色素是一类重要的食品添加剂，在工业生产、农业、日常生活等领域有较为广泛的应用。色素一般分为合成色素和天然色素两类[1]。合成色素由于存在较多的负面作用，比如致癌等，因此应用受限[2-3]。天然色素主要源自动植物，无毒或低毒，且存在一些特殊的功能性，因此应用广泛，尤其是在食品工业等领域[4-5]。荸荠皮作为荸荠副产物，含有较多的天然色素[6-8]。荸荠皮色素属于黄酮类色素，具有消炎、抗衰老、抗氧化等作用[9-10]。中国的荸荠年产量可达百万吨以上，而在加工和食用后被削下来的荸荠皮可占到荸荠鲜果总质量的26%左右，因此开发利用荸荠皮色素具有得天独厚的优势，可产生较大的经济和社会价值，符合环保的社会理念，对于荸荠资源的综合利用具有一定的意义[6]。
色素有诸多的提取方法，其中，有机溶剂直接浸提法[11-13]效率较低；酶法[14-15]后处理复杂，且酶易失活；超临界二氧化碳法[16-17]所用设备较复杂，不适合于工业化生产。内部沸腾法[18-19]、超声波法[20-21]均具有操作简便、快速高效省时等优点，且内部沸腾法的机理和超声波的空化效应对色素提取的作用具有较好的一致性，均有利于色素从荸荠皮组织中解吸。超声波辅助内部沸腾法可使超声波法的空化效应和内部沸腾达到很好的协同，加快植物组织内外的对流速度，提高提取效率，因此本文采用超声波辅助内部沸腾法提取荸荠皮色素，以期获得较好的提取效果。此外，考察荸荠皮色素的稳定性、抗氧化性等性能，可为其开发利用提供基本的参考依据。
1 仪器与试剂
1.1 试剂及材料
荸荠：市售；95%乙醇、无水乙醇、冰乙酸、乙酸钠晶体、氢氧化钠、邻二氮菲、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁晶体、30%双氧水（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；DFT-100型手提式万能高速粉碎机：温岭市林大机械有限公司；BSA822型电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；KQ-400KDB型高功率数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A型低速大容量离心机：上海安亭科学仪器厂；SHBB95型水循环多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；T-6型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；PHS-3E型酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
2 试验方法
2.1 荸荠皮色素的提取和测定
参考文献方法[22-23]，称取1.00g荸荠皮粉末于100mL三颈瓶中，加入5 mL 95%乙醇，并在25℃左右温度下浸泡30 min，然后加入不同温度的50%乙醇溶液，迅速安装好装置，在约38 kPa压力下和不同功率下进行超声波处理，并在不同温度下回流一定时间。冷却后，离心获取上清液，并过滤上清液。将滤液转移至50 mL容量瓶中，用30%乙醇溶液定容。
用移液管从容量瓶中移取2.00 mL液体到比色管中，并用蒸馏水稀释至10 mL。根据参考文献数据[23]，在430 nm下测定稀释后液体吸光度。根据朗伯-比尔定律，浓度和吸光度之间存在正相关的关系，因此本试验利用测得的吸光度值大小来衡量提取的荸荠皮色素浓度大小。
2.2 单因素试验
为了初步优化荸荠皮色素的提取工艺条件，采用每一组固定液料比、功率、温度和时间4个因素中3个因素，只改变其中1个因素的方法，先后研究液料比[15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1（mL/g）]、功率（160、200、240、280、320、360、400 W）、温度（40、50、60、70、80 ℃）和时间（10、20、30、40、50 min）对色素提取效果的影响，重复2.1的操作步骤。
2.3 响应面试验
根据单因素试验的结果，选择4个因素中影响相对显著的3个因素，每个因素3个水平，以吸光度为响应值，设计响应面模型，并按照此模型安排试验。
2.4 色素稳定性测定
在响应面试验得出的最佳条件下，按照2.1的方法获得50 mL提取液，分别从提取液中移取2.00 mL溶液到 8 支比色管中，然后分别用 pH 值为 3、4、5、6、7、8、9、10的磷酸缓冲溶液稀释到10 mL，25℃左右温度下放置3 h，在430 nm波长下测定其吸光度值。
2.5 羟基自由基清除率的测定
在优化后的最佳条件下，按照2.1的方法获得50mL提取液， 分别从此提取液中移取 0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL溶液到6支比色管中，分别用蒸馏水稀释至10 mL，然后按照文献方法[8，24]测定其对羟基自由基的清除率。
2.6 试验数据统计分析
本试验的每组试验条件均作了3次平行试验，然后取其平均值。单因素试验的结果采用origin 75软件绘图。响应面试验采用Box-Behnken软件设计模型，试验结果采用Design Expert 8.0软件分析处理。
