香椿又叫香椿头，为楝科，香椿属，是一种多年生落叶乔木，历史悠久，在我国的多个省份都有分布[1]，叶子不易生虫，具有特殊的香气[2-3]，其营养素含量在蔬菜中位于首列[4]，是当今较为理想的绿色食品之一。香椿具有抗氧化、防衰老、抑菌、清热解毒、消炎化瘀、解除痉挛等多种生理功效[5-7]。目前香椿市场前景广泛，种植香椿的农户越来越多，但是人们利用的大多是香椿嫩芽、嫩叶、香椿木等部位，对于香椿老叶等副产品总是作废弃处理，造成了大量的资源浪费。一些研究结果表明，香椿老叶中含有一定量的黄酮类物质[8]，这种物质具有很高的应用价值，首先黄酮可以有效清除体内的自由基，具有抗氧化、抗衰老等作用，常常应用于化妆品领域，深受消费者喜爱；其次，黄酮类化合物还具有降血糖[9]、降低胆固醇的功效，能够促进血液循环，对肿瘤[10-11]、心脑血管的发病率具有很好的抑制作用，除此之外，黄酮还可以提高机体免疫功能[12-13]，抑制细菌增长[14]，有效止痛、促进伤口愈合等。因此，香椿老叶的开发和利用具有一定的应用意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
安徽太和黑油椿、山东临朐香椿、河南焦作香椿、安徽太和青油椿、山东烟台西牟红椿的老叶：采集于天津科技大学种植基地；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、过硫酸钾、抗坏血酸（均为分析纯）：天津北方天医化学试剂厂；DPPH、ABTS：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；芦丁标准品（纯度为99.9%）：上海时代生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
粉碎机（HK-02A）：广州旭朗机械设备有限公司；电子天平（ESJ205-4）：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；紫外可见分光光度计（SP-2102UV）：上海光谱仪器有限公司；超声波清洗仪（KQ－400KDB）：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；台式离心机（TDL-5-A）：上海安亭科学仪器厂；电热恒温水浴锅（HWS26）：上海一恒科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黄酮提取液制备
取香椿老叶作为样品材料，晒干，粉碎机粉碎；取1 g香椿老叶粉末与一定体积分数的乙醇混合，超声一定时间，同时设置一定的温度；将上述溶液在4 800 r/min的离心机中离心20 min，离心完毕后，将上清液置于100 mL容量瓶中待用；滤渣再加入一定量的乙醇，同样用超声波进行辅助提取，重复上述步骤，合并两次滤液，用一定体积分数的乙醇稀释至容量瓶刻度，得到黄酮提取液[15]。
1.3.2 黄酮标准曲线的绘制
参照赵艳霞等[16]制作黄酮标准曲线的方法并作些许改动，准确称量10 mg芦丁标准品，将其放入100 mL容量瓶中，用60%的乙醇溶液溶解并进行定容，最终得到0.1 mg/mL的芦丁标准液；准备11个10 mL的容量瓶， 分别吸取 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 mL的芦丁标准液于10mL容量瓶中；分别加入1 mL 10 g/L亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，加入1 mL 20 g/L硝酸铝溶液，摇匀，静置6 min，加入2 mL 4 g/L氢氧化钠溶液，用60%乙醇定容，摇匀，静置12 min；以不添加芦丁标准液的试剂作为空白对照，在510 nm处测定不同溶液的吸光度；最后以芦丁溶液浓度作为横坐标，吸光度作为纵坐标，绘制黄酮的标准曲线。
1.3.3 黄酮含量测定及提取率计算
用移液枪吸取1 mL黄酮提取液置于10 mL容量瓶中，按照1.3.2方法步骤进行操作，最后对香椿老叶中黄酮的提取率进行计算。
式中：W为回归方程中对应的芦丁浓度，mg/mL；V为溶液反应的体积，mL；X为黄酮提取液总体积，mL；m为称取的香椿老叶粉末的质量，g。
1.3.4 单因素试验
参照刘玉梅等[17]的方法设置4个因素，乙醇体积分数 40%、50%、60%、70%，料液比 1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL），超声温度 40、50、60、70 ℃，超声时间 30、40、50、60 min，分别按各因素不同梯度进行单因素试验，考察不同因素对黄酮提取率的影响。
1.3.5 正交试验
参照李思阳等[18]的方法选择单因素试验中的4个因素3个水平，以黄酮提取率为指标进行正交试验，每组试验3个重复，最后取平均值作为最终结果，试验因素水平见表1。
表1 L9（34）正交试验因素水平
Table 1L9（34）orthogonal test factor and level
