近年来，由于塑料包装带来的食品安全和环境污染问题，生物可降解包装材料受到极为广泛的关注。智能食品包装是在成膜基材的基础上添加功能性物质使膜具备一些活性功能（如抗氧化、抑菌），从而延长食品保质期，或为了观察被包装食品的新鲜程度，添加指示剂，利用食品在储藏过程中产生一些物质与试剂发生特定反应引起指示剂颜色变化，从而反映食品信息的技术[1]。
羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）因丰富、廉价、无臭无味并具有良好的成膜性常被用作基材之一制备食品包装膜[2]。甘油是一种口感甘甜、透明、无臭的稠状液体，有助于增强膜的柔韧性和延展性，因此可以作为增塑剂添加到成膜基材中。山梨酸钾作为防腐剂能有效地抑制霉菌、酵母菌和好氧性细菌的活性，从而能够有效地延长食品的保存时间，并保持原有食品的风味[3]。魏占锋等[4]以CMC为成膜基底，甘油为增塑剂，将纳米纤维素添加到CMC中共混制备了CMC增强膜，结果表明共混改性可使膜的力学性能和对水蒸气的阻隔性能提高，并同时提高了膜的热性能。
将天然色素作为指示剂指示食品新鲜度已成为研究热点。桑葚花青素是一种水溶性的天然色素，对人体无害，其结构中含有大量的邻位酚羟基，易被氧化形成稳定的醌类结构从而起到清除活性氧的作用[5]。此外，桑葚花青素中的2-苯基苯并吡喃阳离子会随pH值的改变显示不同颜色[6]。蒋光阳等[7]以马铃薯淀粉、羧甲基纤维素钠为成膜基材，紫薯花青素作为指示剂制备指示膜，结果表明，随着储藏时间的延长，指示膜由红色变为蓝紫色，说明鱼肉开始腐败变质。本文将桑葚花青素共混CMC，并添加甘油和山梨酸钾制备指示膜，分别研究桑葚花青素对指示膜机械性能、阻湿性、阻光性和抗氧化性等相关性能方面的影响。并将其应用于鱼肉的新鲜度检测中，以期为智能食品包装膜的进一步研究提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桑葚、新鲜草鱼：市售。羧甲基纤维素（carboxymethyl cellulose，CMC）：北京鼎国生物技术有限公司；甘油、山梨酸钾、1，1-二苯基-2-苦基肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：北京 Solarbio 科技有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
傅里叶红外光谱仪（NICOLET IS50）：德国Thermo Scientific公司；质构仪（TA-XT2i）：英国 Stable Micro System公司；测色色差计（WSC-S）：上海精密科学仪器有限公司；紫外-可见分光光度计（SP-752）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；扫描电子显微镜（SU1510）：日本 Hitachi公司。
1.3 方法
1.3.1 桑葚花青素的提取
将桑葚烘干至恒重后粉碎，用体积分数50%乙醇溶液作为提取剂，按照料液比1∶10（g/mL）混合，水浴搅拌1 h，滤液在50℃避光旋蒸得到花青素浓缩液，冻干得桑葚花青素粉[8]。
1.3.2 共混膜的制备
将CMC溶于去离子水中，45℃下磁力搅拌1 h以充分溶解，再加入甘油和山梨酸钾继续搅拌1 h，冷却至25℃后，分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的桑葚花青素粉，搅拌20 min至完全溶解。静置30 min脱气，得成膜液。将每100 mL成膜液浇铸在一个20 cm×20 cm的亚克力平板中流延成型，放于鼓风干燥箱30℃～40℃下干燥2 h成膜，揭膜，将膜置于25℃的密闭容器（相对湿度55%～57%）中保存备用。
1.3.3 指示膜厚度及机械性能的测定
以精度为0.01 mm的厚度仪测定指示膜厚度，在膜样品上随机取5个点，计算平均值。
参照GB 1040.3—2006《塑料拉伸性能的测定第3部分：薄膜和薄片的试验条件》[9]的方法测定指示膜的机械性能。将膜裁剪成20 mm×50 mm的大小，采用TA-XT2i质构分析仪测定抗拉强度（tensile strength，TS）和断裂伸长率（elongation at break，EAB）。初始距离为40 mm，拉伸速率为0.6 mm/s，每个样品做3次重复。
1.3.4 指示膜的水分含量和溶解度的测定
用失重法测定样品膜的水分含量，取2 cm×2 cm大小的膜片称其质量m1，在75℃的鼓风干燥箱中干燥48 h，称量干燥后膜的质量m2，计算水分含量，如式（1）。