3 结果与分析
3.1 单因素试验
3.1.1 液料比的影响
液料比对荸荠皮色素吸光度的影响见图1。
从图 1 可看到，当液料比小于 45∶1（mL/g）时，荸荠皮色素吸光度随液料比的增加而增加，在液料比45∶1（mL/g）时达到最大值；液料比超过 45∶1（mL/g）后，随溶剂增多，吸光度逐渐减小。出现该变化的原因是：溶剂用量的增加会使能溶解的色素的量增加，但也会增加溶解浸出的脂溶性杂质的量，脂溶性杂质过多时会造成荸荠皮组织内外对流通道的堵塞，进而影响色素的浸出[23]。 因此，选择最佳液料比为45∶1（mL/g）。
图1 液料比的影响
Fig.1 Effect of liquid-solid ratio
3.1.2 功率的影响
功率对荸荠皮色素吸光度的影响见图2。
图2 功率的影响
Fig.2 Effect of power
从图2可看到，当功率小于280 W时，色素吸光度随功率增加而增大，最大值出现在280 W处；功率超过280 W后，随功率增大，吸光度逐渐降低。出现该变化趋势的原因是：功率的增大会使超声波的空化效应等作用增强，这对色素提取来说是有利的；但功率过高时会使色素稳定性下降，进而变质，不利于色素提取[25]。因此，选择最佳功率为280 W。
3.1.3 温度的影响
温度对荸荠皮色素吸光度的影响见图3。
从图3可看到，当温度低于60℃时，随温度升高色素吸光度逐渐增大；当温度高于60℃时，随温度升高色素吸光度逐渐减小。出现该变化趋势的原因是：温度的升高会使分子运动更活跃，内部沸腾更剧烈，和超声波空化效应协同起来对荸荠皮中未解吸的色素的冲击作用更强，促进色素解吸进入溶液中，这对色素提取来说是有利的；但温度过高时，分子运动的过分活跃会造成荸荠皮组织内外对流通道的堵塞，过高的温度还会使超声波空化效应被一定程度削弱，影响色素浸出，同时也会导致溶剂的挥发量增加[25-28]。因此，选择提取的最佳温度为60℃。
图3 温度的影响
Fig.3 Effect of temperature
3.1.4 时间的影响
时间对荸荠皮色素吸光度的影响见图4。
图4 时间的影响
Fig.4 Effect of time
从图4可看到，当时间小于20 min时，色素吸光度随时间延长而逐渐增大，吸光度最大值出现在20 min处；超过20 min后，随时间延长，吸光度逐渐降低。出现该变化趋势的原因是：时间的延长能使荸荠皮中的色素更充分解吸并浸入溶液中，使组织内外色素的浓度更趋于平衡；但时间过长时，在超声波作用下已经浸出的部分色素会发生分解变质，也会导致更多的溶剂挥发，使已溶解的色素以固体形式重新析出。因此，选择提取的最佳时间为20 min。
3.2 响应面试验
根据单因素试验的结果，功率对色素提取的直接影响相对较小，因此选择固定功率为280 W，以液料比（A）、温度（B）、时间（C）为因素，以色素吸光度（R）为响应值，进行Box-Behnken响应面设计，因素水平如表1所示，试验设计及结果如表2所示。
表1 响应面试验因素水平
Table 1 Factors and levels in response surface experiments
编码水平 因素A液料比/（mL/g）B温度/℃C时间/min-1 40∶1 50 10 0 45∶1 60 20 1 50∶1 70 30
表2 响应面试验方案及结果
Table 2 Response surface experimental design arrangement and results
试验号 A液料比 B温度 C时间 吸光度1-1 -1 0 0.850 2 0 0 0 0.919 3 0-1 1 0.859 4 1 0-1 0.913 5 0 1 1 0.373 6 1-1 0 0.910 7 0 0 0 0.930 8-1 0 -1 0.899 9-1 1 0 0.614 10 1 1 0 0.652 11 0 0 0 0.924 12 0 -1 -1 0.814 13 1 0 1 0.815 14 -1 0 1 0.673 15 0 1 -1 0.789 16 0 0 0 0.905 17 0 0 0 0.892
利用Design Expert 8.0软件分析试验结果得出模型的二次回归方程为：R=0.91+0.032A-0.13B-0.087C-0.0055AB+0.032AC-0.12BC-0.021A2-0.14B2-0.068C2。
该拟合的二次模型的方差分析如表3所示，各因素交互作用的响应面图和等高线如图5～图7所示。
图5 液料比和温度的等高线和响应面图
Fig.5 Contour plot and response surface diagram of liquid-solid ratio and temperature
表3 拟合模型的方差分析
Table 3 Analysis of variance of the fitted model
注:***P＜0.001为差异高度显著；**P＜0.01 为差异极显著；*P＜0.05为差异显著。
