稻谷是日常人们食物最主要的来源之一，近年来我国稻谷的产量大约为1.86亿吨，稻谷作为我国最主要的粮食作物之一，产区遍及全国各地[1]。大米胚芽是稻谷中的重要组成部分，加工的过程中米胚随着米皮一起脱落，是稻米加工的副产品，但当前对其利用率不高而造成了资源的浪费[2-3]。米胚是稻谷的精华所在，其营养价值十分丰富，富含数十种生物活性成分，是一种天然的营养源，可广泛用于各种营养、保健食品中。米胚油中70%～80%的脂肪酸为不饱和脂肪酸，维生素E高达43 mg/100 g油脂。维生素E是一种强抗氧化剂，能阻止脂肪氧化，可预防过氧化脂质的产生[4]。
众所周知，适当的运动可以达到缓解生活压力、提高免疫力、调节情绪等效果，一旦过量运动，会致使骨骼肌疲劳，进而损伤骨骼肌结构和功能[5-6]。骨骼肌在急性运动时产生大量自由基，导致机体内氧化剂与抗氧化剂之间平衡的状态打破，从而引起骨骼肌疲劳、肌肉功能障碍和损伤等，使机体运动能力下降[7-8]。鉴于米胚油抗氧化能力较强，本文将采用响应面法优化米胚油的提取，并建立大鼠力竭运动模型，探讨米胚油对其骨骼肌抗氧化酶活性的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
米胚：黑龙江省和粮农业有限公司；石油醚（分析纯）、乙醇（分析纯）、正己烷（分析纯）、异丙醇（分析纯）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）：南京建成生物工程研究所。
SPF级雄性SD大鼠：广州市旭生生物科技有限公司[SYXK（粤）2019-0045]，50 只，体重（120±5）g。
1.2 仪器与设备
TY15/ZX1003型电子天平：北京海富达科技有限公司；DJ-10A型多功能粉碎机：北京鑫骉腾达仪器设备有限公司；BK-300J型超声波清洗机：济南欧莱博科学仪器有限公司；101-A2型鼓风干燥机：上海科辰实验设备有限公司；S-1-150S型高速离心机：巩义市宏华仪器设备工贸有限公司；HH-2型恒温水浴锅：常州金坛良友仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 米胚油的提取
挑选米胚→干燥去水分→粉碎→加入溶剂→超声提取→减压蒸馏→干燥恒重→精炼→脱蜡→脱胶→脱酸→脱色→精制油
挑选无虫蛀无发霉米胚，50℃干燥2 h，去除水分，之后粉碎至粒径为0.15 mm，得到米胚粉末。称取适量的米胚粉末，放置于磨口三角瓶中，加入一定量的提取溶剂，放置于超声波清洗器中，在一定超声功率、提取温度、提取时间下进行浸提，提取结束后，减压蒸馏出溶剂，并在50℃下干燥至恒重得到米胚油。
式中：Y 为米胚油提取率，%；m1米胚油质量，g；m2磨口三角瓶质量，g；M为米胚粉质量，g。
1.3.2 米胚油精炼
1）脱蜡：将米胚油放入恒温冰箱（4℃左右），使蜡结晶16 h析出，离心分离得到脱蜡米胚油。
2）脱胶：使用质量分数为85%磷酸，在80℃下先加入占油质量比0.2%的磷酸搅拌2 min，再加入适量水（加水量为胶质含量的大约3倍）搅拌，采用高温水化法进行水化脱胶。
3）脱酸：加入浓度为15%的KOH，并不断搅拌，保证混合均匀，当油脂出现沉降时，停止搅拌，将其移入到离心机中分离得到油。
4）脱色：加入活性白土脱色（用量为油脂量的5%左右），过滤得到米胚油的精制油脂。
1.4 单因素试验
设定不同液料比 3∶1、6∶1、9∶1、12:1、15∶1（mL/g）；设定不同提取温度 30、40、50、60、70 ℃；设定不同提取时间 10、20、30、40、50 min； 设定不同超声功率 100、120、140、160、180 W，考察各因素对米胚油提取率的影响。
1.5 响应面法优化米胚油提取工艺
在单因素试验的基础上，以米胚油提取率（Y）为指标，选择液料比（X1）、提取温度（X2）、提取时间（X3）、超声功率（X4）为因素，进行响应面试验设计，试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素水平
Table 1 Box Behnken design factor level
水平 X1液料比/（mL/g）X2提取温度/℃X3提取时间/min X4超声功率/W-1 9∶1 40 30 120 0 12∶1 50 40 140 1 15∶1 60 50 160
