c 0.65±0.07b 1.21±0.19d 4.94±0.44c 12.21±1.07c 0.45±0.04bc 0.12±0.03a 0.02±0.01a 0.18±0.03a 24 0.89±0.12b 0.89±0.09ab 0.67±0.06e 7.04±0.59b 15.62±1.17b 0.53±0.05b 0.15±0.03a 0.04±0.02a 0.17±0.03a 30 1.09±0.19a 0.86±0.08a 0.57±0.07f 7.34±0.66a 16.33±1.14a 0.62±0.05a 0.14±0.02a 0.03±0.01ab 0.15±0.03ab 36 1.06±0.17a 0.85±0.08a 0.47±0.05f 7.52±0.62a 16.07±1.02a 0.60±0.06a 0.14±0.02a 0.02±0.01ab 0.17±0.03ab LPSe 0 0.24±0.036 0.17±0.025 3.06±0.331 0.24±0.036 ND6 0.34±0.044 0.13±0.022 0.01±0.013 0.07±0.023 6 0.43±0.045 0.34±0.054 2.36±0.222 1.27±0.125 3.47±0.425 0.36±0.034 0.14±0.022 0.02±0.0123 0.09±0.033 12 0.52±0.054 0.59±0.053 1.52±0.183 2.59±0.354 10.86±1.014 0.41±0.033 0.14±0.031 0.04±0.0242 0.15±0.032 18 0.79±0.073 0.76±0.082 0.85±0.094 4.95±0.543 13.84±1.183 0.47±0.0423 0.15±0.031 0.06±0.021 0.27±0.051 24 0.94±0.112 0.86±0.091 0.54±0.065 7.48±0.811 16.35±1.432 0.53±0.052 0.16±0.031 0.06±0.021 0.32±0.031 30 1.14±0.241 0.89±0.071 0.44±0.0456 7.37±0.641 17.68±1.251 0.56±0.051 0.14±0.0212 0.04±0.0112 0.27±0.0312 36 1.23±0.211 0.87±0.081 0.41±0.046 6.84±0.832 16.82±1.021 0.55±0.0412 0.13±0.022 0.03±0.012 0.25±0.032
根据表2可知，发酵前胡萝卜、沙棘和蓝莓复合果蔬汁中苹果酸含量最高，其含量可达3.06 g/L，占整个有机酸比例的70%。但随着发酵的不断进行，复合果蔬汁中苹果酸含量逐渐减少。在发酵36 h时，LP组和LP-Se组中苹果酸含量分别为0.47 g/L和0.41 g/L。此外，在发酵36 h时，3种不同工艺发酵复合果蔬汁中莽草酸、富马酸和丙酮酸含量相当，而草酸、乙酸、柠檬酸、乳酸和琥珀酸含量有较大差异。在发酵36 h时，LP组中柠檬酸含量为7.52 g/L，相比LP-Se组，提高了9.94%。随着发酵的不断进行，复合果蔬汁中乳酸含量的变化最为显著，而在复合原料（未发酵）中未能检测到乳酸，表明乳酸菌发酵有助于乳酸的积累。在发酵36 h时，NF组中乳酸含量仅为9.25 g/L，而LP-Se组和LP组的乳酸含量分别为16.82 g/L和16.07 g/L，表明接种乳酸菌可加速复合果蔬汁乳酸的积累，且硒可以改善乳酸菌的代谢，从而产生更多的乳酸。综上，乳酸含量是影响复合发酵果蔬汁口感的主要因素之一。
2.3 硒含量的动态变化
LP-Se组复合果蔬汁发酵过程中硒含量的动态变化见图2。
图2 接种富硒植物乳杆菌发酵复合果蔬汁发酵过程中硒含量的动态变化
Fig.2 Dynamic changes in the concentration of selenium during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice by inoculating of selenium-enriched L.plantarum
数字不同表示显著差异（P<0.05）。