取2 cm×2 cm大小的膜，在75℃的鼓风干燥箱中干燥48 h后称重得m2，将干燥后的膜样品完全浸泡在50 mL去离子水中24 h，除去水分在同条件下干燥48 h称量得 m3，计算溶解度，如式（2）。
1.3.5 指示膜水蒸气透过系数（water vapor permeability，WVP）的测定
参考GB 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法（杯式法）》[10]。将指示膜包住含有无水氯化钙的测试杯杯口，将称量后的测试杯放入装有饱和氯化钠溶液（25℃,相对湿度75%）的干燥器中，膜内外两侧保持一定的蒸汽压差，每隔1 d称量，直至质量变化小于0.001 g，每个样品做3次重复。按式（3）计算。DPPH自由基清除率按式（4）计算。
式中：L为指示膜的厚度，mm；Δm为t时间内的质量差，g；t为水分透过时间，d；S为指示膜的有效面积，m2；ΔP为指示膜两侧的水分蒸汽压差，kPa。
1.3.6 指示膜透光率的测定
参照LIU等[11]的方法，将指示膜夹持于紫外可见分光光度计的样品吸收池，使入射光束垂直通过指示膜，测定透光率。以不放指示膜时透光率为100%作为对照，每个样品做3次重复。
1.3.7 指示膜微观形态的观察
指示膜的微观形态采用SU1510扫描电子显微镜观察，将膜样品在液氮下淬段，从而得到膜样品的截面，对其进行喷金处理，在1 100倍的放大倍数下获取图像。
1.3.8 指示膜分子结构的测定
将待测样品烘干至恒重后固定于试样台上，利用NICOLET IS50傅里叶红外光谱仪进行红外吸收光谱测试。设定测试条件：谱图扫描范围600cm-1～4000cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数64次。
1.3.9 指示膜抗氧化活性的测定
指示膜的抗氧化能力按照KONG等[12]的方法并进行适当修改。称取20 mg样品（指示膜）溶于2 mL甲醇溶液中（膜提液），取1 mL膜提液与4 mL DPPH溶液（1 mmol/L）混合。将混合物剧烈摇动，然后在25℃下黑暗中放置30 min，在517 nm处测量吸光度。另取1 mL甲醇溶液与4 mL DPPH溶液混合做空白对照。
式中：A样品为样品的吸光度；A空白为空白对照的吸光度。
1.3.10 鱼肉新鲜度的检测
将新鲜草鱼去掉头尾、鱼鳞、鱼皮，鱼肉取10 g备用，将指示膜裁剪成大小为10 cm×10 cm的正方形覆盖在鱼肉上放入培养皿中并放置在4℃冰箱中储存。
将鱼肉样品打碎置于烧杯中，取100 mL煮沸杀菌并冷却至25℃后的蒸馏水倒入烧杯，均质后过滤，利用pH计读取pH值[13]；参照Wongwichian等[14]的方法测定鱼肉的硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值，并测定膜的色差变化。
1.3.11 数据处理
数据采用SPSS 18.0和Origin 8.0进行统计分析，用Duncan进行方差分析，p＜0.05为显著性差异。所有试验均重复3次。
2 结果与分析
2.1 桑葚花青素溶液在不同酸碱性下的颜色变化
不同酸碱性条件下花青素溶液中主要结构及颜色见表1。
表1 不同酸碱性条件下花青素的颜色
Table 1 Colour of anthocyanins under different acid base conditions
环境 存在形式 颜色强酸 黄烊盐离子 红色弱酸 甲醇假碱 无色弱碱 醌式碱 蓝色强碱 查尔酮 黄色
桑葚花青素在不同酸碱性下呈现出不同的颜色。这是由于酸碱性变化会导致花青素中黄烊盐离子、醌式碱、甲醇假碱以及查耳酮4种结构之间的平衡遭到破坏[15]。强酸环境时，黄烊盐离子起主要作用，所以溶液表现为黄烊盐离子的红色。随着碱性上升，黄烊盐离子逐渐转化为无色的甲醇假碱，溶液红色也随之减弱。碱性继续升高，蓝色醌型碱逐渐成为主要结构，导致溶液随之变为蓝色。最后由于环境中碱性过强，花青素不稳定而被降解，溶液变为黄色。
2.2 桑葚花青素添加量对指示膜机械性能的影响
食品运输过程中会受到压力，所以包装材料需要具有一定的机械强度。抗拉强度和断裂伸长率是评价包装膜机械性能的重要指标。桑葚花青素对指示膜机械性能的影响见图1。
图1 桑葚花青素对指示膜机械性能的影响
Fig.1 Effect of mulberry anthocyanins on mechanical properties of films