1.6 动物分组及运动方案
选取SPF级雄性SD大鼠50只，体重在（120±5）g，大鼠分笼饲养，自由饮食，饲养环境室温22℃～24℃。随机分成5组，每个小组10只大鼠，分别为对照组、力竭运动组、米胚油低、中、高剂量组。米胚油低、中、高剂量组每天灌胃50、100、200 mg/kg米胚油，力竭运动组灌胃100 mg/kg生理盐水。其中对照组不进行任何运动，其它4组进行游泳训练，实验时间持续5周。将大鼠放入到游泳池内，大鼠的尾部负重其体重5%的铅丝，从大鼠进入到游泳池开始，到大鼠力竭的这段周期，沉入水中10 s不能浮到水面停止实验。大鼠在5周实验结束之后，立即动物处死，并且迅速取出股四头肌，浸入生理盐水洗净残余血液，剪取大约1 g左右组织按照料液比为1∶9（g/mL），加入事先预冷的pH7.2的Na2HPO4缓冲液，匀浆后3 000 r/min离心20 min，取上清液并对相关指标SOD、MDA、GSH-Px等指标根据酶学试剂盒的说明书检测分析。
1.7 统计学分析
本文使用SPSS 20.0软件进行数据分析，数据均使用均值±标准差来表示，采取组间进行对比，P＜0.05表示具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂对米胚油提取率的影响
以米胚油提取率为指标，考察4种溶剂对提取率的影响，筛选出适合本试验的提取溶剂，在相同条件下，加入相同液料比的提取溶剂，提取溶剂对米胚油提取率的影响见图1。
图1 提取溶剂对米胚油提取率的影响
Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction rate of rice germ oil
由图1可知，相比于其它3种溶剂，正己烷对米胚油的提取效果最佳，提取的油脂最多，所以选择正己烷作为提取溶剂进行后续试验。
2.2 单因素试验
2.2.1 液料比对米胚油提取率的影响
液料比对米胚油提取率的影响见图2。
图2 液料比对米胚油提取率的影响
Fig.2 Effect of liquid to material ratio on extraction rate of rice germ oil
由图2得出，随着溶剂的增加，米胚油提取率越来越高，当液料比为 12∶1（mL/g）时，提取率增加趋势不再明显。液料比越大越有利于油脂的提取，但是达到饱和之后，提取率升高趋势不明显，继续增大液料比会使油脂与溶剂的分离时间变长，导致成本的提高。 故选择12∶1（mL/g）为最佳提取液料比。
2.2.2 提取温度对米胚油提取率的影响
提取温度对米胚油提取率的影响见图3。
图3 提取温度对米胚油提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of rice germ oil
由图3得出，随着提取温度的增加，米胚油提取率逐渐增高，当提取温度为50℃时，提高率达到最高，继续提高温度，提取率出现下降趋势。这是因为随着温度的升高，油脂更容易被萃取到提取溶剂中，同时过高的温度会使得米胚内其它物质析出，影响提取率。故选择50℃为最佳提取温度。
2.2.3 提取时间对米胚油提取率的影响
提取时间对米胚油提取率的影响见图4。
图4 提取时间对米胚油提取率的影响
Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of rice germ oil
由图4可知，随着提取时间的延长，米胚油提取率随提取时间的延长而逐渐增大，在提取时间为40 min时达到最高，继续延长时间提取率出现降低趋势。这是因为在超声空化破坏的条件下，延长时间有利于油脂溶出。因此，选择40 min为最佳提取时间。
2.2.4 超声功率对米胚油提取率的影响
超声功率对米胚油提取率的影响见图5。
图5 超声功率对米胚油提取率的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic power on extraction rate of rice germ oil
由图5可知，随着超声功率的增加，米胚油提取率随超声功率的增加而逐渐增加，在超声功率为140 W时达到最高，继续增加超声功率提取率出现降低趋势。超声功率的增加使得超声强度增强，进而空化作用加强，从而使米胚内的细胞破碎速度加快，致使油脂从物料中析出更加容易，过高的超声功率会导致体系内的黏度增加，从而影响提取率。故选择140 W为最佳超声功率。
