青钱柳叶为胡桃科植物青钱柳 [Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk.]的干燥叶，2013 年 10 月被国家卫健委列为新食品原料。现代研究表明，青钱柳具有降“三高”、保护化学性肝损伤、增强免疫力、抗氧化、改善睡眠、美容养颜等药理作用[1-15]，其中，降血糖作用尤为突出，被喻为“医学界的第三棵树”，在民间，百姓用其泡茶饮用也已有上千年之久，有“降糖神茶”之称。
本研究拟通过热水浸提和冷冻干燥等传统技术，将青钱柳叶制成青钱柳叶速溶粉，最大程度地保留青钱柳叶的功效成分及甘甜口感、去除不良气味，解决普通青钱柳叶类茶冷溶性不好、冲泡繁琐、携带不便等问题，对将其开发成防治糖尿病的食品、保健品及药品具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
青钱柳叶：广西玉林药市，经广西中医药大学宁小清高级实验师鉴定为胡桃科植物青钱柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinsk.]的干燥叶；异槲皮苷对照品：中国食品药品检定研究院；甲醇：美国Fisher公司；磷酸：成都市科龙化工试剂厂。
1.2 仪器与设备
Waters e2695高效液相色谱仪：沃特世科技有限公司；TGL-16G高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；HHS型电热恒温水浴锅、GZX-9420MBE电热恒温鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；El104电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；GLZ-10Z冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；DTG 3.0 m3动态提取罐：北京瑞纳旭邦科技有限公司；GQ105高速管式离心机：上海章泉离心机技术有限公司；MA150快速水分测定仪：德国赛多利斯公司；Fresco17冷冻高速离心机：美国Thermo Fisher公司。
1.3 方法
1.3.1 青钱柳叶速溶粉制备工艺流程
1.3.2 评价指标及测定方法
1.3.2.1 异槲皮苷含量
色谱柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长：360 nm；进样量：20 μL。
按以上色谱条件，吸取供试品溶液20 μL注入液相，测定异槲皮苷的含量，流动相洗脱顺序见表1。
表1 流动相洗脱顺序
Table 1 Mobile phase elution sequence
时间/min 流动相A/% 流动相B/%0～14 45 55 14～20 45→55 55→45 20～30 55→60 45→40 30～38 60→45 40→55
1.3.2.2 干膏率
精密吸取供试品25 mL，置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃干燥至恒重，移置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定，计算干膏率。
1.3.2.3 水分
按2015年版中国药典四部通则0832“水分测定法”项下“烘干法”进行测定。含水量应符合GB 7101—2015《食品安全国家标准饮料》[16]规定。
1.3.2.4 溶解性
取1 g供试品加入100 mL蒸馏水，100 r/min高速搅拌5 min，3 000 r/min离心5 min，取上清液25 mL于105℃烘干，计算上清液中干物质含量所占的比例。
1.3.2.5 感官评价
参考GB/T 29605—2013《感官分析食品感官质量控制导则》[17]中的感官评价标准，对青钱柳叶速溶粉的色泽、组织形态、冲调性、气味和外观进行全面评价。
1.3.2.6 理化指标
参考GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法理化部分总则》[18]中的检验基本原则和要求，对青钱柳叶速溶粉的各项理化指标进行检测。
