甲壳素，又名甲壳质、几丁质，是一种由β-1，4 糖苷键连结的天然高分子线性化合物[1]，主要存在于昆虫的外壳、甲壳类动物的骨骼和外壳中[2]。 虾、蟹等水产品的废弃物[3-5]是甲壳素的主要制备原料。 近年来，随着研究的深入，甲壳素被广泛应用于食品、医药卫生、农业、工业织染等领域[6-7]。
目前，制备甲壳素常见的方法有酸碱法、微生物发酵法、酶解法和预处理法[8-11]等，工业上制备甲壳素的主要方法是酸碱法[2]，对环境污染较大。 基于此现状，国内外把甲壳素的制备方法转向生物制备， 其中发展相对成熟的是微生物发酵法和酶解法[12-13]，酶解法与化学法相结合的方法较少[14-16]。
皮皮虾是河北省黄骅市的特产之一， 具有很高的食用价值和产品附加值[17]，但由于深加工工艺不够完善，导致产品附加值较低，存在原料浪费情况严重等问题。 采用中性蛋白酶去除蛋白质结合醋酸脱钙的方法处理黄骅特产皮皮虾虾壳， 对虾壳中甲壳素的制备工艺进行探索，提高甲壳素得率。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂及仪器
1.1.1 材料与试剂
黄骅特产皮皮虾：市售；中性蛋白酶（50 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；醋酸：天津科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠：国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠：天津市北辰方正试剂厂；碳酸钙：天津市光复精细化工研究所；硫化钠、柠檬酸钠：天津市化学试剂三厂；氢氧化钾：天津市致远化学试剂有限公司；钙红指示剂、盐酸、乙醇：天津东丽区天大化学试剂公司。 以上试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
万能粉碎机（HX-300A）：永康药具厂；高速冷冻离心机（HG-3018R）：安徽中科中佳科学仪器有限公司；恒温水浴锅（DKT200-1）：北京中兴伟业仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（SD101-1DB）、电子分析天平（FA2204B）、可见分光光度计（722VIS-722）：上海佑科仪器仪表有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 虾壳预处理
皮皮虾水煮后剔除虾肉，保留虾壳，清洗干净后置于烘箱充分烘干。 每次烘干3 h，直到烘干前后两次样品质量保持不变，粉碎机处理后过80 目筛并储存。
1.2.2 脱蛋白质工艺优化试验方案
本试验设定的3 个单因素分别为处理时间、 处理温度和酶添加量。 每个试验组向三角烧瓶中添加1 g经过预处理的虾壳粉、20 mL 蒸馏水和中性蛋白酶，混匀后水浴加热， 每组设定3 个平行试验。 酶解结束后静置，利用双缩脲试剂和可见分光光度计测定上清液中的蛋白质含量， 用以判断该条件下脱蛋白的效果，溶液的吸光度越高，说明该条件脱蛋白效果越好。
将三角瓶中残留物过滤，倾去滤液，将滤渣冲洗至中性后放入烘箱烘干，即得第一级产物。
1.2.2.1 单因素试验设计
以处理时间为单因素时， 设梯度为1、2、3、4、5 h，固定酶添加量为5 000 U，处理温度为50 ℃。以处理温度为单因素时，设梯度为30、40、50、60、70 ℃，固定酶添加量为5 000 U，处理时间为1 h。以酶添加量为单因素时，设梯度为1000、3000、5000、7 000、9 000 U，固定处理时间为1 h，处理温度为50 ℃。
1.2.2.2 中性蛋白酶脱蛋白质工艺响应面设计
分别以处理时间、 处理温度和酶添加量为自变量，依据单因素试验结果设计各变量水平，中性蛋白酶脱蛋白质工艺的响应面试验设计见表1。
表1 脱蛋白质工艺的响应面试验设计
Table 1 Design of response surface test for deproteinization process
水平A 酶添加量/UB 温度/℃C 处理时间/ h-14000451.5 0 5000502 1 6000552.5
1.2.3 脱钙盐工艺优化试验方案
本试验设定的3 个单因素分别为处理时间、 处理温度和水与醋酸体积比。 每个试验组向三角烧瓶中添加1 g 第一级产物、20 mL 醋酸溶液，混匀后水浴加热，每组试验进行3 个平行。 产物静置后利用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定法测定上清液中的钙离子的含量，用以判断该条件下脱钙盐的效果，滴定过程中消耗的EDTA 量越大，说明该条件脱钙盐效果越好。
将三角瓶中残留物过滤，倾去滤液，将滤渣冲洗至中性后烘干，即得到甲壳素。
1.2.3.1 单因素试验设计
