腌制具有延长产品保质期、赋予产品特殊风味与色泽、提高产品品质的特点[1]，是我国水产品主要的加工方式之一。目前，传统的腌制方法主要包括干腌和湿腌。干腌方式操作方便，设备要求简单，但产品多存在含盐量高、鱼肉质地硬和贮藏过程脂肪容易酸败变质等问题。湿腌虽然可以提高腌鱼制品的均匀性，但是腌制时间长、鱼肉容易腐败，无法保证腌鱼制品的食品安全是其最大的问题[2]。新型的腌制技术如脉冲电场技术[3]、冲击波技术[4]、超高压腌制处理技术[5]和超声波腌制技术[6]等与传统的腌制方式相比较，能够显著提高食盐的渗透速率，加快腌制速率，同时对于产品的色泽、保水性和嫩度等感官品质具有积极影响，但是目前多停留在实验室阶段，而且很多技术的作用机理尚不明确，是影响其工业化应用推广的主要原因。静态变压腌制[7]和真空滚揉腌制技术[8]作为目前主要的腌制方式而受到关注，产品多处于真空状态下进行腌制是其主要的特点。前期研究表明，真空腌制是目前普遍认为能够加快腌制速度的方法，其主要原理在于真空状态下，物料容易出现膨胀，导致细胞间距增大，结构松弛，在细胞内外压差和毛细管共同作用下，腌制液更容易渗入组织内部，实现快速腌制[9-11]。目前的研究多集中在加快腌制速率和腌制效果对产品品质的影响，对于真空腌制过程中水分迁移与组织结构的变化研究较少。
低场核磁共振技术（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）是指磁场强度在0.5 T以下的核磁共振，是可以通过测定肉品中氢原子核在磁场中的弛豫特性来确定肉品中水分的不同状态，结合氢离子密度图像，分析水分的分布情况，是一种无损、快速的检测方式[12]。目前已经被广泛应用于肉制品加工。卞瑞姣等[13]在对秋刀鱼腌干过程的研究中发现，利用低场核磁共振技术，能够与秋刀鱼在腌干过程的水分状态与变化情况建立良好的相关性，经腌制和干制处理，鱼肉水分活度降低，同时改变水分存在状态，主要表现在腌制过程中鱼肉组织的部分结合水与自由水转化为不易流动水，而经干制处理后，鱼肉不易流动水出现流失与转化现象。龙门等[14]在对咸鸭蛋腌制过程的研究中发现，低场核磁共振技术能够很好地反映鸭蛋腌制过程中的水分分布状态，有助于分析产品凝胶形成的原因，同时与产品的凝胶特性、质构和持水性等指标具有良好的相关性。扫描电镜是一种利用高能聚焦电子束扫描样品表面，从而获得样品信息的电子显微镜[15]，目前扫描电镜已经被广泛用于食品行业，刘欢等[16]利用扫描电镜研究金钱腱加工后的肌纤维和结缔组织的微观结构，结果显示在不同的加工条件下，五香金钱腱整体显示出松散破碎的肌纤维状态，不同程度的破碎会影响肉的嫩度。杨万根等[17]利用扫描电镜研究乾州板鸭加工过程中肌纤维的微观结构变化，结果显示板鸭的肌肉纤维在经过腌制和风干后，从原本排列紧密变得松散，纤维断裂，且肌纤维的数量减少，肌纤维间的孔隙增大。
本文选用真空方式对草鱼进行腌制，以鱼肉的NaCl含量和水分含量为主要指标，结合核磁共振和电镜等技术，探讨真空腌制过程中鱼肉组织水分迁移的情况以及组织结构的变化特点，为探讨真空腌制机理提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
草鱼：市售，草鱼当天宰杀，沿草鱼脊骨分割成2份，在与脊骨垂直方向，将鱼肉分割为长×宽×高=2 cm×2 cm×2 cm 的肉块，每块鱼肉质量为（15±2）g，覆盖一层保鲜膜，于4℃冰箱中冷藏备用。氯化钠：天津市化学试剂研究所有限公司；硝酸银：广州市金珠江化学有限公司立新化工厂；亚铁氰化钾：天津市广成化学试剂有限公司；铬酸钾、乙醇：天津市大茂化学试剂厂；戊二醛（25%）：天津市福晨化学试剂厂。以上化学试剂均为分析纯。
1.2 仪器设备