1.3.2.7 微生物指标
参考GB 4789.1—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》[19]中的检验基本原则和要求，对青钱柳叶速溶粉的各项微生物指标进行检测。
1.3.3 提取工艺的研究
采用热水浸提的方式提取青钱柳叶，以异槲皮苷含量和干膏率为评价指标，以料液比、提取时间和提取次数为考察因素，通过单因素试验结合L9（34）正交试验法，优选青钱柳叶速溶粉的最佳提取工艺。
1.3.3.1 单因素试验
采用不同料液比[1∶14、1∶16、1∶18、1∶20、1∶22（g/mL）]、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）和提取次数（1、2、3）进行单因素试验，研究各因素对异槲皮苷含量和干膏率的影响并确定因素水平范围。
1.3.3.2 正交试验设计
根据单因素试验结果，并结合实际生产情况，选择料液比（A）、提取时间（B）、提取次数（C）作为影响因素，设计L9（34）正交试验。试验因素与水平设计见表2。
表2 试验因素与水平设计
Table 2 Factors and levels of orthogonal test
水平C B提取次数1 1∶16 1.0 1 2 1∶18 1.5 2 3 1∶20 2.0 3因素A料液比/（g/mL）提取时间/h
1.3.4 干燥工艺的研究
采用不同干燥室真空度（60、70、80、90、100 Pa）、干燥时间（24、36、48、60、72 h）和干燥温度（-25、-35、-45、-55、-65℃）进行单因素试验，研究各因素对水分和溶解性的影响并确定最佳冷冻干燥工艺。
1.3.5 质量检查
根据青钱柳叶速溶粉的最佳制备工艺制备3批中试产品，并对其感官、理化及微生物情况进行评价。
2 结果与分析
2.1 提取工艺的优选
2.1.1 单因素试验结果分析
2.1.1.1 料液比的确定
料液比考察结果见表3。
表3 料液比考察结果
Table 3 Results of the investigation of the amount of solid-liquid ratio
料液比/（g/mL）异槲皮苷含量/（mg/g）干膏率/%1∶14 2.414 4 14.38 1∶16 2.545 7 14.65 1∶18 2.762 5 15.51 1∶20 2.761 0 16.39 1∶22 2.758 7 16.17
由表3可知，异槲皮苷含量和干膏率均随料液比的增加呈先逐渐增大后趋于平缓的趋势，其中，料液比为1∶18（g/mL）时异槲皮苷含量最高，料液比为1∶20（g/mL）时干膏率最大。 综合考虑，选择 1∶16、1∶18、1∶20（g/mL）作为料液比的考察范围。
2.1.1.2 提取时间的确定
提取时间考察结果见表4。
表4 提取时间考察结果
Table 4 Results of extraction time investigation
提取时间/h异槲皮苷含量/（mg/g）干膏率/%0.5 2.671 4 14.38 1.0 2.761 3 15.13 1.5 2.827 1 16.46 2.0 2.699 9 16.76 2.5 2.609 4 17.01
由表4可知，异槲皮苷含量随提取时间的增加呈先增大后减小的趋势，干膏率随提取时间的增加逐渐增大，其中，提取时间为1.5 h时异槲皮苷含量最高。综合考虑，选择1.0、1.5、2.0 h作为提取时间的考察范围。
2.1.1.3 提取次数的确定
提取次数越多，药材有效成分的含量越高，但实际生产中提取次数一般不超过3次，故本研究综合实际生产情况并参考相关文献[20]，选择1、2、3次作为提取次数的考察范围。
2.1.2 正交试验结果分析
提取工艺正交试验结果见表5，提取工艺方差分析结果见表6。
表5 提取工艺正交试验结果
Table 5 Orthogonal test results of extraction process