以处理时间为单因素时，设梯度为0.5、1、1.5、2 h，固定水与醋酸体积比为9 ∶1，处理温度为40 ℃。 以处理温度为单因素时，设梯度为20、30、40、50、60 ℃，水与醋酸体积比为9 ∶1，处理时间为1 h。 以水与醋酸体积比为单因素时，设梯度为4 ∶1、9 ∶1、14 ∶1、19 ∶1、24 ∶1，固定处理时间为1 h，处理温度为40 ℃。
1.2.3.2 脱钙盐工艺响应面设计
分别以处理时间、处理温度和水与醋酸体积比为自变量，依据单因素试验结果设计各变量水平见表2。
表2 脱钙盐工艺的响应面试验设计
Table 2 Response surface test design of decalcification process
水平A 处理时间/hB 处理温度/℃ C 水与醋酸体积比-10.5186.5 ∶1 0 1 209 ∶1 1 1.52211.5 ∶1
1.3 甲壳素得率的计算
准确称量1 g 经过预处理的虾壳粉， 以优化后的脱蛋白质工艺进行脱除蛋白质，反复水洗并离心去除上清液，收集残留物，晾干后称重，计算第一级产物得率，试验进行3 个平行。
准确称量1 g 第一级产物， 以优化后的脱钙盐工艺进行脱钙，离心去除上清液后收集残留物，晾干后称重，计算该步骤得率，试验进行3 个平行。
2 结果与分析
2.1 中性蛋白酶脱蛋白质单因素试验结果
使用中性蛋白酶处理粉碎后的虾壳，分析处理时间、处理温度以及酶添加量对中性蛋白酶脱蛋白质的影响，以双缩脲法测定上清液中蛋白含量的吸光度为纵坐标，结果见图1。
图1 处理时间、处理温度和酶添加量对中性蛋白酶脱蛋白效果的影响
Fig.1 Effects of treatment time，treatment temperature and enzyme dosage on the deproteinization of neutral proteinase
在图1a 中，吸光度随着处理时间的增加先增加后减小，在2 h 时，吸光度达到最大值，此后吸光度随着处理时间增加而递减；在图1b 中，吸光度随着处理温度的增加先增加后减小，在50 ℃时，吸光度达到最大值，此后，吸光度随着处理温度的增加而减小；在图1c中， 吸光度随着酶添加量的增加先增加后减小，在5 000 U 时，吸光度达到最大值，此后吸光度随着酶添加量的增加而递减。综上，处理时间2 h、处理温度50 ℃、酶添加量5 000 U 更有利于中性蛋白酶脱除蛋白质。
2.2 中性蛋白酶脱蛋白质工艺优化
以处理时间、处理温度及酶添加量为自变量，在单因素试验的基础上，利用Design-expert 8.0.6 处理软件进行响应面试验的设计，试验设计方案及结果见表3。
表3 脱蛋白质工艺响应面试验方案及结果
Table 3 Test plan and results of deproteinization process response surface
序号 A 酶添加量/U B 处理温度/℃ C 处理时间/h 吸光度14 000501.50.174 25 0005020.184 35 000552.50.165 45 000451.50.179 55 0005020.184 66 0004520.178 76 0005520.166 85 0005020.183 94 0004520.176 105 0005020.185 115 000551.50.170 125 0005020.185 135 000452.50.178 146 000501.50.176 154 0005520.171 164 000502.50.172 176 000502.50.175
2.3 脱蛋白质工艺响应面试验分析
回归模型方差分析结果见表4。
表4 脱蛋白质工艺的响应面方差分析
Table 4 ANOVA of deproteinization process response surface
注：*表示当0.01 来源平方和 自由度均方F 值P 值显著性模型 6.392×10-497.102×10-5 33.03 <0.000 1**A5.000×10-715.000×10-7 0.23 0.644 3 B1.901×10-411.901×10-4 88.43 <0.000 1**C1.013×10-511.013×10-5 4.71 0.066 6 AB1.225×10-511.225×10-5 5.70 0.048 4*AC2.500×10-712.500×10-7 0.12 0.743 1 BC4.000×10-614.000×10-6 1.86 0.214 8 A21.095×10-411.095×10-4 50.94 0.000 2**B21.698×10-411.698×10-4 78.97 <0.000 1**C29.904×10-519.904×10-5 46.07 0.000 3**残差 1.505×10-572.150×10-6失拟项 1.225×10-534.083×10-6 5.83 0.060 7纯误差 2.800×10-647.000×10-7总方差 6.542×10-416 R2= 0.977 0，R2Adj=0.947 4，CV=0.83%
