速溶茶、茶浓缩液是以茶叶或鲜茶叶为原料，经水提取或采用茶鲜叶榨汁，再经加工制成的。作为食品、饮料等原辅料的固体/液态产品，要求具有相应的香气和滋味[1-2]。为了实现纯茶饮料回归天然、接近现泡茶的质感，饮料行业正不断提高茶提取工艺的技术。但是速溶茶、茶浓缩液在经过提取和浓缩等工序后，茶香气成分大部分损失殆尽，在后期产品制备中需要加入茶香精以提高产品的茶香味[3-4]，目前有研究提出通过香气回填的方法，先把茶香气成分单独提取出来，在后期再回填到茶汤和茶粉中[5-6]。但是茶叶中香气成分含量很低，一般只占干物质质量的0.01%～0.05%[7]，普通的提取方法得率很低，且香气成分种类较少。目前有许多研究指出在茶叶提取过程中加酶可以增加茶汤香气和风味[8-10]，但是对加入不同种类的酶辅助提取信阳毛尖香气成分，香气成分得率和变化研究较少，所以本文考察β-葡萄糖苷酶、果胶酶、中性蛋白酶及纤维素酶辅助提取对信阳毛尖香气成分影响，为提高信阳毛尖香气成分提取率提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
信阳毛尖：信阳市浉河区青云茶叶专业合作社提供；β-葡萄糖苷酶（≥200U/g）、果胶酶（≥60000U/mL）、纤维素酶（≥11 000 U/g）、中性蛋白酶（≥50 000 U/g）：夏胜生物科技开发有限公司。癸酸乙酯（纯度99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氯甲烷、无水硫酸钠（均为分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
GC-MS QP2010Ultra气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；同时蒸馏萃取（simultaneous distillation and extraction，SDE） 提取器、HH-4Y电热恒温水浴锅：上海启前电子科技有限公司；SHSL调温电热套：上海树立仪器仪表有限公司；SB-1100旋转蒸发仪：日本东京理化器械株式会社；ME204电子分析天平：梅特勒-托利多国际股份有限公司；SANYO医用低温箱：日本三洋公司。
1.3 方法
1.3.1 气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析条件
GC 条件：Rxi-5MS（30.0 m×0.25 mm，0.25 μm）石英毛细管柱。 进样口温度250℃，载气为He气，柱流量为1.5 mL/min，升温程序：初始温度为100℃，先以10℃/min升至260℃，再以20℃/min升温至300℃（保持 10 min），分流比 5∶1。
MS条件：离子源为电子轰击电离源（EI），离子化电压70 eV，离子源温度250℃，质谱扫描范围40 amu～500 amu，检测器电压0.88 kV。
1.3.2 提取制备方法
β-葡萄糖苷酶辅助提取香气成分：绿茶粉碎，过40目筛，取20 g，置于圆底烧瓶中，加200 g蒸馏水，加0.5%β-葡萄糖苷酶，调pH值至4.5～5.0，50℃保温酶解1 h，加1 mL癸酸乙酯（浓度98.83 g/mL），放置于电热套上，连接SDE装置，另一端连接另一圆底烧瓶，烧瓶中加入30 mL二氯甲烷，放置于水浴锅上，水浴锅温度设置55℃，电热套加热使水保持微沸，同时蒸馏萃取2 h，萃取液采用无水硫酸钠和冷冻结合除水，然后用低温减压浓缩，温度为30℃，除去溶剂，称重，加2 mL二氯甲烷溶解，0.45 μm滤膜过滤即得，样品冷冻保存。
果胶酶、蛋白酶及纤维素酶辅助提取香气成分处理方法同上。
空白为不加酶，不经过酶解，其它步骤同上。
1.4 数据处理
定性分析：利用NIST 2014谱库和保留时间、保留指数对所得到的质谱图进行检索定性，挑选出匹配度大于等于80%的峰号；根据分子质量、化学式以及分子结构确定各个出峰物质的名称。
定量分析：根据各组分色谱峰面积占样品总峰面积（不含癸酸乙酯内标）的含量进行定量。
2 结果与分析
2.1 不同酶辅助提取的香气成分
采用不同的酶分别对信阳毛尖进行酶解，然后采用SDE法提取其香气成分，提取液经过除水，30℃低温减压蒸干，称重，结果见表1。
表1 不同酶辅助提取的香气成分得率
Table 1 The yield of aroma components extracted by different enzymes
酶香气成分质量/g 得率/%空白 0.149 0.75 β-葡萄糖苷酶 0.318 1.59果胶酶 0.033 0.17中性蛋白酶 0.221 1.06纤维素酶 0.017 0.09
