诺丽果（noni）是一种包含多种营养成分，原产于夏威夷和大溪地岛屿上的热带植物。几千年来人们将其茎、根、皮、叶和果实作为药物治疗多种疾病，包括糖尿病、高血压和癌症等[1-2]。我国引种于海南，现主要分布于云南、广东、广西、台湾等地[3]。诺丽果含有多种氨基酸、维生素、微量元素及其它营养成分[4]，相关研究表明，诺丽果不仅具有明显的抗菌消炎作用[5-6]，而且对于肿瘤细胞的生长具有明显的抑制效果，具有预防和治疗癌症的作用[7-8]。张伟敏等[9-10]对诺丽果主要功能性物质的营养评价结果表明，诺丽果含有丰富的氨基酸及微量元素，与16种常见的热带水果相比其氨基酸的总量排名第一，具有较好的开发潜力和营养价值。林卫华等[11]的研究结果表明，将不同剂量的诺丽果粉灌胃给予小鼠30 d后，小鼠游泳耐力显著提高，增强了小鼠的运动机能。李奕星等[12]和胡鸣旭等[13]对诺丽果的抗氧化性研究结果表明，诺丽果汁中活性成分对自由基和过氧化氢具有很好的清除活性；诺丽果提取物可保护心肌细胞，调节受损心肌细胞能量代谢。相关文献[14-17]对诺丽果主要化学性成分也进行了测定分析，分离鉴定出了大量化合物及有效成分。
综合以上研究结果，诺丽果具有多种有效功能性成分，具有较好的开发应用前景，但目前对诺丽果的研究主要集中在其药理作用和对相关化学成分的分析鉴定上，对诺丽果有效营养成分的提取纯化及应用方面的研究报道较少；由于诺丽果中含有大量人体所必需的氨基酸[10]，而生物碱大多属氨基酸衍生物，因此本试验选取诺丽果生物碱为研究对象，利用超声法对其提取条件进行研究，以期获得简单有效的诺丽生物碱提取方法，为其功能性成分的利用和研究提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
诺丽果：采自西双版纳州景洪市。采集正常生长且成熟度一致的诺丽鲜果进行处理，经洗净、烘干、研磨成粉，分别过 20、40、60、80、100、120 目筛。诺丽生物碱对照品：中国药品生物制品检定所；盐酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、溴麝香草酚蓝、乙醇、氯仿：国药集团有限公司，均为分析纯。
1.2 仪器设备
MS104TS/00电子天平、SevenExcellence PH计：梅特勒-托利多有限公司；UV-2700紫外分光光度计：日本岛津公司；N-2110旋转蒸发仪：日本东京理化器械株式会社；101-2AB电热鼓风干燥：天津泰斯特仪器有限公司；SHZ-D循环水多用真空泵：郑州英峪领科仪器设备有限公司；KQ-600DB超声波提取器：昆山舒美超声仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 试剂的配制
0.5%盐酸：量取25 mL浓盐酸加入500 mL蒸馏水中，转移至1 000 mL容量瓶，定容至刻度。
pH7.0缓冲溶液：称取磷酸二氢钾6.8 g，加入0.1mol/L的氢氧化钠溶液291mL，用水稀释至1000mL。
4 mol/L氢氧化钠：称取160 g氢氧化钠加蒸馏水溶解定容至1 000 mL，转移到塑料瓶中保存。
酸性染料：精确称取溴麝香草酚蓝0.125 0 g，置于1 000 mL容量瓶中，用pH7.0的缓冲溶液溶解定容至刻度线。
1.3.2 诺丽果生物碱的提取及分离
称取5.0 g诺丽果粉，加入一定浓度的乙醇溶液，按照所设定条件进行超声辅助提取。将提取液进行多次回收抽滤，至滤出的杂质中无乙醇味。滤液用旋转蒸发仪蒸发浓缩后，加入足量0.5%的盐酸溶解，反应后的生成物溶解于水中，同时伴有部分类似于树脂状的物质析出。将溶液过滤，滤液用4 mol/L氢氧化钠调节至pH值为10左右，使诺丽果生物碱以游离的状态沉淀出来，用氯仿萃取3次，合并萃取液并用旋转蒸发仪蒸发浓缩，将浓缩物转移定容至25 mL容量瓶中。
1.3.3 单因素试验
分别设置不同的乙醇浓度、提取时间、提取温度、液料比、超声功率提取诺丽果生物碱，分析不同单因素提取条件对诺丽果生物碱得率的影响。
1.3.4 响应面试验设计
