婺源皇菊，又称晓起皇菊。该菊花嗅之芬芳，余味甘甜，因其具有消解暑气、凝神养目等优良功效而广受欢迎。皇菊所含有活性物质主要是黄酮类[1]、菊花多糖[2]、挥发油类[3]、水溶性色素[4]等。而对其化学成分及功效的研究大多基于金丝皇菊[5]，婺源皇菊黄酮提取工艺优化及抗氧化活性仍缺乏相关研究。
植物黄酮的提取方法众多。楚红英等[6]采用乙醇溶剂法对菊花中总黄酮进行了提取研究；钟姣姣等[7]采用超声波辅助醇浸提法对菊花中总黄酮进行了提取研究；聂健[8]采用水浸提法对骨碎补中总黄酮进行了提取研究；翟硕莉等[9]采用超声波辅助水浸提法对苦菜中黄酮进行了提取研究。超声辅助水浸提法提取婺源皇菊黄酮还未见报道。乙醇提取虽然得率相对较高，但在提取过程中醇溶性蛋白质、油脂等杂质析出量大；选用水[10]作提取剂，安全无污染，且比醇提法节约成本；而超声波辅助提取法高效节能。本研究拟采用超声辅助水浸提法提取婺源皇菊总黄酮，利用NaNO2-Al（NO）3-NaOH显色法测定总黄酮含量，通过单因素试验和响应面法对提取工艺参数进行优化和分析，同时研究婺源皇菊总黄酮的抗氧化活性，旨在为婺源皇菊黄酮的开发和应用提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
干制婺源皇菊：采自婺源县江湾镇晓起村，用粉碎机粉碎成粉状，放置在阴凉干燥处待用。
芦丁：浙江树人大学生物与环境工程学院实验自制；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：上海麦克林生化科技有限公司；无水甲醇、30%过氧化氢：上海凌峰化学试剂有限公司；无水乙醇、水杨酸：天津市永大化学试剂有限公司；L-抗坏血酸（VC）、亚硝酸钠：成都市科龙化工试剂厂；硝酸铝：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠：杭州萧山化学试剂厂；硫酸亚铁：衢州巨化试剂有限公司；十二水合磷酸氢二钠：广州市金华大化学试剂有限公司；磷酸二氢钠：湖州湖试化学试剂有限公司；焦性没食子酸（邻苯三酚）：上海展云化工有限公司；盐酸：华东医药有限股份公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
YP502N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；ME204E电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；L6S紫外分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；KQ5200DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；750T多功能粉碎机：铂欧五金厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司。
1.3 试验方法
1.3.1 标准曲线法测定总黄酮含量
采用NaNO2-Al（NO）3-NaOH显色法，根据杜鹃等[11]的方法进行显色液的配制以及绘制标准曲线，修改如下，采用芦丁（0.2 mg/mL）为标准品溶液，在510 nm波长处测定吸光度值，标准曲线的横坐标为芦丁浓度（C），纵坐标为吸光度值（A）。通过对标准曲线进行最小二乘法回归可以得到线性方程：A=0.009 5C+0.023 8，r2=0.997 7。线性范围 0～0.1 mg/mL。
1.3.2 皇菊总黄酮提取液的制备
根据王佳妮等[12]的方法，修改如下：取适量婺源皇菊样品于三角瓶中，在室温25℃条件下，以蒸馏水为溶剂，按一定的液料比混合均匀，在一定的超声波时间和超声波功率的条件下提取皇菊总黄酮，经过滤得到的滤液即为皇菊总黄酮提取液。
1.3.3 提取液中总黄酮含量的测定
精密移取0.2 mL提取液，置于10 mL比色管中，以不加提取液为空白，后续操作与“1.3.1”相同，测定吸光度，参照标准曲线计算含量。
1.3.4 总黄酮得率的计算
式中：c为总黄酮得率，%；m1为皇菊总黄酮提取液的总黄酮质量，g；m2为皇菊原料的质量，g。
1.3.5 单因素试验
精确称取若干份1.00 g婺源皇菊样品，在室温25℃下分别置于锥形瓶中，按“1.3.2”方法以如下所列的参数制备提取液，然后根据“1.3.3”测定提取液总黄酮含量，并根据“1.3.4”计算总黄酮得率。
1.3.5.1 液料比对总黄酮得率的影响
固定超声时间为15 min，超声功率为200 W，考察液料比[5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）]对总黄酮得率的影响。