由表1看出，β-葡萄糖苷酶辅助提取信阳毛尖香气成分得率最高，其次是中性蛋白酶，果胶酶和纤维素酶辅助提取的香气成分得率低于空白对照。
2.2 不同酶辅助提取的香气成分比较
用β-葡萄糖苷酶、果胶酶、中性蛋白酶、纤维素酶分别对信阳毛尖进行酶解，采用不加酶提取作为空白对照，然后采用SDE法提取其香气成分，用GC-MS进行检测，定性和定量结果见表2。
表2 各种酶辅助提取下的香气成分及相对含量
Table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes
编号 保留时间/min 香气成分相对含量/%空白 β-葡萄糖苷酶 果胶酶 中性蛋白酶 纤维素酶1 3.02 α-松油醇 1.83 1.36 — — —2 3.14 isopentyloxyethyl acetate — 0.86 0.53 0.60 0.54 3 3.15 2，5-hexanedione， 3，4-dihydroxy-3，4-dimethyl- 0.65 — — — —
续表2 各种酶辅助提取下的香气成分及相对含量
Continue table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes
编号 保留时间/min 香气成分相对含量/%空白 β-葡萄糖苷酶 果胶酶 中性蛋白酶 纤维素酶4 3.22 （Z，E)-金合欢醇 0.83 — 1.97 1.99 1.80 53.23 橙花醇 — 2.17 — — —6 3.33 2，5-辛二酮 — 0.37 0.30 0.34 0.34 7 3.44 香叶醇 5.73 6.85 5.28 5.67 5.74 8 3.60 壬酸 — 1.05 1.54 1.04 0.67 93.85 壬酸乙酯 1.71 — — — —104.00 吲哚 — 0.96 0.64 0.56 0.63 114.14 癸酸甲酯 — 0.14 — — —12 4.75 (Z)-己酸-3-己烯酯 — 2.95 1.32 1.28 1.46 13 4.99 茉莉酮 — 1.53 3.41 2.93 3.10 14 5.39 2-cyclopenten-1-one， 3-methyl-2-(2，4-pentadienyl)-， (Z)- 0.47 0.18 — — —15 5.51 反式-2-癸烯酸乙酯 1.15 0.21 — — —16 5.52 橙化基丙酮 — 0.26 0.21 0.21 0.25 17 5.62 （E)-β-金合欢烯 0.12 — — 0.16 —185.64 氯代十八烷 — — — 0.17 —19 5.71 a，a'-dihydroxy-m-diisopropylbenzene — — 0.43 0.16 —20 5.78 丙位癸内酯 4.10 — 0.27 — —21 5.75 γ-癸内酯 — 0.75 — — —225.82 十二醇 — — — 0.06 —23 5.96 1，6，6-trimethyl-7-(3-oxobut-1-enyl)-3，8-dioxatricyclo[5.1.0.0(2，4)]octan-5-one ——0.51——245.97 癸酸正丙酯 — 1.32 — — —25 6.02 十一酸乙酯 37.14 6.96 0.98 — —26 6.12 十五烷 0.27 0.57 0.60 0.71 0.76 27 6.16 α-法尼烯 — — 0.83 0.85 0.82 286.18 cubebol 0.671.17— —29 6.24 2，4-二叔丁基苯酚 — 0.26 — 0.11 0.12 30 6.25 3，5-二叔丁基苯酚 0.23 — — — —31 6.28 二环己基甲酮 0.50 0.67 1.10 0.54 0.70 32 6.38 δ-杜松烯 1.00 1.81 1.49 1.63 1.65 33 6.43 顺菖蒲烯 — 0.19 0.33 0.27 0.28 34 6.55 naphthalene， 1，2，3，4，4a，7-hexahydro-1，6-dimethyl-4-(1-methylethyl)- — — 0.34 0.17 0.21 35 6.81 反式橙花叔醇 3.28 4.38 3.55 3.65 3.83 36 6.96 苯甲酸-3-己烯酯 0.40 0.52 0.54 0.45 0.52 37 7.14 十二酸乙酯 14.21 2.73 0.30 — —38 7.23 十八烷 0.63 1.17 