宣恩火腿是我国湖北省恩施自治州一带特产，以宣恩县所产火腿最负盛名，其肉质细嫩、皮黄脂白肉红、气味鲜香宜人、滋味浓郁，在乾隆时期就作为贡品进贡朝廷，被誉为“中国四大名腿”之一[1]。
宣恩火腿要历经十个月以上的加工周期，在此期间，腌制、烘腿、发酵等关键工序都会影响蛋白质的结构和相互作用力，对宣恩火腿风味和质地形成产生一定的影响。已有研究表明，蛋白质分子在展开过程中原来掩埋于蛋白内部的疏水基团会暴露于蛋白表面并与风味化合物发生共价结合[2]，蛋白分子的疏水区域和巯基具有吸附性，可以增强蛋白质对风味的吸附能力[3]，而二硫键能够提高蛋白质被外界破坏作用的抵抗力，保护蛋白质免受快速水解的破坏[4]。
近年来关于猪肉及其制品蛋白质化学作用力的相关研究主要集中在原料肉[5-7]、西式蒸煮火腿[8-9]等，对干腌猪肉火腿以金华火腿为主[10]，对宣恩火腿的研究鲜有报道。本课题对宣恩火腿加工过程中不同阶段样品蛋白质相互作用力变化进行测定，为探究宣恩火腿风味和质地的形成机理研究提供理论支撑，从而为宣恩火腿的现代化生产加工技术提供指导。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
火腿由湖北省思乐牧业集团有限公司提供，每个阶段采集3支火腿，取股二头肌用料理机搅碎后置于-18℃备用（为避免脂肪继续氧化，一个月内完成所有指标测定）。宣恩火腿简要工艺流程[11]：选腿→修胚→腌制→洗腿→整形→烘腿→入库发酵→洗霉→修割→验收。
本课题研究5个阶段的样品分别为原料腿、腌制期、发酵初期、发酵中期和成品腿，原料腿指用于生产制作宣恩火腿的新鲜猪腿（恩施本地黑猪），腌制期指腌制1个月的猪腿（用盐量为每10 kg猪腿用盐1 kg，分6～7次上盐），发酵初期指发酵1个月的猪腿，发酵中期指发酵4个月的猪腿，成品腿指发酵7个月后经洗霉修割的猪腿。
氯化钠、尿素、β-巯基乙醇、氢氧化钠、硫酸铜、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、溴酚蓝、2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、三氯乙酸、乙醇、乙酸乙酯、盐酸胍、5，5＇二硫代双（2-硝基苯甲酸)[5，5'-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid)，DTNB]（以上均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸（分析纯）：平煤神马集团开封东大化工有限公司试剂厂。
FE20型pH计：瑞士Metteler toledo公司；UV2000型分光光度计：美国Unico公司；AL-104型分析天平：瑞士Metteler Toledo公司；Neofuge 18R型高速冷冻离心机：香港Heal Force公司；XH-C型漩涡混合器：金坛市医疗仪器厂；THZ-82型水浴恒温振荡器：常州国华电器有限公司；FJ-200高速均质分散机：上海标本模型厂。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质作用力的测定
参照 Gómez-Guillén 等[12]的方法稍加修改，称取2.00g均匀的样品于50mL离心管中，分别加入20 mL S1（0.05 mol/L NaCl）、S2（0.6 mol/L NaCl）、S3（0.6 mol/L NaCl＋1.5 mol/L 尿素）、S4（0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L 尿素）、S5（0.6 mol/L NaCl＋8 mol/L尿素＋1.5 mol/L β-巯基乙醇）溶液，于10 000 r/min均质1 min，将离心管置于4℃下静置2 h，用双缩脲法测定上清液中蛋白质含量。S2与S1上清液中蛋白质含量之差表示离子键相对含量，S3与S2上清液中蛋白质含量之差表示氢键相对含量，S4与S3上清液中蛋白质含量之差表示疏水相互作用力大小，S5与S4上清液中蛋白质含量之差表示二硫键相对含量。各作用力的含量与上述4种蛋白质作用力含量之和的比值为该作用力的相对含量。每个样品平行测定3次。
1.2.2 肌原纤维蛋白的提取
称取10.00 g均匀的样品，加入100 mL含15.6mmol/L Na2HPO4和3.5 mmol/L KH2PO4（pH7.5）溶液后匀浆，于4℃10 000 r/min下离心15 min，弃去上清液，沉淀用10倍体积含0.5 mol/L氯化钾、15.6 mmol/L磷酸氢二钠和3.5 mmol/L磷酸二氢钾（pH7.5）溶液溶解，于4℃10 000 r/min下离心15 min，上清液即为肌原纤维蛋白提取液。
1.2.3 肌原纤维蛋白表面疏水性的测定
用肌原纤维蛋白与溴酚蓝的结合量表征肌原纤维蛋白的表面疏水性，其测定方法参照Chelh等[13]的方法稍加修改，用0.1 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液（pH7.5）将5个阶段的火腿肌原纤维蛋白浓度调整为5mg/mL。取1 mL该溶液，加入200μL 1 mg/mL溴酚蓝溶液，涡旋振荡混匀1 min，5 000 r/min下离心15 min，于595 nm处测定上清液吸光值。另取1 mL磷酸盐缓冲液做空白对照组，每个样品平行测定3次。表面疏水性按下列公式进行计算。