在单因素试验设计基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选取与诺丽果生物碱得率具有较强交互作用的提取时间、液料比、超声功率3个因素作为自变量，诺丽生物碱的得率作为响应值，设计三因素三水平的响应面分析试验。共设计17个试验，其中12个为析因试验，5个为中心试验，用来估算试验误差，试验因素与水平设计见表1。
表1 响应面试验设计
Table 1 Variables and levels in central composite design
水平 因素X1提取时间/min X2液料比/（mL/g） X3超声功率/W-1 20 20∶1 300 0 30 30∶1 400 1 40 40∶1 500
1.3.5 最大吸收波长的确定
吸取1.3.2所得提取液5 mL，加入50 mL容量瓶中，用氯仿稀释定容作为诺丽生物碱待测液。吸取溶液1 mL，加入5 mL氯仿及6 mL的溴麝香草酚蓝酸性染料，于分液漏斗中摇动后，静置分层。取氯仿层，用优级脱脂棉过滤后，吸取4.0 mL，加入无水硫酸钠0.2 g，摇匀，以氯仿作为空白。在紫外分光光度计上，于量程范围进行扫描，分析扫描曲线结果，确定诺丽果生物碱的最大吸收峰波长为418 nm。
1.3.6 标准溶液的制备
精确称取36 mg诺丽生物碱对照品，置于25 mL容量瓶中，加氯仿溶液并稀释定容至刻度，摇匀。精密量取5 mL以上溶液于50 mL容量瓶中，加氯仿稀释至刻度即得浓度为144μg/mL诺丽果生物碱对照品溶液。
用玻璃移液管量取对照品溶液 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别加入25 mL具塞刻度试管中，准确补充加入氯仿至1 mL。加入5 mL氯仿及6 mL的溴麝香草酚蓝溶液，按照1.3.5步骤进行染色处理，以未加生物碱的氯仿溶液作为对照，测定吸光度。以诺丽生物碱浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得标准曲线方程为：A=0.034 5C+0.077 4，R2=0.999 8，诺丽生物碱标准曲线见图1。
图1 诺丽果生物碱标准曲线
Fig.1 Standard curve of noni alkaloids
1.3.7 生物碱得率计算
将诺丽果生物碱待测液按1.3.5步骤进行染色处理，于418 nm波长条件下测得吸光度值，带入标准曲线得出待测液中生物碱浓度后，计算生物碱得率，具体公式如下。
式中：W为生物碱得率，g/kg；C为上机液浓度，mg/mL；D为稀释倍数；V为溶液体积，mL；m为样品质量，mg。
1.4 数据处理
利用SPSS 20.0和Design Expert 12.0对所得试验数据进行处理分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇浓度对生物碱得率的影响
乙醇浓度对诺丽果生物碱得率的影响见图2。
图2 乙醇浓度对诺丽果生物碱得率的影响
Fig.2 Effect of different ethanol concentration on the extraction rate of alkaloids
由图2可知，当乙醇浓度小于70%时，诺丽果生物碱的得率逐渐增加，当乙醇浓度达到70%以后，开始呈现下降的趋势。分析原因，可能是当乙醇浓度增大时，样品中脂溶性物质和糖类等成分的析出量增多，对诺丽果生物碱的提取效果产生影响。因此，选取乙醇浓度70%的溶液作为诺丽果生物碱的提取剂。
2.1.2 颗粒度对生物碱得率的影响
颗粒度对诺丽果生物碱得率的影响见图3。
图3 颗粒度对诺丽果生物碱得率的影响
Fig.3 Effect of mesh number on the extraction rate of alkaloids
由图3可知，在20目～60目之间，随着目数的增加，诺丽果生物碱得率呈现增加的趋势，当超过60目时生物碱的得率出现降低趋势。原因可能是随着目数的增加，诺丽果粉颗粒变小，扩散时间缩短，且与溶剂的接触面积相对较大，得率提高；但当粉碎粒度过细时，会增加诺丽果样品的表面流动阻力，样品颗粒在乙醇溶液中的扩散速度变慢，导致生物碱的得率下降。故选取60目作为诺丽果生物碱的颗粒度。