0.58 — 0.81 398.32 十六烷 — — 0.481.35 —40 7.46 （-）-异雪松醇 0.27 0.44 0.42 0.36 0.36 41 7.63 （+）-epicubenol 0.65 0.92 1.07 0.81 0.83 42 7.73 茉莉酸甲酯 1.14 1.53 1.27 1.39 1.32 43 7.80 tau-muurolol 1.00 1.54 1.53 1.23 1.26 447.86 (E)-3-eicosene — —0.08 45 7.93 α-荜澄茄醇 0.55 0.78 0.79 1.04 0.62 468.12 norphenazone — — —0.43—47 8.33 十七烷 0.12 0.44 — 0.91 0.35
续表2 各种酶辅助提取下的香气成分及相对含量
Continue table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes
编号 保留时间/min 香气成分相对含量/%空白 β-葡萄糖苷酶 果胶酶 中性蛋白酶 纤维素酶488.12 水杨酸己酯 — — — — 0.14 498.36 降植烷 — — 0.060.47 0.54 50 8.37 2，6，11-三甲基十二烷 0.12 — — — —51 8.52 反式金合欢醇 — — 0.19 0.18 0.22 529.01 dotriacontyl isopropyl ether — —0.36 539.39 十九烷 0.27 0.49 — 0.71 —54 9.46 植烷 0.38 0.69 0.87 1.11 1.19 559.76 新植二烯 — — — 0.07 —56 9.82 植酮 0.36 0.74 1.36 1.10 1.55 57 9.89 咖啡因 — 0.41 0.37 0.18 0.21 58 10.00 邻苯二甲酸二异丁酯 0.23 0.44 0.38 0.34 0.46 59 10.23 1-十四醇 — — — 0.24 0.36 6010.24 十五醇 0.16 — — — —6110.24 十六醇 — 0.33 — — —6210.41 二十六烷 0.19 — — 0.57 —63 10.52 法尼基丙酮 — — 0.18 0.15 0.21 64 10.60 1-二十六碳烯 — — 1.53 — —65 10.65 棕榈酸甲酯 0.31 0.48 0.91 0.95 0.88 66 10.87 异植物醇 — 0.26 0.86 0.71 0.64 67 10.95 邻苯二甲酸二丁酯 1.66 2.91 1.99 1.61 1.79 68 11.10 棕榈酸 — 4.15 2.88 3.25 2.68 69 11.32 棕榈酸乙酯 0.19 0.24 0.30 0.16 0.23 70 11.62 香叶基香叶醇 0.23 — 0.29 — 0.34 7111.63 香叶基芳樟醇 — — — 0.42 —72 12.06 2-己基-1-癸醇 — — — 0.11 0.18 7312.15 sulfurous acid，hexyl nonyl ester — — 0.53 — —7412.20 十八醇 0.61 — — — 0.79 7512.21 十九醇 — 1.17 — 0.73 —76 12.26 亚油酸甲酯 0.23 — 0.58 0.59 0.53 7712.32 亚麻酸甲酯 — — — 0.94 —78 12.32 11，14，17-顺-二十碳三烯酸甲酯 0.50 1.14 — — 0.92 79 12.33 2，6-dimethyl-8-（tetrahydropyran-2-yloxy）-octa-2，6-dien-1-ol — — 2.08 — —80 12.43 植醇 11.33 24.61 45.08 49.58 50.25 8112.57 硬脂酸甲酯 — — — 0.09 0.12 82 12.72 二十五碳五烯酸甲酯 0.35 — — 0.30 0.31 83 12.73 花生四烯酸 — 0.76 0.81 — —84 12.77 Z，Z-4，15-octadecadien-1-ol acetate 0.19 0.54 — — —8512.78 7-hexadecyn-1-ol ——0.57——86 12.78 E，E，Z-1，3，12-nonadecatriene-5，14-diol — — — 0.41 0.43 87 12.86 （R）-（-）-14-rethyl-8-hexadecyn-1-ol — 0.16 — — —8812.87 亚油酸乙酯 — — — 0.09 0.14 8912.92 亚麻酸乙酯 — 0.23 — — 0.17 9013.06 硬脂酰胺 — 0.46 — — —91 13.67 N-苯基1-萘胺 — 0.51 0.72 0.82 0.78