试验号 A料液比/（g/mL）B提取时间/h C提取次数 D空白 异槲皮苷含量/（mg/g）干膏率/%1 1∶16 1.0 1 1 2.386 3 11.82 2 1∶16 1.5 2 2 2.774 1 15.96 3 1∶16 2.0 3 3 2.556 2 18.03 4 1∶18 1.0 2 3 2.835 6 15.67 5 1∶18 1.5 3 1 2.748 4 18.39 6 1∶18 2.0 1 2 2.132 6 11.98 7 1∶20 1.0 3 2 2.960 4 18.22 8 1∶20 1.5 1 3 2.447 6 12.39 9 1∶20 2.0 2 1 2.662 5 16.99 k1异槲皮苷 2.572 2.727 2.322 2.599 k2异槲皮苷 2.572 2.657 2.757 2.622 k3异槲皮苷 2.690 2.450 2.755 2.613 R 异槲皮苷 0.118 0.277 0.435 0.023 k1干膏率 15.270 15.237 12.063 15.733 k2干膏率 15.347 15.580 16.207 15.387 k3干膏率 15.867 15.667 18.213 15.363 R 干膏率 0.597 0.430 6.150 0.370
表6 提取工艺方差分析结果
Table 6 Variance analysis results of extraction process
因素 偏差平方和自由度 F值 F临界值 P值A料液比异槲皮苷含量 0.028 2 28.000 19.000 P＜0.05干膏率 0.632 2 2.450 19.000 P＞0.05 B提取时间异槲皮苷含量 0.124 2 124.000 19.000 P＜0.05干膏率 0.310 2 1.202 19.000 P＞0.05 C提取次数异槲皮苷含量 0.377 2 377.000 19.000 P＜0.05干膏率 59.016 2 228.744 19.000 P＜0.05 D空白 异槲皮苷含量 0.001 2干膏率 0.26 2
由表5、表6结果可知，以异槲皮苷含量为评价指标时，各因素作用主次为C＞B＞A，对应方差分析结果表明A、B、C这3个因素对青钱柳叶提取效果的影响均有显著性意义（P＜0.05），以A3B1C2为佳；以干膏率为评价指标时，各因素作用主次为C＞A＞B，对应方差分析结果表明C因素对青钱柳叶提取效果的影响有显著性意义（P＜0.05），A因素和B因素对青钱柳叶提取效果的影响无显著性意义（P＞0.05），以A3B3C3为佳。
2.1.3 验证试验
由于优选的两个工艺A3B1C2和A3B3C3未包括在9次试验中，故对A3B1C2和A3B3C3两个工艺进行验证试验并比较。验证试验结果见表7。
表7 验证试验结果
Table 7 Verification test results
方案异槲皮苷含量/（mg/g）干膏率/%A3B1C2 2.657 0 16.12 A3B3C3 2.640 5 18.57
由表7结果可知，以异槲皮苷含量为评价指标时，A3B1C2＞A3B3C3，以干膏率为评价指标时，A3B3C3＞A3B1C2，与正交试验第7组（A3B1C3）相比，综合考虑能耗、效率、生产的需要，最终确定A3B1C2为青钱柳叶速溶粉的最佳提取工艺，即料液比 1∶20（g/mL）、提取 2 次、每次1 h。
2.1.4 青钱柳叶速溶粉最佳提取工艺验证试验
提取工艺验证试验结果见表8。
表8 最佳提取工艺验证试验结果
Table 8 Verification test results of optimum extraction process
1 2.604 2 2.638 7 1.15 15.89 16.17 1.49 2 2.651 0 16.33 3 2.660 8 16.28试验值/（mg/g）均值/（mg/g）RSD/%试验值/%均值/%RSD/%试验号异槲皮苷含量 干膏率
由表8结果可知，异槲皮苷平均含量为2.638 7 mg/g，平均干膏率为16.17%，表明该工艺合理、稳定、可行。
2.2 干燥工艺的优选
2.2.1 真空度的确定
真空度的考察结果见表9。
表9 真空度的考察结果
Table 9 Inspection results of vacuum degree
真空度/Pa 水分/% 溶解性/%60 3.03 94.44 70 2.89 96.75 80 2.08 97.45 90 1.89 98.21 100 1.73 98.01