MesoMR23-60H核磁共振成像分析仪：苏州纽迈分析仪器股份有限公司；TM3030台式电子显微镜：日本高新技术公司；BTP-3LES冷冻干燥机：美国SPScientific公司；TE124S电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；RE-5205旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-DIII循环水真空泵：巩义予华仪器有限公司；SD60制冰机：广州市广绅电器制造有限公司；TESTO-176T4温度记录仪：德图仪器国际贸易（上海）有限公司。
1.3 试验方法
利用4℃、6%的低温盐水作为腌制介质，在不同腌制时间（40、80、120、160、200、240、280 min）下，选用真空腌制方式（真空度0.08 MPa）对鱼肉进行处理。提前将2 L、4℃、6%的盐水与鱼肉一同放入真空瓶中，并浸没在含8 L、4℃载冷剂（乙醇∶乙二醇∶水=3∶3∶4，体积比）作为冷却液的循环装置中，调整真空瓶高度，保证真空瓶内外液面齐平，安装相应的温度探头并启动真空装置进行腌制；在试验过程中，为了保证温度的稳定性，利用低温恒温槽对载冷剂进行恒温，保证冷却液温度控制在（4±2）℃；为了减少温度带来的影响，鱼肉和盐水均提前冷却至4℃。每组试验样品共12块鱼肉，取样测定NaCl含量和水分含量，并进行核磁与扫描电镜检测，每组试验平行3次，数据结果用平均值±方差表示。
1.4 指标测定
1.4.1 NaCl含量的测定
NaCl含量测定参考国标GB 5009.44—2016《食品安全国家标准食品中氯化物的测定》[18]的银量法。计算方法见式（1）。
式中：X1为食品中氯化钠的含量，%；0.035 5为1.00 mL硝酸银标准滴定溶液（浓度1.000 mol/L）的换算系数；c1为硝酸银标准滴定溶液的浓度，mol/L；V1为用于滴定的试样体积，mL；V2为滴定试样时消耗的硝酸银标准滴定溶液体积，mL；V0为空白试验消耗的硝酸银标准滴定溶液体积，mL；V为样品定容体积，mL；m为试样质量，g。
1.4.2 水分的测定
水分的测定参考国标GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[19]的直接干燥法。试样中的水分含量按式（2）进行计算。
式中：X2为试样中水分的含量，%；m1为称量瓶和试样干燥前的质量，g；m2为称量瓶和试样干燥后的质量，g；m3为称量瓶的质量，g；100为单位换算系数。
1.4.3 核磁共振测定方法
将完成腌制的鱼肉，置于低场核磁共振设备中用于测量自旋-自旋弛豫时间。该仪器配备0.5 T永磁体，对应的质子共振频率为21.718 MHz，测试温度为32℃，测试方法参考GENG等[20]的方法。将样品放入核磁共振60 mm的石英管中，应用60 mm直径的射频线圈（90 °和 180 °脉冲时间分别是 5.4、11.6 μs，回声时间为 0.2 ms），收集自旋回讯磁振脉冲（carr-purcell-meiboom-gill，CPMG）衰减信号。CPMG参数设置如下：等待时间4 500 ms，模拟获得20 db，信号增幅3，回波数量18 000，扫描频率4，前置放大增幅1。通过4次扫描重复获得8 000个回波数据。两次扫描之间的充盈时间为4 s，每次测量重复3次[21]。使用MultiExp Inv分析软件进行CPMG衰减曲线的分布式多指数拟合（1 000 000次）。使用SRIT软件对弛豫数据进行多指数拟合分析获得改进的拟合。从峰位置计算每个过程的峰顶时间，并通过积累积分确定每个相应弛豫时间的弛豫峰面积[21]。
质子密度图像通过自旋回波（spin echo，SE）成像序列获取。扫描参数如下：视角为100 mm×100 mm；切片厚度2.5 mm，切片间距1 mm，重复采样等待时间1 500 ms，回波时间20 ms，累加次数16，读取大小256，相位大小192。采用NIUMAG核磁共振影像系统Ver 1.0软件对样品的质子密度图像进行处理[20]。
1.4.4 扫描电镜测定方法
参考康大成[22]的方法，并稍作修改，取鱼肉中心位置，沿脊背垂直方向切出厚度约为1 mm、宽度为1 cm的样品，先将样品浸没在4℃、2.5%戊二醛中固定2 h，经50%、70%、80%、90%乙醇溶液梯度脱水（15 min/次），再将样品放置在100%乙醇溶液中脱水3次（30min/次），然后，将上述样品放置在100%叔丁醇中置换3次（3 min/次），最后，将样品放入-80℃预冻24 h，冷冻干燥5 h，置于干燥皿中，进行电镜扫描。