续表2 各种酶辅助提取下的香气成分及相对含量
Continue table 2 Aroma components and relative contents under the assisted extraction of various enzymes
注：—表示未检出。
编号 保留时间/min 香气成分相对含量/%空白 β-葡萄糖苷酶 果胶酶 中性蛋白酶 纤维素酶92 14.03 顺式3-辛基环氧辛酸甲酯 0.13 0.34 — — —93 14.03 顺式-9，10-环氧十八烷酸甲酯 — — — 0.44 —94 14.04 oxiraneoctanoic acid，3-octyl-，methyl ester，cis- — — 0.32 — 0.47 95 14.10 二十一烷 0.48 0.34 0.29 0.32 0.63 96 14.51 4，8，12，16-tetramethylheptadecan-4-olide — 0.25 0.19 0.16 —97 14.62 油酸酰胺 — 1.52 0.67 0.52 0.47 98 14.83 3-十六烷醇 — — — 0.15 —9915.21 2-methyltetracosane — —0.20 100 15.97 邻苯二甲酸二异辛酯 0.31 0.46 0.28 0.34 0.59 10116.68 二十烷 — — — — 0.31 102 17.08 四十四烷 0.50 3.21 0.82 0.19 0.85 10317.27 三十六烷 — — — — 0.33 10417.54 芥酸酰胺 1.22 4.68 0.16 — —105 17.69 角鲨烯 0.20 0.61 0.28 0.43 0.67 106 17.77 E，E，Z-1，3，12-nonadecatriene-5，14-diol — — — 0.14 —10718.10 二十四烷 — — 0.36 — —108 18.11 二十二烷 0.55 0.81 1.50 0.34 —总计 100 100 100 100 100总成分 49 61 60 67 62
由表2看出，5种提取方法共提取检测出108个成分，共有成分23种。添加这4种酶后，二环己基甲酮、δ-杜松烯、反式橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、（-）-异雪松醇、（+）-Epicubenol、茉莉酸甲酯、tau-Muurolol、α-荜澄茄醇、植烷、植酮、邻苯二甲酸二异丁酯等绿茶中主要呈香成分[11-12]相对含量比空白提取时都有增加。
在信阳毛尖香气成分提取时加入β-葡萄糖苷酶后，增加的主要香气成分有：橙花醇、2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、2，4-二叔丁基苯酚、顺菖蒲烯、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮等共24个成分。其中橙花醇、茉莉酮、（Z）-己酸-3-己烯酯是信阳毛尖中主要的呈香成分[13-15]。添加β-葡萄糖苷酶后，香叶醇、反式橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、（-）-异雪松醇、（+）-Epicubenol、δ-杜松烯、茉莉酸甲酯、tau-Muurolol、α-荜澄茄醇、植烷、植酮、邻苯二甲酸二异丁酯等相对含量比空白提取时都有提高。信阳毛尖中主要呈香成分[13-15]香叶醇、反式橙花叔醇、δ-杜松烯、邻苯二甲酸二异丁酯，相对含量与空白相比分别提高了19.5%、30.0%、81%、91.3%，香叶醇的含量仅在添加β-葡萄糖苷酶时有增加，这与β-葡萄糖苷酶能水解茶叶中的糖苷键，释放香叶醇的结果一致[16-17]。
在信阳毛尖香气成分提取时加入果胶酶后，增加的主要香气成分有：（Z，E）-金合欢醇、2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮、丙位癸内酯、α-法尼烯、顺菖蒲烯、降植烷、反式金合欢醇等共31种，消失了18种香气成分，大部分是酯类和烷烃类。信阳毛尖中主要呈香成分有：反式橙花叔醇、δ-杜松烯、邻苯二甲酸二异丁酯，相对含量与空白相比分别提高了8.2%、49.0%、65.2%。