1.3.5.2 超声时间对总黄酮得率的影响
固定液料比为1.3.5.1中最佳液料比，超声功率为200 W，考察超声时间（10、15、20、25、30、35、40 min）对总黄酮得率的影响。
1.3.5.3 超声功率对总黄酮得率的影响
固定液料比为1.3.5.1中最佳液料比，超声时间为1.3.5.2中最佳超声时间，考察超声功率（120、140、160、180、200 W）对总黄酮得率的影响。
1.3.6 响应面试验设计优化提取工艺
对超声辅助水提取皇菊总黄酮进行响应面试验设计以及回归方程的方差分析。以总黄酮得率为响应值，液料比、超声时间、超声功率作为考察因素，在单因素试验结果的基础上，选取各个因素的3个表现较好的水平进行试验，对试验结果进行响应面分析，并进行重复试验来验证结果来确定最佳条件。试验因素水平及编码设计见表1。
表1 试验因素水平及编码设计
Table 1 Levels and codes of factors of response surface experiment
水平A液料比/（mL/g）B超声时间/minC超声功率/W-1 10∶1 25 160 0 20∶1 30 180 1 30∶1 35 200
1.3.7 提取液抗氧化活性测定
自由基清除反应是抑制氧化的过程之一，提取液对自由基的清除能力越强，其抗氧化活性越强。
1.3.7.1 DPPH自由基（DPPH·）清除能力
量取最佳条件下的提取液1.0 mL，根据张福欣等[13]的方法配制显色溶液，测定溶液在517 nm波长处的吸光度值As，分别以蒸馏水和无水乙醇为空白和对照，测定吸光度值A0和Ac。同时以同浓度的VC水溶液为对照。DPPH自由基清除率计算公式如下。
1.3.7.2 OH自由基清除能力（·OH）
采用Fenton反应。量取最佳条件下的提取液1.0mL，根据张福欣等[13]的方法配制显色溶液，测定溶液在510 nm波长处吸光度值A1。分别通过蒸馏水代替水杨酸和提取液，测定吸光度值A2和A3。同时以同浓度的VC水溶液作为对照。自由基OH清除率计算公式如下。
1.3.7.3 O2-自由基（O2-·）清除能力
采用邻苯三酚自氧化法。量取最佳条件下的提取液2.0 mL，根据钱天元等[14]的方法配制显色溶液，测定溶液在320 nm波长处的吸光度值A1。分别以超纯水代替邻苯三酚溶液为对照，以蒸馏水代替待测液为空白，测定吸光度值A2、A3。同时以同浓度的VC水溶液作为对照。O2-自由基清除率计算公式如下。
1.4 数据分析
Excel 2010软件用于计算平均值、标准偏差和单因素试验分析，Design-Expert.V8.0.6.1软件用于响应面试验设计与方差分析。所有试验重复3次。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 液料比对总黄酮得率影响
液料比对提取液总黄酮得率的影响结果见图1。
图1 液料比对总黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on yield of total flavonoids
由图1可知，随着加水量的增大，提取液总黄酮得率先上升后下降然后稳定，在总黄酮得率达到最大值时，液料比为20∶1（mL/g）。 随着加水量的增大，黄酮更容易溶出，提取液总黄酮得率随着加水量增大而上升；当加入的水量过多时，黄酮的结构可能会被破坏，总黄酮得率随着水量增大而下降；当加入的水量达到一定程度后，水中溶解的黄酮的量是稳定的，总黄酮得率趋于稳定。因此选择最佳液料比为20∶1（mL/g）。
2.1.2 超声时间对总黄酮得率的影响
超声时间对提取液总黄酮得率的影响结果见图2。
图2 超声时间对总黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on yield of total flavonoids
由图2可知，随着超声时间的延长，提取液总黄酮得率先上升后下降，在总黄酮得率达到最大值时，超声时间为30min。随着超声时间的增加，分子运动强烈，黄酮不断溶出，总黄酮得率上升；当超声时间延长到一定程度时，水中溶解的总黄酮的量是稳定的；超声时间再增加，溶解在水中的黄酮的结构可能会被破坏，总黄酮得率下降。因此选择最佳超声时间为30 min。
2.1.3 超声功率对总黄酮得率的影响
超声功率对提取液总黄酮得率的影响结果见图3。
图3 超声功率对总黄酮得率的影响
Fig.3 Effect of ultrasonic power on yield of total flavonoids
由图3可知，随着超声功率的增加，提取液总黄酮得率持续上升，总黄酮得率在200 W条件下达到最大值。这可能是因为超声功率增大，提取液中黄酮分子运动增强，超声波的空穴效应得到加强，使得黄酮不断溶出，总黄酮得率随着超声功率的增加而上升。而过大的超声功率可能会使黄酮遭到破坏，导致总黄酮得率下降。而200 W为仪器最大功率，因此选择最佳超声功率为200 W。