水平因素A乙醇体积分数/%B料液比/（g/mL）C超声时间/min D超声温度/℃1 50 1∶25 30 40 2 60 1∶30 40 50 3 70 1∶35 50 60
1.3.6 不同时期、不同品种香椿老叶黄酮含量比较
分别取不同时期（10月、11月、12月）、不同品种的香椿老叶（黑油椿、青油椿、临朐香椿、西牟红椿、焦作香椿）晒干，粉碎机粉碎。分别称取1 g香椿老叶粉末于锥形瓶中，根据单因素和正交试验得出的最佳提取条件进行提取，再将提取液于4 800 r/min离心20 min，将上清液置于100 mL容量瓶中，滤渣重复上述操作，合并两次上清液，并分别用60%的乙醇溶液定容至容量瓶刻度线，得到黄酮提取液。取1 mL提取液，按照制作黄酮标准曲线的操作步骤，分别测定不同品种香椿老叶的黄酮含量，并进行比较。
1.3.7 抗氧化活性测定
DPPH自由基清除率测定：参照王晓敏等[19]方法，首先吸取1.5 mL不同浓度的黄酮提取液（0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL）于试管中，向上述 10 个试管中分别加入1.5 mL浓度为0.1 mg/mL的DPPH溶液，于25℃避光反应30 min，最后用分光光度计于517 nm处测定溶液吸光度。阳性对照选取VC溶液。
式中：A0为蒸馏水+DPPH溶液的吸光度；A1为黄酮提取液+DPPH溶液的吸光度；A2为蒸馏水+黄酮提取液的吸光度。
ABTS+自由基清除率测定：参照李培源等[20]的方法，分别量取 1.5 mL 浓度分别为 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的黄酮提取液于试管中，取1.5 mL的ABTS溶液加入到上述溶液中，25℃避光反应6 min，于波长734 nm下测定其吸光度，其中对照溶液为1.5 mL黄酮提取液和1.5 mL ABTS溶液，空白溶液为1.5 mL蒸馏水和1.5 mL ABTS溶液。
式中：A0为蒸馏水+ABTS溶液的吸光度；A1为黄酮提取液+ABTS溶液的吸光度；A2为黄酮提取液+蒸馏水的吸光度。
2 结果与分析
2.1 黄酮标准曲线
黄酮标准曲线见图1。
图1 黄酮标准曲线
Fig.1 Standard curve of flavonoids
回归方程为y=10.033x-0.018 8，R2=0.994 8，根据回归方程计算香椿老叶的黄酮含量。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响
乙醇体积分数对黄酮提取率的影响见图2。
由图2可看出，当乙醇体积分数为40%～60%时，黄酮提取率随乙醇体积分数的增加而增大，在乙醇体积分数为60%时提取率达到最高，当乙醇体积分数超过60%后，提取率降低，这可能是由于过高体积分数的乙醇溶解出了香椿老叶内的其它物质，影响了黄酮的显色反应[21]，因此，选择乙醇体积分数60%为最佳。
图2 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响
Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of flavonoids
2.2.2 料液比对黄酮提取率的影响
料液比对黄酮提取率的影响见图3。
图3 料液比对黄酮提取率的影响
Fig.3 Influence of solid-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids
由图3可看出，黄酮提取率在料液比为1∶20（g/mL）～1∶35（g/mL）范围内随溶剂体积增大而增大，但是在1∶30（g/mL）～1∶35（g/mL）范围内增长不明显，因此在节约试剂的原则下，选择料液比1∶30（g/mL）为最佳。
2.2.3 超声温度对黄酮提取率的影响
超声温度对黄酮提取率的影响见图4。
由图4可看出，当超声温度为40℃～50℃时，黄酮提取率随温度的升高而增大，在温度为50℃时提取率达到最高，当超声温度高于50℃时，黄酮提取率反而降低，这可能是由于温度过高，导致黄酮分解，从而使黄酮提取率降低[22]。因此，选择超声温度50℃为最佳。
图4 超声温度对黄酮提取率的影响
Fig.4 Influence of ultrasonic temperature on the extraction rate of flavonoids
2.2.4 超声时间对黄酮提取率的影响
超声时间对黄酮提取率的影响见图5。
图5 超声时间对黄酮提取率的影响
Fig.5 Influence of ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids
由图5可看出，当超声时间在30 min～40 min范围内，黄酮提取率随时间的延长而增加，40 min时提取率达到最高，但是当超声时间超过40 min后，黄酮的提取率反而不断下降，这可能是由于长时间暴露在外面，黄酮类化合物被氧化分解[23]，因此，选择超声时间40 min为最佳。
2.3 正交试验结果