由图1可知，相比CMC膜，指示膜的抗拉强度随着桑葚花青素质量分数的增大而增大，而断裂伸长率随着桑葚花青素质量分数的增大而减小。这是因为桑葚花青素含大量酚类化合物，其羟基基团可与CMC分子形成氢键，有利于CMC链的规整排列，增强抗拉强度。与此同时，由于桑葚花青素填补了更多的空间缝隙，降低了水分与成膜基材的交联，使得膜的断裂伸长率降低[16]。这与LIU等[17]关于紫薯花青素指示膜机械性能的研究结果相类似。随着桑葚花青素质量分数的增加，CMC分子的链间距减小，从而有利于在单位面积的膜中形成具有较高分子含量的网络结构，得到更加致密的膜材料，这种良好的内部结构也有利于CMC膜强度增加。但这种致密结构也抑制了CMC分子链的活动，使指示膜的断裂伸长率有所下降。
2.3 桑葚花青素添加量对指示膜含水率及溶解度的影响
桑葚花青素对指示膜水分含量及水溶性的影响见表2。
表2 桑葚花青素对指示膜水分含量及溶解度的影响
Table 2 Effect of mulberry anthocyanins on moisture content and solubility of film
注：不同的字母表示有显著性差异（p＜0.05）。
桑葚花青素质量分数/% 水分含量/% 溶解度/%0.0 16.14±0.55 29.88±1.38f 0.1 16.14±0.52 28.93±2.40e 0.2 15.78±1.11 27.89±1.55d 0.3 16.50±0.75 27.02±1.23c 0.4 16.69±2.38 26.81±1.96b 0.5 15.24±0.98 28.37±0.89a
由表2可知，桑葚花青素的添加对指示膜的水分含量无显著影响。随着桑葚花青素质量分数不断增加，指示膜的溶解度先从29.88%降低至26.81%后又上升，溶解度的降低可能是由于桑葚花青素与羧甲基纤维素分子中的亲水基团相结合，形成了分子间作用力，使得指示膜的溶解度下降。但由于花青素是亲水性物质，过量添加会导致指示膜吸水能力更强，从而造成溶解度再次升高。
2.4 桑葚花青素添加量对指示膜水蒸气透过系数的影响
食品包装材料的主要功能之一是减少食品的水分流失，所以应尽可能使膜的水蒸气透过系数降低。桑葚花青素对指示膜水蒸气透过系数的影响见图2。
图2 桑葚花青素对指示膜水蒸气透过系数的影响
Fig.2 Effect of mulberry anthocyanins on WVP of films
由图2可以看出，桑葚花青素的加入使膜的水蒸气透过系数先降低后升高。桑葚花青素的加入使得膜的结构更加紧密，桑葚花青素对水分子的强吸附作用使指示膜不易释放水分子，水蒸气通过膜孔隙需要更长的有效路径，从而降低了水蒸气透过系数[18]。当桑葚花青素质量分数为0.3%时，指示膜的水蒸气透过系数最低，为1.39×10-10g/（cm·s·Pa）。当花青素含量超过0.3%后，花青素中含有的大量亲水酚羟基基团可使水分子更易于透过指示膜，使膜的水蒸气透过系数增高。
2.5 桑葚花青素添加量对指示膜透光率的影响
光照，尤其是紫外光会对食品品质造成一定的影响，因此，对紫外线有良好阻隔性的包装膜对保护食品品质具有重要意义[19]。桑葚花青素对指示膜透光率的影响见图3。
图3 桑葚花青素对指示膜透光率的影响
Fig.3 Effect of mulberry anthocyanins on transmittance of films
指示膜基本骨架主要由羧甲基纤维素分子构成。由图3可知，桑葚粉的加入明显改变了指示膜的透光率。在波长范围200 nm～240 nm内，添加桑葚粉的指示膜透光率均为零。而在波长240 nm～400 nm所有膜的透光率均低于纯的CMC膜。在紫外光范围内，桑葚粉的添加显著提高了指示膜对紫外光的阻隔作用，这对于保护食品品质十分重要。
2.6 指示膜的微观结构分析
对添加了不同质量分数桑葚花青素的指示膜进行微观形态分析，结果见图4。
图4 横切面扫描电子显微镜图
Fig.4 Scanning electron micrograph of the cross-section
如图4所示，纯CMC膜的横截面有明显的凹凸不平和裂纹，可能是因为CMC大分子之间的氢键作用使得分子之间发生了团聚现象，CMC颗粒易缠结团聚，不能均匀地分散，整体有聚拢趋势。当桑葚花青素质量分数为0.1%时，指示膜的截面变厚，凹凸不平和裂纹现象减缓。当桑葚花青素质量分数为0.2%时，膜无凹凸不平现象，但仍有轻微的裂纹现象。当桑葚花青素质量分数在0.3%～0.5%时，膜的截面光滑，组分均一且致密，无凹凸不平和裂纹现象。这可能是因为桑葚花青素中的酚羟基可与CMC中的羟基基团形成分子间氢键，减少聚合物中的分子内氢键和链状分子的缠结[20]。结果表明，桑葚花青素与CMC基质有着良好的相容性。