2.2 提取工艺的优化
2.2.1 响应面优化结果
根据单因素试验的结果选取各个因素对提取液总黄酮得率较高的3个水平，设计响应面试验，试验方案及结果见表2。
表2 试验方案及结果
Table 2 Design and results of response surface experiment
试验号 A液料比/（mL/g）B超声时间/min C超声功率/W Y总黄酮得率/%1 20∶1 30 180 3.549 2 10∶1 30 200 2.852 3 30∶1 35 180 3.398 4 30∶1 30 200 3.392 5 20∶1 35 160 3.121 6 10∶1 30 160 2.584 7 20∶1 25 200 3.506 8 20∶1 25 160 2.865 9 20∶1 35 200 3.45 10 10∶1 35 180 2.791 11 10∶1 25 180 2.746 12 20∶1 30 180 3.549 13 30∶1 30 160 3.003 14 20∶1 30 180 3.549 15 30∶1 25 180 3.549 16 20∶1 30 180 3.549 17 20∶1 30 180 3.549
运用Design Expert.V8.0.6.1软件，对表2中的试验结果进行数据处理，得到方差分析表，如表3所示。
根据表3可以得到以下预测模型：Y=3.55+0.26A+0.049B+0.20C+0.026AB+0.030AC-0.078BC-0.39A2-0.11B2-0.20C2。
表3 优化后模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：P值＜0.05为显著；P值＜0.01为极显著。
项目 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1.85 9 0.21 95.76 ＜0.000 1 极显著A 0.53 1 0.53 248.45 ＜0.000 1 极显著B 0.020 1 0.020 9.06 0.020 显著C 0.33 1 0.33 153.78 ＜0.000 1 极显著AB 2.76×10-3 1 2.76×10-3 1.28 0.29 不显著AC 3.66×10-3 1 3.66×10-3 1.70 0.23 不显著BC 0.024 1 0.024 11.31 0.012 显著A2 0.64 1 0.64 298.4 ＜0.000 1 极显著B2 0.054 1 0.054 24.88 0.001 6 极显著C2 0.17 1 0.17 78.86 ＜0.000 1 极显著残差 0.015 7 2.15×10-3失拟项 0.015 3 5.02×10-3 1.27 0.398 1净误差 0.00 4 0.00总离差 1.87 16
模型相关系数显示R2=0.991 9，决定系数显示R2Adj=0.981 6，该模型没有偏离实际情况，误差很小。模型极显著（P＜0.01），结果表明该模型可靠可行，可以用于预测婺源皇菊总黄酮得率。
由表3可知，整体模型达极显著水平（P值＜0.01）,一次项A、C以及3个二次项A2、B2和C2对总黄酮得率影响均达极显著水平，交互项BC达到显著水平。F值的大小与各个因素对提取液总黄酮得率影响的大小有关，影响次序依次为：液料比＞超声功率＞超声时间。
2.2.2 响应面分析
3个考察因素影响提取液总黄酮得率的程度以及因素两两之间的交互作用见图4～图6。
图4 液料比与超声时间交互作用对总黄酮得率的影响
Fig.4 Response of surface plots and contour plots for the effect of liquid-solid ratio and ultrasonic time on yield of total flavonoids
图5 液料比与超声功率交互作用对总黄酮提取率的影响
Fig.5 Response of surface plots and contour plots for the effect of liquid-solid ratio and ultrasonic power on yield of total flavonoids
图6 超声时间与超声功率交互作用对总黄酮提取率的影响
Fig.6 Response of surface plots and contour plots for the effect of ultrasonic time and ultrasonic power on yield of total flavonoids