2.3 响应面法试验结果与分析
在单因素试验的基础上，确定各因素最佳水平值范围，采用响应面法试验设计，以米胚油提取率（Y）为指标，设计Box-Benhnken试验中心组合试验。响应面分析方案与结果见表2。回归方程的方差分析结果见表3。
表2 Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Box Behnken experimental design and results
试验号 X1 X2 X3 X4 Y/%1 0 1 1 0 80.53 2 0 1 0 1 78.69 3 0 -1 0 -1 78.88 4 1 -1 0 0 79.83 5 0 0 0 0 83.21 6 1 0 0 -1 80.84 7 -1 1 0 0 78.81 8 0 0 -1 -1 78.22 9 0 1 -1 0 78.55 10 0 -1 1 0 79.21 11 -1 0 0 -1 78.31 12 -1 0 -1 0 76.93 13 0 1 0 -1 79.93 14 -1 0 1 0 78.65 15 0 -1 -1 0 77.05 16 0 0 0 0 83.31 17 1 1 0 0 80.96 18 -1 0 0 1 76.85 19 0 0 1 1 78.89 20 1 0 1 0 81.44 21 1 0 0 1 79.51
续表2 Box-Behnken试验设计与结果
Continue table 2 Box Behnken experimental design and results
试验号 X1 X2 X3 X4 Y/%22 -1 -1 0 0 77.31 23 0 0 -1 1 76.55 24 0 -1 0 1 77.27 25 0 0 0 0 83.36 26 0 0 0 0 83.3 27 0 0 1 -1 80.21 28 0 0 0 0 83.17 29 1 0 -1 0 79.08
表3 响应面回归模型ANOVA分析结果
Table 3 ANOVA analysis results of response surface regression model
注：*表示显著差异（P＜0.05）；**表示极显著差异（P＜0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 125.09 14 8.94 1 426.25＜0.000 1 **X1 18.25 1 18.25 2 913.60＜0.000 1 **X2 5.23 1 5.23 834.37 ＜0.000 1 **X3 13.13 1 13.13 2 095.05＜0.000 1 **X4 6.21 1 6.21 990.67 ＜0.000 1 **X1X2 0.034 1 0.034 5.46 0.034 8 *X1X3 0.10 1 0.10 16.35 0.001 2 **X1X4 4.225×10-3 1 4.225×10-3 0.67 0.425 3 X2X3 8.100×10-3 1 8.100×10-3 1.29 0.274 6 X2X4 0.034 1 0.034 5.46 0.034 8 *X3X4 0.031 1 0.031 4.89 0.044 2 *X12 24.02 1 24.02 3 833.38＜0.000 1 **X22 28.92 1 28.92 4 616.87＜0.000 1 **X32 35.08 1 35.08 5 598.84＜0.000 1 **X42 39.59 1 39.59 6 318.84＜0.000 1 **残差 0.088 14 6.265×10-3失拟项 0.064 10 6.351×10-3 1.05 0.526 4纯误差 0.024 4 6.050×10-3总和 125.18 28
利用Design-Expert软件对表3组试验数据进行多元回归拟合，得到多元回归方程：Y=83.27+1.23X1+0.66X2+1.05X3-0.72X4-0.093X1X2+0.16X1X3+0.033X1X4-0.045X2X3+0.092X2X4+0.088X3X4-1.91X12-2.11X22-2.33X32-2.47X42。