来源 平方和 自由度 均方 F P模型 0.36 9 0.040 166.51 ＜0.000 1***A 8.065×10-3 1 8.065×10-3 33.63 0.000 7***B 0.13 1 0.13 526.45 ＜0.000 1***C 0.060 1 0.060 251.76 ＜0.000 1***AB 1.210×10-4 1 1.210×10-4 0.50 0.500 5 AC 4.096×10-3 1 4.096×10-3 17.08 0.004 4**BC 0.053 1 0.053 221.54 ＜0.000 1***A2 1.791×10-3 1 1.791×10-3 7.47 0.029 2*B2 0.079 1 0.079 328.92 ＜0.000 1***C2 0.020 1 0.020 82.08 ＜0.000 1***残差 1.679×10-3 7 2.398×10-4失拟项 7.327×10-4 3 2.442×10-4 1.03 0.467 9纯误差 9.460×10-4 4 2.365×10-4总离差 0.36 16
从表3的方差分析可知，模型P＜0.000 1，影响高度显著，失拟项P=0.467 9＞0.05，影响不显著，说明使用该模型来优化荸荠皮色素的提取工艺条件是合适的。该模型的R2=0.995 4，且变异系数C.V.%较低，为1.92%，说明该模型可靠性和精度较高。
一次项中A（液料比）、B（温度）、C（时间）影响均高度显著，交互项和二次项中，BC、B2、C2影响高度显著，AC影响极显著，A2影响显著，AB影响不显著，表明各影响因素和响应值不是简单的线性关系。从F值还可看到各因素影响的主次顺序为：B>C>A。
从图5～图7可看到3个因素彼此之间存在交互作用，对色素提取液吸光度的影响不是简单的线性关系，从响应面图的曲线可看到：温度影响使曲线更陡峭，时间次之，液料比最为平缓，与方差分析的结果一致。
图6 液料比和时间的等高线和响应面图
Fig.6 Contour plot and response surface diagram of liquid-solid ratio and time
图7 温度和时间的等高线和响应面图
Fig.7 Contour plot and response surface diagram of temperature and time
另外，利用Design Expert 8.0软件还得出超声波辅助内部沸腾法提取荸荠皮色素的最佳工艺条件为：液料比 48.8∶1（mL/g），温度 55.64 ℃和时间 19.09 min。考虑到试验操作的实际情况，将该条件修正为：液料比 50∶1（mL/g），温度 60 ℃，时间 20 min，该条件下的理论预测值为0.921。此条件下5次平行验证试验的平均值为0.911，相对标准偏差1.59%，与理论值0.921的相对偏差为-1.09%。
3.3 稳定性试验
pH值对荸荠皮色素吸光度的影响如表4所示。
表4 pH值对色素稳定性的影响
Table 4 Effect of pH on stability of pigment
pH值 3 4 5 6 7 8 9 10吸光度 0.843 0.878 0.884 0.883 0.914 0.986 0.997 1.015
从表4可看到，相对于中性而言，酸性条件下色素提取液吸光度有一定程度的下降，碱性条件下提取液吸光度却明显增加。荸荠皮色素主要为黄酮类色素，黄酮的结构中存在大量的内醚键和酚羟基，酸性条件下荸荠皮色素黄酮结构中的部分内醚键发生了断裂，使其颜色变弱；而碱性条件下，黄酮结构中的酚羟基会转化为氧负离子，使其供电子能力增强，从而产生增色效果。
3.4 羟基自由基清除率
对色素提取液进行不同程度稀释后，所得溶液对羟基自由基清除率的测定结果如表5所示。
表5 色素对羟基自由基的清除率
Table 5 Clearing rate of pigment for hydroxyl radical
稀释后和稀释前的浓度比 0（蒸馏水） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0清除率/% 0 2.62 28.84 59.93 70.41 97.38
从表5中可看到随着溶液浓度增大，其对羟基自由基的清除率逐渐增大；当稀释液浓度达到原提取液0.6倍时，清除率就已大于50%，未经稀释的原液的羟基自由基清除率甚至可达97.38%，说明荸荠皮色素的黄酮结构赋予了其较强的抗氧化活性。
4 结论
本试验利用超声波辅助内部沸腾法提取荸荠皮色素，根据单因素试验和响应面试验优化得出最佳提取工艺条件为：超声波功率280 W，液料比 50∶1（mL/g），温度60℃，时间20 min，该条件下的理论预测值为0.921。此条件下5次平行试验的平均吸光度值为0.911（相对标准偏差为1.59%），与理论值0.921的相对偏差为-1.09%。
稳定性试验表明酸性条件下，色素吸光度有一定的下降；碱性条件下，色素吸光度有一定程度的增大。抗氧化活性研究表明，色素浓度越高对羟基自由基的清除率越大，本试验色素提取液对羟基自由基的清除率甚至可达97.38%，说明荸荠皮色素具有较强的抗氧化活性。这些结论为荸荠皮色素开发利用提供了一定的基本参考依据。
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