依据2.2单因素试验结果，以黄酮提取率为考察指标，进行L9（34）正交试验，正交试验设计及结果见表2。
表2 L9（34）黄酮提取率正交试验结果
Table 2L9（34）orthogonal experimental results of extraction rate of flavonoids
A乙醇体积分数/%B料液比/（g/mL）C超声时间/min D超声温度/℃1 1（50） 1（1∶25） 1（30） 1（40） 2.72 2 1 2（1∶30） 2（40） 2（50） 2.80 3 1 3（1∶35） 3（50） 3（60） 2.82试验号 提取率/%4 2（60） 1 2 3 3.60 5 2 2 3 1 3.91 6 2 3 1 2 3.41 7 3（70） 1 3 2 2.72
续表2 L9（34）黄酮提取率正交试验结果
Continue table 2L9（34）orthogonal experimental results of extraction rate of flavonoids
A乙醇体积分数/%B料液比/（g/mL）C超声时间/min D超声温度/℃8 3 2 1 3 3.51试验号 提取率/%9 3 3 2 1 3.38 k1 2.78 3.01 3.21 3.34 k2 3.64 3.40 3.26 2.98 k3 3.20 3.20 3.15 3.31 R 0.86 0.39 0.11 0.36
由表2可看出4个因素对香椿老叶内黄酮提取率的影响大小为A（乙醇体积分数）＞B（料液比）＞D（超声温度）＞C（超声时间），优化的提取工艺条件为A2B2C2D1。为了验证试验结果的可靠性，在最优条件下进行3次验证试验，所得的黄酮提取率分别为3.92%、3.99%、4.05%，均大于正交试验中任何一组的提取率，因此，确定黄酮最佳提取工艺为乙醇体积分数60%，料液比1∶30（g/mL），超声温度 40 ℃，超声时间 40 min。
2.4 黄酮含量比较
黄酮含量比较见图6。
图6 黄酮含量比较
Fig.6 Comparison of flavonoid content
由图6可以看出，从10月到12月，5种香椿老叶的黄酮含量都有所增加，尤其是在10月至11月，山东临朐香椿的老叶中黄酮增长量较为显著，增长了2.98%，但是在11月至12月，临朐香椿老叶中黄酮含量增长较为缓慢，只增长了0.02%。在11月至12月，安徽太和的青油椿老叶中黄酮增长量较为明显，增长了1.09%，且在12月份，青油椿老叶中的黄酮含量最高，达到了6.45%。
2.5 抗氧化活性
2.5.1 DPPH自由基清除率结果比较
DPPH自由基清除率结果比较见图7。
通过图7可以得出随着5种香椿老叶黄酮提取液浓度的增加，DPPH自由基清除率都在增加，最后趋于平缓。并且可以看出VC的DPPH自由基清除率最高，5种香椿老叶中，青油椿清除自由基的能力最高，其次为临朐香椿，焦作香椿、黑油椿两种香椿自由基清除能力相差不多，西牟红椿的清除能力最低。由此可以得出：青油椿的抗氧化能力最高，这与不同香椿品种抗氧化物质含量比较的试验中，青油椿的含量最高这一结果相一致，再一次证明黄酮含量越高，自由基清除能力越高。
图7 DPPH自由基清除率比较
Fig.7 Comparison of DPPH free radical scavenging rate
2.5.2 ABTS+自由基清除率结果比较
ABTS+自由基清除率结果比较见图8。
图8 ABTS+自由基清除率结果比较
Fig.8 Comparison of ABTS+free radical scavenging rate
由图8可以得出随着5种香椿提取液浓度的增加，ABTS+自由基清除率都在增加，最后趋于平缓，且VC的ABTS+自由基的清除率最高，这与DPPH自由基清除率试验结果相似。在5种香椿老叶中，来自安徽太和的青油椿，对ABTS+自由基的清除率最高，即青油椿抗氧化能力最强。其余4种香椿的抗氧化能力相差不多。综上，随着黄酮浓度的增加，DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率均随之增强，呈现一定的量效关系。并且来自安徽太和的青油椿抗氧化能力最高。
3 结论
本试验对香椿老叶中黄酮的最佳提取条件进行了研究，结果为乙醇体积分数60%，料液比1∶30（g/mL），超声温度40℃，超声时间40 min。在最佳提取条件下，分别对不同时期（10月、11月、12月）、不同品种（黑油椿、青油椿、焦作香椿、临朐香椿、西牟红椿）香椿老叶内黄酮含量进行比较，结果表明：从10月份到12月份，5种香椿老叶中的黄酮含量均有所增长，均在12月份达到最高含量，且在12月份，来自安徽太和的青油椿黄酮含量最高。黄酮含量比较显示：在10月至11月，山东临朐香椿的增长量较为显著，在11月至12月，安徽太和的青油椿黄酮增长量较为明显。抗氧化结果表明：随着黄酮浓度增加，DPPH自由基清除率和ABTS+自由基清除率也在逐步增大，具有一定的量效关系，且青油椿的抗氧化能力最高。
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