由表9可知，当真空度为90 Pa和100 Pa时，青钱柳叶速溶粉含水量较低、溶解性较好，并且粉质较60、70、80 Pa时制得的速溶粉更细腻，但真空度过大，则会延长干燥时间，综合考虑干燥效果和时间成本，干燥室真空度控制在90 Pa为宜[21]。
2.2.2 干燥时间的确定
干燥时间的考察结果见表10。
表10 干燥时间的考察结果
Table 10 Inspection results of drying time
干燥时间/h 水分/% 溶解性/%24 2.97 95.51 36 2.12 96.10 48 1.87 98.35 60 1.84 98.58 72 1.72 98.54
由表10可知，随着干燥时间的增大，水分逐渐降低、溶解性先升高后趋于平缓，当干燥时间为48 h时，青钱柳叶速溶粉的含水量和溶解性与60 h和72 h条件下制备的速溶粉无明显差异，故确定干燥时间为48 h。
2.2.3 干燥温度的确定
干燥温度的考察结果见表11。
表11 干燥温度的考察结果
Table 11 Inspection results of drying temperature
干燥温度/℃ 水分/% 溶解性/%-25 2.75 94.41-35 2.26 95.50-45 1.69 97.30-55 1.71 97.54-65 1.77 98.02
由表11可知，随着干燥温度的降低，溶解性逐渐升高，水分先下降后略有升高，当干燥温度达到-45℃时，青钱柳叶速溶粉的含水量最低，且溶解性与-55℃和-65℃条件下制备的速溶粉相差不大。因此，确定干燥温度为-45℃。
2.2.4 验证试验
根据单因素结果制备3批青钱柳叶速溶粉并测定其水分含量和溶解性，结果显示3批青钱柳叶速溶粉的水分含量分别为1.62%、1.54%和1.57%，溶解性分别为96.95%、98.73%和97.32%，RSD值均小于3%，可见所得速溶粉含水量低、溶解性好，该工艺稳定可靠。
2.3 青钱柳叶速溶粉最佳制备工艺的确定
青钱柳叶加水浸提 2 次，料液比 1∶20（g/mL），每次1 h，得青钱柳叶提取液，陶瓷膜微滤，膜式浓缩法浓缩滤液至含固量为1.7，得青钱柳叶一次浓缩液，离心，上清液经膜式浓缩法浓缩至含固量为4.2，得二次浓缩液，在干燥室真空度90 Pa、干燥温度-45℃的条件下冷冻干燥时间48 h，即得青钱柳叶速溶粉。
2.4 质量检查
2.4.1 感官评价情况
色泽：产品呈浅棕色，色泽均一；组织形态：质地均匀，组织细腻；冲调性：在热、温、凉、冷水中均能快速溶解；气味：香气浓郁，无异味；口感：甘甜、顺滑，具有青钱柳叶特有的风味。
2.4.2 理化指标
青钱柳叶速溶粉理化指标：水分≤5.0%，镉≤0.3 mg/kg，砷≤1.0 mg/kg，汞≤0.1 mg/kg，铜≤2.0 mg/kg，六六六≤0.2 mg/kg，滴滴涕≤0.1 mg/kg，未检出五氯硝基苯。
2.4.3 微生物指标
青钱柳叶速溶粉微生物指标：菌落总数≤1 000 cfu/g，霉菌及酵母菌数≤100 cfu/g，未检出大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌。
3 结论
目前市场上主打的青钱柳产品多为叶茶类，经加工后包装成散装茶、袋泡茶、袋（罐）装茶或与其他植物组成混合茶等初级形式，存在冲泡方式繁琐、低温水中有效成分不能完全溶出等弊端。本研究通过热水浸提和冷冻干燥等技术，研制出无辅料添加的青钱柳叶速溶粉，安全、环保、健康。优化后的制备工艺为青钱柳叶加水浸提 2 次，料液比 1∶20（g/mL），每次 1 h，陶瓷膜微滤，膜式浓缩法浓缩滤液至含固量为1.7，离心，上清液经膜式浓缩至含固量为4.2，置于真空度90 Pa、干燥温度-45℃的干燥室中冷冻干燥48 h。
该制备工艺最大限度地保留了青钱柳叶原有的生物活性和良好口感、去除了不良气味，将青钱柳叶以一种新的形式呈现了出来。制得的青钱柳叶速溶粉具有较小的粒径和较大的比表面积，即便在冷水中也能迅速溶解，且溶液澄明、无沉淀和漂浮物，拥有叶类茶无法比拟的优势，能满足现代人快捷高效的生活需要，在食品、保健品及医药等领域有广阔的应用前景。
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