2.1.3 提取时间对生物碱得率的影响
提取时间对诺丽果生物碱得率的影响见图4。
图4 提取时间对诺丽果生物碱得率的影响
Fig.4 Effect of time on the extraction rate of alkaloids
由图4可知，诺丽果生物碱在30 min时达最高值，随后开始下降。分析原因，可能是由于作用时间的延长，部分生物碱受热分解或与提取物中其它成分发生了反应；另外，处理时间过久，由于超声波长时间机械剪切作用，部分其它杂质的分解析出，也会对结果产生影响。
2.1.4 提取温度对生物碱得率的影响
提取温度对诺丽果生物碱得率的影响见图5。
图5 提取温度对诺丽果生物碱得率的影响
Fig.5 Effect of temperature on the extraction rate of alkaloids
由图5可知，当低于70℃时，随着提取温度的升高，诺丽果生物碱的得率也逐渐升高，当温度超过70℃后，生物碱的得率有一定幅度的下降。分析原因，可能是因为高温条件下，部分诺丽果生物碱结构不稳定，发生了分解；另外，随着温度升高，乙醇的挥发速度加快，也会影响诺丽果生物碱的提取。因此选择70℃作为诺丽果超声辅助提取的温度。
2.1.5 液料比对生物碱得率的影响
液料比对诺丽果生物碱得率的影响见图6。
图6 液料比对诺丽果生物碱得率的影响
Fig.6 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction rate of alkaloids
由图6可知，诺丽果生物碱得率先增大后减小，在液料比为30∶1（mL/g）时诺丽果生物碱的得率达到最大，超过30∶1（mL/g）时有下降的趋势。这可能是随着提取剂的量增大，诺丽果细胞内外的浓度差变大，导致细胞内扩散增强，传质推动速度加快，诺丽生物碱大量溶出；而当提取剂的量过多时，超声辐射大量分散于溶剂中，使物料可吸收的量变小，导致了诺丽生物碱得率降低。
2.1.6 超声功率对生物碱得率的影响
超声功率对诺丽果生物碱得率的影响见图7。
由图7可知，当功率达到400 W时，诺丽果生物碱得率达到最高值，随后呈现下降的趋势。主要原因可能是由于功率增大时，超声波的机械剪切作用增强，破坏了诺丽的细胞壁，加快了有效生物碱成分的溶出；同时，超声波处理强化溶剂的循环及传质过程，也有利于诺丽生物碱的浸出；但超声功率过高，部分诺丽生物碱的结构可能被破坏或发生分解。
图7 超声功率对诺丽生物碱得率的影响
Fig.7 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of alkaloids
2.2 响应面优化试验
2.2.1 试验结果与方差分析
响应面优化试验处理及结果见表2，响应面模型方差分析结果见表3。
表2 响应面优化试验结果
Table 2 Response surface optimization test results
试验号X1X2X3生物碱得率/（g/kg）1 -1 -1 0 5.85 2 1 -1 0 6.16 3 -1 1 0 6.37 4 1 1 0 6.78 5 -1 0 -1 6.26 6 1 0 -1 6.43 7 -1 0 1 6.17 8 1 0 1 6.72 9 0 -1 -1 5.89 10 0 1 -1 6.28 11 0 -1 1 5.93 12 0 1 1 6.63 13 0 0 0 6.77 14 0 0 0 6.76 15 0 0 0 6.79 16 0 0 0 6.81 17 0 0 0 6.83
利用Design Expert 12.0软件对表2试验结果进行模型拟合分析，以诺丽果生物碱提取条件X1、X2、X3为自变量，其得率（Y）作为响应值得到回归方程：Y=6.79+0.18X1+0.28X2+0.074X3+0.025X1X2+0.095 X1X3+0.077X2X3-0.14X12-0.36X22-0.25 X32。