1.5 数据处理
测定和分析结果分别采用Origin9.0、GraphPad Prism 6.0、NIUMAG核磁共振影像系统Ver 1.0软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 鱼肉真空腌制过程中NaCl和水分含量的变化趋势
腌制时间对鱼肉NaCl和水分含量的影响见图1。
图1 鱼肉真空腌制过程中腌制时间对NaCl和水分含量的影响
Fig.1 Influence of salting time on NaCl and water content during vacuum salting of fish
由图1可知，在真空腌制过程中，鱼肉NaCl含量随着腌制时间延长呈现持续上升最后下降的趋势。在0～40 min，NaCl含量上升速度较快，在40 min时达0.77%，随后NaCl含量持续上升，并在240 min时达到最大值，为1.48%。而鱼肉的水分含量随腌制时间延长则呈现持续下降的趋势，由最初的78.0%下降至75.5%，其原因是真空腌制过程，鱼肉组织中的空气和水分被不断地排出，组织发生膨胀，导致细胞间距增大，有利于盐分的渗透，而NaCl含量增大，又进一步促进水分排出组织，这与高凯日等[23]的研究结果一致。
2.2 鱼肉真空腌制过程中弛豫时间的变化趋势
腌制时间对鱼肉弛豫时间的影响见图2。
图2 鱼肉真空腌制过程中腌制时间对弛豫时间的影响
Fig.2 Influence of salting time on relaxation time during vacuum salting of fish
T21、T22分别代表强、弱结合水弛豫时间；T23代表束缚水弛豫时间；T24代表自由水弛豫时间。
由图2可知，随着腌制时间的延长，不同状态的水分弛豫时间均发生变化，说明在腌制过程中，盐含量增加会明显改变样品中水的存在形式。随着腌制时间延长（0～120 min），强结合水弛豫时间（T21）变化不明显，弱结合水弛豫时间（T22）呈先上升后下降最后保持平缓的趋势，且在120 min达到最大值。束缚水弛豫时间（T23）的变化与T22的变化一致，也是呈现先上升后下降，最后保持平缓的趋势，同样在120 min处达到最大值。自由水弛豫时间（T24）的变化则是先平缓上升，再突然出现陡升（120 min～160 min），最后又基本稳定（160 min～280 min）。其原因可能是在 0～120 min的腌制时间内，鱼肉组织中逐渐渗入带电的金属离子，与带相反电荷的蛋白质基团相互作用，从而形成一个电子双电层，削弱了蛋白质间的分子斥力[24]，能够降低蛋白质的表面疏水性，蛋白质开始出现聚集，从而导致了自由水、束缚水和结合水的自由度增加，这与孔保华等[25]的研究结论相一致；而120 min后出现拐点可能与鱼肉腌制过程中鱼肉中蛋白质的进一步聚集、交联，最后形成溶胶有关，溶胶的形成反而会导致自由水的自由度增加，而束缚水和结合水的自由度下降，这与裴志胜等[26]和林婉瑜等[27]研究结论相一致。
2.3 鱼肉真空腌制过程中弛豫峰面积比例的变化趋势
腌制时间对弛豫峰面积比例的影响见图3。
图3 鱼肉真空腌制过程中腌制时间对弛豫峰面积比例的影响
Fig.3 Influence of salting time on relaxation peak area ratio during vacuum salting of fish
P21、P22分别代表强、弱结合水弛豫峰面积比例；P23代表束缚水弛豫峰面积比例；P24代表自由水弛豫峰面积比例。