2.7 指示膜的分子结构的分析
傅里叶红外光谱可用于分析分子之间的相互作用。2种或2种以上物质混合前后其红外谱图特征峰的改变，能反映出物质的分子间作用力以及化学相互作用[21]。红外光谱图见图5。
图5 红外光谱图
Fig.5 FTIR spectra
从图5可以看出，指示膜在3 340 cm-1附近有出峰，这是-OH的伸缩振动吸收峰[22]。在2 937 cm-1和2 888cm-1处有明显的吸收振动伸缩峰，这与有机化合物的特征结构-CH2和-CH引起的吸收峰相符合[23]。1 642 cm-1处是芳香环骨架上C＝C键的振动吸收峰[24]，这与桑葚花青素提取物中的芳香族化合物极其吻合。CMC和桑葚花青素中1 041、1 022 cm-1处为C-O的伸缩振动吸收峰，指示膜中对应的峰移至1 053 cm-1处，这是因为分子间的氢键相互作用使两种大分子间发生了交联作用，形成了很强的分子间作用力，扰乱了单一组分的正常状态。从峰型上可以推断，CMC与桑葚花青素这两种化合物在化学结构上十分相似，因此两者有着良好的相容性[25]。
2.8 指示膜的抗氧化性分析
DPPH自由基清除能力可用作评定物质的抗氧化能力[26]。桑葚花青素对指示膜抗氧化性的影响见表3。
由表3可以看出，未加入桑葚花青素的CMC膜抗氧化性很弱，其DPPH自由基清除率仅为（14.96±0.08）%。加入桑葚花青素后，指示膜的抗氧化性显著增加（p＜0.05），其中，桑葚花青素质量分数为0.5%的指示膜的DPPH自由基清除率达到最高值（96.75±0.35）%。这是因为桑葚花青素是一类多酚类物质，酚羟基形成苯氧基可以消除自由基从而起到抗氧化的作用[27]。
表3 桑葚花青素对指示膜抗氧化性的影响
Table 3 Effect of mulberry anthocyanins on antioxidant activity of films
注：不同的字母表示有显著性差异（p＜0.05）。
桑葚花青素质量分数/% DPPH自由基清除率/%0.0 14.96±0.08f 0.1 34.91±0.18e 0.2 37.91±1.01d 0.3 71.92±0.11c 0.4 81.80±1.13b 0.5 96.75±0.35a
2.9 鱼肉新鲜度的检测
TBARS值是影响肉类品质的重要参数。作为脂肪的氧化产物，TBARS值能够反映脂质的氧化程度[28]。储藏期间鱼肉pH值、TBARS值以及指示膜△E的变化见图6。
图6 储藏期间鱼肉pH值、TBARS值以及指示膜△E的变化
Fig.6 Changes in the pH value,TBARS value of fish and△E of the film during storage
如图6所示，随着储藏时间的延长，鱼肉的pH值、TBARS值以及指示膜的△E均呈现上升的趋势。TBARS值在第8天时已达0.89 mg/kg，说明在储藏期间，脂质逐渐氧化。pH值由最初的6.43升高到7.96，这是因为随着储藏时间的延长，鱼肉中脂肪和蛋白质等物质在微生物的作用下被分解为氨、三甲胺等碱性含氮物质[29]。鱼肉新鲜度随着TBARS值以及pH值的上升而下降。并且随着pH值不断升高，指示膜的△E随之升高，在第8天时达到24.89，颜色变化越来越明显，这与2.1中桑葚花青素溶液颜色会随着pH值的改变而改变的结论一致。因此，在鱼肉的储藏期间，可以直接通过肉眼观察指示膜的颜色对鱼肉的新鲜度进行判别。
3 结论
利用桑葚花青素与羧甲基纤维素共混制备食品包装膜，考察桑葚花青素对指示膜理化性质及功能活性的影响。结果表明，桑葚花青素的添加对指示膜的理化性能产生了影响，膜的抗拉强度随着桑葚花青素质量分数的增加而增加，而断裂伸长率随着质量分数的增加而略有减小。桑葚花青素的添加改善了膜的阻湿性和阻光性。随着桑葚花青素质量分数的增加，截面结构变得光滑均匀，表明桑葚花青素与CMC基质有着良好的相容性。桑葚花青素与CMC之间的基团发生了较强的相互作用并依靠分子间作用力影响膜的性质，且桑葚花青素的加入未明显改变原料的成分。DPPH自由基清除试验证明桑葚花青素增强了膜的抗氧化活性。将该指示膜用于鱼肉包装，随着储藏时间延长，鱼肉逐渐变质，pH值、TBARS值不断上升，指示膜颜色随之变化，证明该膜可监测鱼肉储藏过程中的新鲜程度。研究结果可进一步拓展羧甲基纤维素膜的应用领域。
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