式中：200 为溴酚蓝质量，μg；OD对照组为空白对照组的吸光值；OD样品组为样品组的吸光值。
1.2.4 肌原纤维蛋白羰基值的测定
参照Oliver等[14]的方法稍加修改，用0.1 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液（pH7.5）将5个阶段的火腿肌原纤维蛋白浓度调整为2 mg/mL。取1 mL该溶液，加入1 mL 10 mmol/L DNPH溶液，空白组加入1 mL 2 mmol/L盐酸溶液，于37℃水浴保温1 h（期间每隔15 min漩涡混匀1次），加1 mL 30%三氯乙酸溶液，涡旋振荡混匀30 s，冰浴保温10 min，4 500 r/min离心15 min，沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1:1，体积比）洗涤3次，静置10 min，弃去上清液，沉淀用3 mL 6 mmol/L盐酸胍溶液溶解，37℃水浴保温30 min，4 500 r/min离心15 min，于370 nm处测定上清液吸光值，每个样品平行测定3次。羰基值按下列公式进行计算。
式中：A为吸光值；3为反应液终体积，mL；1 000为单位换算系数；21为摩尔吸收系数，L/（mmol·cm）；1为比色皿光程，cm；2为样品中蛋白质质量，mg。
1.2.5 肌原纤维蛋白巯基和二硫键的测定
参照Yongsawatdigul等[15]的方法稍加修改，用0.1 mmol/L的 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液（pH7.5）将5个阶段的火腿肌原纤维蛋白浓度调整为2 mg/mL。取1mL该溶液，加入8mL50mmol/L磷酸缓冲液A（8mol/L尿素、0.6 mol/L NaCl、10 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，pH7.5），再加入1.0 mL 0.1%DTNB溶液，40℃水浴保温30 min，于412 nm处测定溶液吸光值，每个样品平行测定3次。巯基含量按下列公式进行计算。
式中：A为吸光值；10为反应液终体积，mL；1 000为单位换算系数；13.6为摩尔吸收系数，L/（mmol·cm）；1为比色皿光程，cm；2为样品中蛋白质质量，mg。
活性巯基的测定用缓冲液B（0.1 mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液、0.6 mol/L NaCl、10 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠，pH7.5）替换缓冲液A，混合液在4℃水浴保温1 h后，于412 nm处测定溶液吸光值，每个样品平行测定3次。二硫键含量为巯基含量与活性巯基含量之差，每个样品平行测定3次。
1.3 数据处理
所有试验和测量均为3份，结果记录为平均值和标准偏差。使用IBM SPSS Statistics 23对数据进行ANOVA差异显著性分析，P＜0.05为显著性差异。
2 结果与分析
2.1 宣恩火腿加工过程中蛋白质相互作用力变化
宣恩火腿在不同加工阶段，维持蛋白质结构稳定的主要化学作用力相对含量见表1。
表1 宣恩火腿不同阶段各蛋白质作用力相对含量变化
Table 1 Changes of relative content of protein interaction in different stages of Xuanen ham
注：同列不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
样品阶段 离子键相对含量/% 氢键相对含量/% 疏水相互作用力/% 二硫键相对含量/%原料期 31.5±1.9a 20.5±1.2a 38.4±1.5c 14.1±0.35d腌制期 24.9±1.4b 16.1±1.3b 42.9±1.4b 16.1±0.87c发酵初期 15.9±0.41c 14.7±0.84b 46.2±1.6a 23.1±0.78b发酵中期 13.8±0.37d 11.5±0.65c 47.9±2.1a 26.8±2.3a成品期 11.3±0.24e 10.7±0.71c 49.7±2.6a 28.3±1.0a
从表1中可以看出，在宣恩火腿整个加工阶段，离子键和氢键相对含量持续下降，尤其是在腌制期内，这种变化幅度更大，这可能与盐分的大量渗入导致细胞内汁液和细胞间水分的流失有关。疏水相互作用和二硫键的相对含量则持续增加，且在发酵期内这种增幅更明显，这可能与此阶段蛋白质的降解、氧化等化学变化有关，蛋白质部分变性导致一些侧链暴露出更多的疏水性氨基酸，其中一些巯基发生了一定程度的氧化形成了二硫键。