在信阳毛尖香气成分提取时加入中性蛋白酶后，增加的主要香气成分有：2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮、香叶基芳樟醇、2，4-二叔丁基苯酚、α-法尼烯、顺菖蒲烯、Naphthalene等共37种。芳樟醇类化合物是信阳毛尖中的主要呈香成分和相对含量较高的成分[18-19]，香叶基芳樟醇仅在添加中性蛋白酶后含量有所增加，这可能和本试验选取的材料中芳樟醇类化合物含量低有关，但也说明了添加中性蛋白酶后可以辅助芳樟醇类化合物溶出。信阳毛尖中主要呈香成分反式橙花叔醇、δ-杜松烯、邻苯二甲酸二异丁酯，相对含量与空白相比分别提高了11.3%、63.0%、47.8%。
在信阳毛尖香气成分提取时加入纤维素酶后共测得香气成分62个，增加的主要香气成分有：2，5-辛二酮、壬酸、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯、茉莉酮、橙化基丙酮、2，4-二叔丁基苯酚、α-法尼烯、顺菖蒲烯、降植烷、反式金合欢醇等共31种。信阳毛尖中主要呈香成分反式橙花叔醇、δ-杜松烯、邻苯二甲酸二异丁酯的相对含量和空白对比分别提高了16.7%、65.0%、100%。
2.3 香气成分构成分析
各香气成分构成分析见表3。
由表2和表3看出，添加β-葡萄糖苷酶、果胶酶、中性蛋白酶、纤维素酶后香气成分总数较空白都有增加，其中添加中性蛋白酶后增加的香气成分最多，增加了36.7%；添加了4种酶后，醇类、酸类、萜烯类、酮类、烷烃类及其它类香气成分相对含量较空白也有一定增加，但是酯类成分的相对含量降低很多，酯类成分个数降低却不明显，这可能和添加酶后，植醇的相对含量大量增加有关。植醇是叶绿素的一个侧链，乔克威等[20]研究采用叶绿素酶脱除叶绿素链上的植醇，效果很好。本试验结果说明β-葡萄糖苷酶、果胶酶、中性蛋白酶、纤维素酶可能具有辅助水解叶绿素成植醇的功能。酸类物质大多呈现不愉悦气味，不利于茶叶香气品质，添加4种酶后，酸类成分都有增加，这可能是和酶能辅助水解部分酯类有关。
表3 香气种类分析
Table 3 Analysis of aroma types
样品 香气总数醇类 酯类 萜烯类 酸类 酮类 烷烃类 其他类个数 相对含量/% 个数 相对含量/% 个数 相对含量/% 个数 相对含量/% 个数 相对含量/% 个数 相对含量/% 个数 相对含量/%空白 49 11 25.49 17 63.96 4 2.78 0 0 4 1.98 10 4.14 3 1.65 β-葡萄糖苷酶 61 12 43.69 20 25.00 4 4.46 3 5.96 6 3.75 8 7.73 8 9.41果胶酶 60 12 61.51 16 10.69 6 5.59 3 5.23 7 7.06 9 5.55 7 4.37中性蛋白酶 67 17 65.62 16 9.73 7 5.12 2 4.29 6 5.27 10 6.68 9 3.29纤维素酶 62 14 66.08 17 10.44 7 5.13 2 3.35 6 6.15 10 5.97 6 2.88images/BZ_106_760_709_780_744.pngimages/BZ_106_1002_709_1021_744.pngimages/BZ_106_1243_709_1263_744.pngimages/BZ_106_1486_709_1506_744.pngimages/BZ_106_1725_709_1744_744.pngimages/BZ_106_1969_709_1988_744.png
3 结论
在信阳毛尖香气成分提取过程中，添加β-葡萄糖苷酶、果胶酶、中性蛋白酶、纤维素酶，都能提高信阳毛尖中的香气成分种类，其中添加中性蛋白酶后香气成分种类增加最多，绿茶中的主要香气成分二环己基甲酮、δ-杜松烯、反式橙花叔醇、苯甲酸-3-己烯酯、（-）-异雪松醇、（+）-Epicubenol、茉莉酸甲酯、tau-Muurolol、α-荜澄茄醇、植烷、植酮、邻苯二甲酸二异丁酯、棕榈酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸乙酯、叶绿醇的相对含量都有提高。β-葡萄糖苷酶辅助提取信阳毛尖香气成分得率最高，其次是中性蛋白酶。因此在信阳毛尖香气成分提取时添加β-葡萄糖苷酶和中性蛋白酶，既可以增加香气成分种类，又可以提高香气成分得率。
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