如图2所示，LP-Se组在发酵过程中硒含量呈持续增加的变化趋势，这是由于发酵初期硒大部分都存在于接种的富硒植物乳杆菌细胞内，而随着这些富硒植物乳杆菌的生长代谢，其中绝大部分的硒会随着微生物的自溶而溶于复合果蔬汁中，从而增加复合果蔬汁中硒的含量，且这些硒是以纳米硒和有机硒的形式存在，生物利用率高且毒性低。发酵0～24 h，复合果蔬汁中硒含量迅速增加，从0增加至19.77 μg/mL；随后缓慢增加，发酵36 h达到20.97 μg/mL，说明富硒乳酸菌发酵是提高发酵食品中硒含量的一种有效方法。
2.4 总黄酮和总多酚的动态变化
多酚类化合物是果蔬汁中主要的天然抗氧化剂。复合果蔬汁发酵过程中总黄酮和总多酚的动态变化见图3。
图3 复合果蔬汁发酵过程中总黄酮和总多酚的动态变化
Fig.3 Dynamic changes in total flavonoids contents and total polyphenol contents during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
（A）总黄酮；（B）总多酚；同姐字母和数字不同表示显著差异（P<0.05）。
由图3（A）可知，3种不同发酵工艺均会增加复合果蔬汁中总黄酮含量，NF组和LP组中总黄酮含量随发酵时间的增加而持续增加，LP-Se组中总黄酮含量则呈先增加后趋于稳定的变化趋势。乳酸菌在生长过程中会产生各种酶，这些酶会促进纤维素、果胶等大分子物质的分解，使大量黄酮类化合物溶于发酵体系中，从而增加果蔬汁中总黄酮的含量[22]。LP组中总黄酮含量在发酵36 h达到0.31 g/L；LP-Se组在发酵24 h基本达到稳定，其含量为0.34 g/L。结合表1的结果可知，硒会增加植物乳杆菌的生物量，增加产酶能力，促进纤维素及果胶的降解，从而积累更多的总黄酮。如图3（B）所示，NF组中总多酚含量在发酵36 h达到8.02 g/L；而LP组和LP-Se组中总多酚含量均在发酵30 h达到最高，分别为9.92 g/L和10.92 g/L。随着发酵过程中单体酚类化合物的不断合成，会促进多酚含量的增加，而酚类物质的氧化与生成也是同时进行的，到了发酵后期，生成速率降低，而氧化过程仍在继续，导致酚类物质的减少[15，23]。在发酵36 h时，相比LP组，LP-Se组中总多酚含量提高了10.08%，表明硒不仅会增加酚类物质的合成，同时也会降低酚类物质的氧化，从而增加复合果蔬汁多酚类生物活性物质的含量。
2.5 体外抗氧化能力的动态变化
复合果蔬汁发酵过程中脂质过氧化抑制率和亚铁离子螯合率的动态变化见图4。
图4 复合果蔬汁发酵过程中体外抗氧化能力的动态变化
Fig.4 Dynamic changes in antioxidant activity during the fermentation process of compound fruit and vegetable juice
（A）脂质过氧化抑制率；（B）亚铁离子螯合率；同组字母和数字不同表示显著差异（P<0.05）。
由图4可知，除NF组的脂质过氧化抑制率和亚铁螯合率呈持续上升的变化趋势，LP组和LP-Se组则均呈先上升后缓慢下降的变化趋势。LP组和LP-Se组的脂质过氧化抑制率均在发酵24 h达到最高，其中LP-Se组的脂质过氧化抑制率为21.57%，是LP-Se组的1.3倍。随着发酵的不断进行，在发酵36 h时，NF组和LP组的脂质过氧化抑制率无差别，低于LP-Se组（20.52%）。此外，LP-Se组和LP组的亚铁离子螯合率则分别在发酵24 h和30 h基本达到稳定，分别为43.13%和38.03%。在发酵36 h时，LP-Se组的亚铁离子螯合率为43.17%，分别比LP组和NF组提高了15.72%和26.08%。这可能与乳酸菌的代谢产物及复合果蔬汁中活性物质的变化有关[24]。综上可知，硒的存在有助于提高复合果蔬汁的体外抗氧化能力。这个结果可能与植物乳杆菌可将无机硒生物转化为有机硒和纳米硒有关，且有机硒和纳米硒具有抗氧化的潜力[25]。
3 结论
本试验比较3种不同发酵工艺（自然发酵、接种植物乳杆菌发酵和接种富硒植物乳杆菌发酵）对复合果蔬汁理化特性、有机酸、多酚类化合物、硒含量及体外抗氧化能力的影响。与自然发酵相比，接种发酵，尤其是接种富硒植物乳杆菌的发酵，对抗氧化能力的贡献更大。接种富硒植物乳杆菌可使发酵后的复合果蔬汁获得最高的乳酸菌菌落总数和总酸、乳酸、总黄酮、总多酚含量。此外，接种富硒植物乳杆菌的复合果蔬汁中硒含量可达20.97 μg/mL。本研究用富硒乳酸菌发酵传统食品和果蔬汁，无疑是增加蔬菜、水果和硒的日常摄入量的一种简单、有效且安全的方法。
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