由图3可知，随着腌制时间的延长，鱼肉的弛豫峰面积比例（P21、P22、P23、P24）均发生变化。对于结合水弛豫峰面积比例（P21、P22）而言，随着腌制时间的延长，均出现整体上先上升后下降再上升的变化，这说明在腌制过程中存在部分结合水与其它水分相互转变的情况。而对于束缚水弛豫峰面积比例（P23）而言，随着腌制时间延长出现上下波动的变化趋势，在120 min时P23最大，说明此时有大量其它的水分形式转变为束缚水，随后P23逐渐减小，说明此时束缚水又转变为其它水分存在形式。对于自由水弛豫峰面积比例（P24）而言，随着腌制时间延长，出现先上升后下降，而后再上升的变化。值得注意的是，P24出现锐减变化的时间点（120 min）正是P23出现剧增变化及P22出现锐减变化的时间点，其原因可能是此时的盐溶性蛋白质进一步溶出并与水发生水化作用，形成溶胶状态，使得其中一部分水分被束缚在溶胶中，而另一部分水分则被排挤出溶胶组织外，这与上述3种水分的弛豫时间变化所表现的水分自由度变化相一致。
2.4 鱼肉真空腌制过程中核磁成像（magnetic resonance imaging，MRI）的变化
鱼肉真空腌制过程中MRI的变化趋势见图4。
图4 鱼肉真空腌制过程MRI的变化图
Fig.4 Changes of MRI during fish vacuum salting
MRI是核磁共振技术的主要成像工具，不仅可以确定食品样品中水分的分布，还可以显示鱼肉真空腌制在不同腌制时间组织内部结构的变化[20]。水的分布可以用伪彩色图像来表示，其中红色表示高的质子密度，即具备更好自由度；蓝色代表低质子密度，即具备低自由度[28-29]。从图4中可以看出，随着腌制时间延长，质子密度图像MRI颜色由蓝色向黄色转变，说明鱼肉组织的自由度持续上升，而且黄色区域在120 min开始明显增大，达到160 min后，黄色区域呈现最大化，并基本维持不变，可能是因为在120 min开始，蛋白质发生疏水性聚集，形成溶胶，此时结合水自由度达到最大，大量结合水转变为束缚水，与弛豫时间、弛豫峰面积比例变化的结论一致。
2.5 鱼肉真空腌制过程中微观结构的变化
图5是鱼肉样品经戊二醛固定冻干后的扫描电镜图。
图5 鱼肉真空腌制过程中微观结构的变化图
Fig.5 Changes in the microstructure of fish during vacuum salting
由图5可知，初始的鱼肉样品的肌纤维结构呈明显的丝状，而且纤维组织间结构紧致，40 min的鱼肉样品与初始的样品结构相似，纤维组织清晰且结构紧致，其原因可能是此时鱼肉腌制时间较短，盐分较少进入组织，因此能较好地保留肌纤维丝状结构。当腌制时间达到80 min时，样品肌纤维开始出现膨胀，纤维组织结构被打开，肌纤维的丝状结构相对清晰，120 min的样品与80 min的较相似，但膨胀程度和结构松散程度较80 min明显，肌纤维丝状结构开始模糊，其原因可能是，在真空腌制过程，盐分大量进入组织中，降低蛋白质的疏水性，显著提高蛋白质的溶解性，水化能力增强，当腌制时间达到160 min时，样品的肌纤维已经充分膨胀，纤维结构开始呈片状出现，而且随着腌制时间延长（160 min～280 min），肌纤维结构完全呈片状出现，与姜晶丹等[30]的研究结果一致，其原因可能是，随着盐分含量持续增加，加剧蛋白质间的交联，水化能力增强，导致纤维细胞内粗丝和细丝膨胀，细胞的间隔变小从而连接形成片状，此结论与弛豫时间、核磁成像等结论一致。
3 结论
本文对鱼肉真空腌制过程中的水分迁移与组织结构变化进行研究。结果表明：随着腌制时间延长，鱼肉组织的NaCl含量持续上升，而水分含量持续下降，而随着盐分的不断渗入，鱼肉组织蛋白质因疏水性持续下降而逐渐聚集并形成溶胶，导致水分的自由度发生变化，并出现明显的水分迁移现象，鱼肉组织的肌纤维由最初清晰、紧致的丝状结构逐渐发生膨胀、松散最终变成片状。综上所述，鱼肉在真空腌制过程中的水分迁移和组织结构变化与鱼肉腌制过程中的凝胶化呈现很好的相关性。该结论为真空腌制技术在鱼肉腌制的应用上提供了相关理论基础。采用透射电镜技术与电泳技术探讨腌制过程组织肌纤维的Z带的变化以及蛋白质组成的变化仍然是下一步研究的重点。
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