考察因素影响总黄酮得率的程度可以通过响应曲面陡峭程度来反映。模型的响应曲面陡峭程度：液料比＞超声功率＞超声时间，表明各因素对总黄酮提取率的影响大小顺序为液料比＞超声波功率＞超声波时间，该结论与表3模型方差分析的结论一致。
考察因素两两之间交互作用的强弱程度可以通过等高线的形状来反映。如果两因素交互影响显著，则两者之间交互得到的等高线图趋于椭圆形，反之，则为圆形。由此，根据图4～图6可以看到，图6中超声时间与超声功率交互作用的等高线围成明显的椭圆形状，图4中液料比与超声时间交互作用的等高线近乎椭圆形，而图5中液料比与超声功率交互作用等高线是圆形。这也验证了超声时间与超声功率交互作用显著。
2.2.3 最佳提取工艺条件的验证
由Design-Expert.V8.0.6.1软件得到的分析结果，响应面优化总黄酮提取工艺的最佳条件为液料比23.54∶1（mL/g）、超声时间 30.4 min、超声功率 190.36 W。为方便进行试验操作条件控制，修正最佳条件为液料比 24∶1（mL/g）、超声时间 31 min、超声功率 200 W。 理论总黄酮得率为3.659%。进行最佳条件验证试验，总黄酮得率为3.641%，与预测模型得出的理论值相比较，偏差很小，该模型可靠可行，可以用于预测提取液总黄酮得率。
2.3 抗氧化活性评价
提取液的抗氧化活性试验结果见图7。
图7 提取液和VC水溶液对DPPH·、·OH、O2-·3种自由基的清除能力
Fig.7 Imperial chrysanthemum watersolution and VC watersolution on DPPH·,·OH,O2-·scavenging ability
在最佳条件下（浓度约0.170mg/mL），提取液对DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基的清除率分别为87.93%、51.76%、95.53%，而同浓度VC溶液对DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基的清除率分别为95.80%、69.94%、81.57%。提取液对DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基的清除率分别相当于同浓度下VC水溶液的91.78%、80.95%、117.10%。结果表明提取液抗氧化活性较好，与VC相近。
3 结论
婺源皇菊总黄酮最佳提取工艺为液料比24∶1（mL/g）、超声时间31min、超声功率200W，总黄酮得率为3.641%，该方法稳定可靠且条件温和，可用于提取皇菊中黄酮类物质。本研究揭示了婺源皇菊总黄酮具有与VC相近的良好的抗氧化活性，具有良好的发展前景。
[1] 谭林燕,刘潭,陈丽芬,等.皇菊叶总黄酮的提取工艺及其抗氧化作用研究[J].宜春学院学报,2016,38(9):13-16.
TAN Linyan,LIU Tan,CHEN Lifen,et al.Extraction of total flavonoid from leave of imperial chrysanthemum and its anti-oxidant activity[J].Journal of Yichun University,2016,38(9):13-16.
[2] 孟洁.金丝皇菊多糖提取、分离、结构及益菌活性研究[D].天津:天津科技大学,2018.
MENG Jie.Research on the extraction,separation,structure and biological activity of polysaccharide from imperial Chrysanthemum[D].Tianjin:Tianjin University of Science&Technology,2018.
[3] 胡文杰,邱修明,曾建军,等.皇菊不同部位挥发油化学成分比较分析[J].天然产物研究与开发,2015,27(7):1187-1193.
HU Wenjie,QIU Xiuming,ZENG Jianjun,et al.Comparative analysis of components of essential oils from different parts of imperial chrysa-nthemum[J].Natural Product Research and Development,2015,27(7):1187-1193.
[4] 胡洁芳,洪艳平,刘玉珍,等.皇菊水溶性色素树脂纯化工艺及其稳定性研究[J].粮油食品科技,2017,25(2):44-50.