由表3分析可知，模型P=0.000 1＜0.01（极显著），失拟项P=0.526 4＞0.05（不显著），说明方程对试验具有较好的拟合性，试验误差较小。R2=0.999 3，R2Adj=0.998 6也表明模型拟合程度较好，可用于优化米胚油的提取工艺。
分析从各个因素的显著性水平差异可知，对米胚油提取率影响次序为液料比＞提取时间＞超声功率＞提取温度。并且液料比、提取温度、提取时间、超声功率影响都达到了极显著水平（P＜0.01）；X1X2达到显著水平（P＜0.05）、X1X3达到极显著水平（P＜0.01）、X2X4达到显著水平（P＜0.05）、X3X4达到显著水平（P＜0.05）；液料比、提取温度、提取时间、超声功率各因素的二次项对提取率影响极显著（P＜0.01）。
采用超声波辅助法提取米胚油的最佳工艺，当液料比为 12.98∶1（mL/g）、提取温度为 51.44 ℃、提取时间为42.32 min、超声功率为137.26 W时米胚油的提取率为83.69%。考虑实际操作方便，将工艺参数调整，液料比为 13∶1（mL/g）、提取温度为 51 ℃、提取时间为42 min、超声功率为137 W。选取上述组合做3次平行试验，用来验证上述工艺的可行性，得出米胚油平均提取率为82.47%，与预测值接近。因此修改的工艺参数具备实用价值。
2.4 米胚油对运动大鼠骨骼肌抗氧化酶活性的影响
米胚油对运动大鼠骨骼肌抗氧化酶活性的影响见表4。
表4 米胚油对运动大鼠骨骼肌抗氧化酶活性的影响
Table 4 Effects of rice germ oil on antioxidant enzyme activities in skeletal muscle of exercise rats
注：各组与对照组相比，#表示显著差异（P＜0.05）；与力竭组相比较，*表示显著差异（P＜0.05）。
组别SOD/（U/mg）GSH-Px/（U/L）MDA/（U/mg）对照组 176.24±14.21 8.23±1.69 2.12±0.77力竭运动组 56.41±8.45# 4.04±1.22# 5.23±1.45#低剂量组 82.34±10.56 5.72±1.31 4.65±1.38中剂量组 123.33±11.09 6.55±1.42 3.52±1.21高剂量组 158.37±13.24* 7.81±1.51* 2.72±0.91*
由表4可知，力竭运动组大鼠SOD水平均低于低、中、高米胚油组，其中高剂量组与力竭运动组相比显著升高（P＜0.05），力竭运动组大鼠SOD水平与对照组相比显著降低（P＜0.05）；力竭运动组大鼠GSH-Px水平均低于低、中、高米胚油组，其中高剂量组与力竭运动组相比显著升高（P＜0.05），力竭运动组大鼠GSHPx水平与对照组相比显著降低（P＜0.05）；力竭运动组大鼠MDA含量均低于低、中、高米胚油组，其中高剂量组与力竭运动组相比显著降低（P＜0.05），力竭运动组大鼠MDA含量与对照组相比显著升高（P＜0.05）。正常情况下，机体内有氧化和抗氧化的平衡体系，并且存在自由基防御体系，包括SOD、GSH-Px等在内的酶促防御系统，可以快速地清除自由基，使机体免受危害，SOD、GSH-Px活性及MDA含量对机体组织的抗氧化水平及氧化损伤有至关重要作用[9-10]。大鼠建立力竭运动模型后，MDA含量明显升高，SOD与GSH-Px活性降低，使得骨骼肌发生了氧化性损伤，使股四头肌内的自由基代谢加快，导致大量抗氧化酶被消耗，并且自由基对蛋白酶有很强的毒性，由于米胚油具有很强的抗氧化能力，激活和保护抗氧化酶系，清除自由基，使得骨骼肌组织的脂质过氧化反应减少，减缓骨骼肌氧化性损伤，提高抗氧化酶活性。
3 结论
采用超声波辅助法提取米胚油的最佳工艺，当液料比为 13∶1（mL/g）、提取温度为 51 ℃、提取时间为42 min、超声功率为137 W，得出米胚油平均提取率为82.47%。同时力竭运动大鼠实验表明：米胚油具有很强的抗氧化能力，激活和保护抗氧化酶系，清除自由基，使得骨骼肌组织的脂质过氧化反应减少，减缓骨骼肌氧化性损伤，提高抗氧化酶活性。
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