通过表3方差分析对拟合模型进行评价可知，一次项和二次项均达到显著水平以上，交互项X1X3，X2X3也达到了极显著水平。失拟误差（P=0.261 9>0.05），说明数据拟合效果较好，模型设计较为合理。决定系数R2=0.995 9，校正后系数值为R2Adj=0.990 6，说明响应面模型能准确地反映诺丽果生物碱得率与提取条件间的关系。试验模型中变异系数（CV）为0.53%，处于较低范围，模型具有较高的精确度。
表3 模型方差分析
Table 3 Analysis of model variance
注：** 表示差异极显著，P＜0.01。
来源 平方和 自由度Df R2 F值 P值 显著性模型 1.97 9 0.22 189.01＜0.000 1 **X1 0.26 1 0.26 223.86＜0.000 1 **X2 0.62 1 0.62 536.86＜0.000 1 **X3 0.044 1 0.044 37.58 0.000 5 **X1X2 2.500×10-3 1 2.500×10-3 2.16 0.185 2 X1X3 0.036 1 0.036 31.18 0.000 8 **X2X3 0.024 1 0.024 20.75 0.002 6 **X12 0.088 1 0.088 76.19＜0.000 1 **X22 0.54 1 0.54 464.12＜0.000 1 **X32 0.27 1 0.27 231.39＜0.000 1 **残差 8.105×10-3 7 1.158×10-3失拟误差 4.825×10-3 3 1.608×10-31.96 0.261 9纯误差 3.280×10-3 4 8.200×10-3总和 1.98 16
2.2.2 响应面图形分析
根据试验结果绘制诺丽生物碱得率的响应面与等高线见图8～图10。
通过图形可评价各提取条件对诺丽生物碱得率的影响及因素间的交互作用，若等高线为圆形表示交互作用不显著，若等高线为鞍形或椭圆形则表示交互作用显著[18-20]；若响应面曲线走势越陡，影响越显著，曲线越平滑，影响越小[21-22]。从图8～图10的响应面和等高线的形状可判断，除提取时间与液料比外，其他因素之间均具有较显著的交互作用；液料比的变化对诺丽果生物碱提取的影响最为显著，表现为曲线较陡，超声功率次之，提取时间曲线表现相对平滑。
图8 提取时间和液料比响应面与等高线
Fig.8 Response surface and contour of extraction time and liquid-material ratio
图9 提取时间和超声功率响应面与等高线
Fig.9 Response surface and contour of extraction time and ultrasonic power
图10 液料比和超声功率响应面与等高线
Fig.10 Response surface and contour of liquid-material ratio and ultrasonic power
2.2.3 最佳提取条件的确定
通过Design Expert 12.0软件求解2.2.1所得回归方程，得出最优提取条件参数为：提取时间37.81 min，液料比 34.57∶1（mL/g），超声功率 436.3 W，预测所得诺丽果生物碱得率为6.939 g/kg。考虑到试验过程的可操作性，将最优诺丽生物碱提取试验条件调整为提取时间 38 min、液料比为 35∶1（mL/g）、提取功率为 450 W。
按照最佳提取条件对诺丽果进行处理，验证模型的准确度，共设置5次平行试验，提取生物碱平均得率为6.932 g/kg，测定结果相对偏差为1.61%，提取测定结果准确度较高，与预测值基本相符，表明方法可行。
3 结论
通过本研究中单因素试验及响应面优化试验结果，得出诺丽果生物碱的最佳提取条件为提取时间38 min、液料比 35∶1（mL/g）、超声功率 450 W。 在此条件下对试验结果进行验证，诺丽果生物碱得率为6.932 g/kg，基本与响应面模型的理论预测值相符。本试验提取条件和因素水平设置合理，试验处理较少，模型预测结果准确，可用于诺丽果生物碱的提取及含量测定。
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