HU Jiefang,HONG Yanping,LIU Yuzhen,et al.Study on resin purification process and stability of water-soluble pigments from chrysanthemum[J].Science and Technology of Cereals,Oils and Foods,2017,25(2):44-50.
[5]潘立超.金丝皇菊醇提物分离、结构分析及抗氧化活性研究[D].天津:天津科技大学,2018.
PAN Lichao.Separation,structure analysis and antioxidant activity of alcohol extract from imperial Chrysanthemum[D].Tianjin:Tianjin University of Science&Technology,2018.
[6] 楚红英,李瑜.菊花中总黄酮及铁含量的测定[J].江苏农业科学,2013,41(3):293-295.
CHU Hongying,LI Yu.Determination of total flavonoids and iron in chrysanthemum[J].Jiangsu Agricultural Sciences,2013,41(3):293-295.
[7]钟姣姣,李万林.超声波辅助提取菊花中总黄酮工艺条件研究[J].皮革与化工,2014,31(3):17-20,33.
ZHONG Jiaojiao,LI Wanlin.Study on ultrasonic-assisted extraction technology of flavonoid from Chrysanthemum[J].Leather and Chemicals,2014,31(3):17-20,33.
[8]聂健.骨碎补总黄酮水提工艺的优化[J].轻工科技,2019,35(8):48-49.
NIE Jian.Optimization of water extraction technology of totalflavonoids from bone fragments[J].Light Industry Science and Technology,2019,35(8):48-49.
[9]翟硕莉,张秀丰.超声波辅助水提苦菜中黄酮类物质的工艺[J].食品研究与开发,2014,35(24):63-65.
ZHAI Shuoli,ZHANG Xiufeng.Ultrasonic method of flavone from Sonchus oleraceus L.with water as the mediumz[J].Food Research and Development,2014,35(24):63-65.
[10]江念,万佐玺,陈根洪,等.正交试验法优化3种乌蔹莓属植物中黄酮和多糖的水提醇沉工艺 [J].中成 药,2016,38(10):2281-2284.
JIANG Nian,WAN Zuoxi,CHEN Genhong,et al.optimization of water extraction and alcohol sedimentation process for flavonoids and polysaccharides from three species of acanthus by orthogonal test[J].Chinese Traditional Patent Medicine,2016,38(10):2281-2284.
[11]杜鹃,吴忠红.新疆昆仑雪菊总黄酮含量测定方法研究[J].食品研究与开发,2015(1):93-96.
DU Juan,WU Zhonghong.Study on determination of total flavonoids content in xinjiang kunlun snow Chrysanthemum[J].Food Research And Development,2015(1):93-96.
[12]王家妮,明建,田勇,等.昆仑雪菊茶总黄酮提取及抗氧化活性研究[J].食品与机械,2018,34(9):162-166.
WANG Jiani,MING Jian,TIAN Yong,et al.Extraction and antioxidant activities of flavonoids from Coreopsistinctoria Nutt tea[J].Food&Machinery,2018,34(9):162-166.
[13]张福欣,宋佳烜,刘晓东.甘肃棘豆黄酮抗氧化活性及免疫活性的研究[J].中国畜牧兽医,2018,45(12):3387-3394.
ZHANG Fuxin,SONG Jiaxuan,LIU Xiaodong.Antioxidation and immune activity of Oxytropis kansuensis flavonoids[J].China Animal Husbandry&Veterinary Medicine,2018,45(12):3387-3394.
[14]钱天元,孙亭,李成平,等.无患子花色素理化性质研究[J].食品工业科技,2017,38(17):212-215,234.
QIAN Tianyuan,SUN Ting,LI Chengping,et al.Study on the physicochemical properties of pigment from flower of sapindus mukurossi[J].Science and Technology of Food Industry,2017,38(17):212-215,234.
[15]郭林新,马养民,乔珂,等.三叶木通化学成分及其抗氧化活性[J].中成药,2017,39(2):338-342.
GUO Linxin,MA Yangmin,QIAO Ke,et al.Chemical constituents from Akebia trifoliate and their anti-oxidant activities[J].Chinese Traditional Patent Medicine,2017,39(2):338-342.