在原料期，稳定蛋白质结构的化学作用力依次为疏水相互作用＞离子键＞氢键＞二硫键，且以疏水相互作用力（38.4%）和离子键为主（相对含量31.5%），这与其他学者的结果基本一致[16]。随着加工的进行，受到加工条件和环境条件的变化，肌肉蛋白质发生了一系列的变化，维持蛋白质结构的化学作用力也随之改变，对成品火腿而言，维持起蛋白质结构稳定的作用力以疏水相互作用力（49.7%）和二硫键（相对含量28.3%）为主。
2.2 宣恩火腿加工过程中肌原纤维蛋白表面疏水性变化
肌原纤维蛋白占到蛋白质总量的55%左右，它不仅在肌肉收缩中起重要作用，在肉制品加工过程中，与蛋白质的功能特性如凝胶特性、乳化特性等紧密相关，对肉制品的感官品质产生重要影响[7]。
蛋白质表面疏水性主要体现的是蛋白质表面疏水性氨基酸残基分布的情况，它是体现蛋白质功能特性的重要指标之一[17]，与氨基酸间的疏水相互作用及氧化有关[18]。常用溴酚蓝结合量表征蛋白质的表面疏水性，宣恩火腿在不同加工阶段肌原纤维蛋白溴酚蓝结合量变化见图1。
图1 宣恩火腿加工过程中肌原纤维蛋白溴酚蓝结合量变化
Fig.1 Changes of the bromophenol blue binding amount of myofibrillar proteins in different stages of Xuanen ham
从图1可以看出，从原料腿到成品腿，肌原纤维蛋白溴酚蓝结合量显著性上升（P＜0.05），从9.09 μg增加到38.7 μg。在火腿整个加工阶段，从原料期到腌制期，肌原纤维蛋白溴酚蓝结合量从9.09 μg上升到13.3 μg，与广式腊肠腌制期内肌原纤维蛋白表面疏水性变化趋势一致[19]，主要原因是盐分的大量进入导致其含量的升高[20]。从腌制期到发酵初期，肌原纤维蛋白溴酚蓝结合量从13.3 μg上升到25.4 μg，增幅在各阶段中最大。肌原纤维蛋白的疏水性基团主要埋藏于蛋白质内部[21]，火腿在腌制结束后进入烘房（50℃～55℃）烘腿7 d～10 d，在此期间，蛋白质发生部分变性，使得内部的疏水性基团暴露出来，增强了其表面疏水性。进入发酵期，肌原纤维蛋白表面疏水性进一步增加，但幅度已经减缓。此阶段蛋白质在酶的作用下逐步水解，使得蛋白质分子重新取向定位[22]，一些疏水性基团暴露出来，也增强了其表面疏水性。
2.3 宣恩火腿加工过程中肌原纤维蛋白羰基值变化
任何能引起肉类肌纤维膜系统破坏的处理过程，如绞碎、加热等，都能导致易氧化的成分暴露于氧气中，从而加速蛋白质的氧化[23]。有研究报道，蛋白质的氧化可影响其表面疏水性[24]。宣恩火腿在不同加工阶段肌原纤维蛋白羰基值变化见图2。
从图2可以看出，宣恩火腿的羰基值从原料腿的0.68 nmol/mg增加到成品的2.28 nmol/mg。在发酵初期之前，羰基值没有发生显著性变化（P＞0.05），进入发酵期后开始显著上升（P＜0.05），尤其在发酵中后期羰基值的增加更快。宣恩火腿在整个加工阶段羰基值的变化趋势与脂肪氧化有关，因为脂肪氧化产生的丙二醛等二羰基化合物可与肌球蛋白发生反应产生羰基[25]，而宣恩火腿的脂肪氧化在中后期更加活跃[26]。羰基值与表面疏水性的变化趋势基本吻合。
图2 宣恩火腿加工过程中肌原纤维蛋白羰基值变化
Fig.2 Changes of the carbonyl content of myofibrillar proteins in different stages of Xuanen ham
2.4 宣恩火腿加工过程中肌原纤维蛋白巯基和二硫键变化
天然蛋白质中的巯基主要包埋在蛋白质分子内部，但在蛋白质发生变性、水解、氧化等情况下，巯基暴露出来并被氧化形成二硫键，促进了蛋白质之间的相互交联[27]。宣恩火腿在不同加工阶段肌原纤维蛋白巯基和二硫键变化见图3。
图3 宣恩火腿加工过程中肌原纤维蛋白巯基和二硫键变化
Fig.3 Changes of the sulfhydryl and disulfide bond content of myofibrillar proteins in different stages of Xuanen ham
从图3可以看出，宣恩火腿巯基含量从原料腿的35.6 nmol/mg降低到成品的20.1 nmol/mg，二硫键含量从原料腿的9.65 nmol/mg增加到成品的21.6 nmol/mg，二硫键发酵期内快速增加与2.1中二硫键是稳定宣恩火腿蛋白质结构的主要化学作用力之一的结果相吻合，与其他学者相关研究也基本一致[7]。
3 结论
宣恩火腿在生成过程中蛋白质发生了不同程度的水解和氧化作用，维持其蛋白质结构稳定的作用力发生了明显变化，成品火腿中贡献度最大的是疏水相互作用和二硫键。疏水相互作用是维持蛋白质三级结构的主要作用力，它对蛋白质结构的稳定性、构象和功能性质具有重要作用，二硫键也是稳定蛋白质结构的重要化学键，二硫键的生成可以降低蛋白质的构象熵，使蛋白质达到稳定的结构和产生良好的热稳定性。宣恩火腿在长达一年的生成周期内，蛋白质经过高温、高盐作用，以及漫长的发酵期，最终得到质地优良、风味浓郁的成品，与这些蛋白质作用力的转变有重要关系。
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