由表4 可知，B、A2、B2、C2 对工艺的影响极显著，AB 的影响显著，说明这3 个因素对脱蛋白的效果影响较为复杂。 模型显著性检测P＜0.000 1，说明此模型极显著；模型失拟项P=0.060 7，不显著，说明方程拟合度较高， 可以用于判断3 个因素对虾壳脱蛋白质效率的影响。 模型的决定系数R2=0.977 0， 调整决定系数
=0.947 4，说明该模型可以良好的表现出选定的各个因素与响应值之间的关系[18]，CV 值为0.83%，CV 值较小，说明试验的精度较高，试验较为可靠[19-20]。 A、B、C 3 个因素的F 值分别为0.23、88.43、4.71， 说明了3个因素对脱蛋白率的影响程度由大到小依次是：处理温度＞处理时间＞酶添加量。
脱蛋白试验的残差正态图见图2。
由图2 可以看出， 所有数据均匀地分布在拟合分布线的两侧，不存在严重的偏差，与方差分析表显示的结果一致。
图2 脱蛋白试验的残差正态分布
Fig.2 Residual normal map of deproteinization test
等高线图可以表现各因素的交互作用，等高线越呈椭圆形交互作用越强。 响应曲面图通过曲面的坡度来表现因素对响应值的影响程度，曲面坡度越大，说明响应值受到的影响越大[18]。 各因素交互作用对吸光度影响的响应曲面及等高线图见图3。
由图3 可以看出，处理温度与酶添加量、处理温度与处理时间之间的交互作用的曲面坡度相对较大，而处理时间与酶添加量交互作用的曲面较平缓， 图3 与方差分析表中数据相对应，进一步说明处理温度对于中性蛋白酶脱除虾壳蛋白质的影响较处理时间和酶添加量更为明显。
图3 各因素交互作用对吸光度影响的响应曲面及等高线
Fig.3 Response surface and contour map of the interaction of various factors on absorbance
2.4 中性蛋白酶脱蛋白质的工艺验证
依照响应面分析法所得到的最优脱蛋白质条件为：酶添加量5 090.26 U、温度48.05 ℃、处理时间1.96 h，结合现实情况和试验的便利性，取最优工艺为酶添加量5 000 U、温度48 ℃、处理时间2 h。 按照此工艺进行5 次平行试验，得到溶液的吸光度为0.185，与预测值0.185 2 差别很小，可以判定该模型适用，且确定此工艺为使用中性蛋白酶处理黄骅皮皮虾虾壳脱蛋白质的最优工艺。
2.5 醋酸脱钙盐单因素试验结果
以滴定中消耗的EDTA 体积作为纵坐标反映上清液中钙盐的含量情况，处理时间、温度和水与醋酸体积比对醋酸脱钙盐效果的影响见图4。
图4 处理时间、处理温度和水与醋酸体积比对醋酸脱钙效果的影响
Fig.4 Effects of treatment time，treatment temperature and acetic acid concentration on the decalcification of acetic acid
结果表明，处理时间为1 h、处理温度为20 ℃、水与醋酸体积比为9∶1 时，消耗的EDTA 溶液最多，说明此时上清液中的钙离子浓度最高。 随着处理温度的提高，上清液中钙离子降低，推测可能是由于醋酸是一种具有强挥发性的酸，随着处理温度的提高，瓶内醋酸挥发量会逐渐增多， 从而使三角瓶内醋酸浓度下降，影响虾壳脱钙盐的效率。
2.6 醋酸脱钙盐工艺响应面优化
以处理时间、处理温度和水与醋酸体积比为自变量，利用Design-expert 8.0.6 处理软件进行响应面试验的设计，试验方案及结果见表5。
表5 脱钙盐工艺的响应面试验方案及结果
Table 5 Response surface test scheme and results of decalcification process
序号A 处理时间/ h B 处理温度/℃EDTA 消耗量/mL 1 1 209 ∶14.246 C 水与醋酸体积比1811.5 ∶14.036 3 1 209 ∶14.245 2 1 186.5 ∶14.086 5 1.52011.5 ∶14.036 6 0.52011.5 ∶14.056 7 1.5229 ∶14.126 8 1.5206.5 ∶14.096 9 1 2211.5 ∶14.085 4 1 101.5189 ∶14.078 111209 ∶14.236 121226.5 ∶14.065 131209 ∶14.266 140.5206.5 ∶14.036 150.5229 ∶14.116 161209 ∶14.296 170.5189 ∶14.096
2.7 脱钙盐工艺的响应面试验的分析
回归模型方差分析结果见表6。
由表6 可知，二次项A2、B2、C2 对脱钙盐的效率影响极显著，3 个交互项影响均不显著，说明这3 个因素对脱蛋白的效率影响较为简单，醋酸脱钙盐的反应为比较单纯的化学反应，3 个因素之间交互作用很弱。模型显著性P<0.000 1，说明此模型极显著；模型失拟项P=0.831 8，不显著，说明方程拟合度较高，可以用于判断处理温度、处理时间和水与醋酸体积比对虾壳脱钙盐效率的影响。 R2=0.978 3，R2Adj=0.950 4，说明此模型符合实际情况，CV=0.48%，CV 值小，说明试验的精度较高，试验较为可靠。A、B、C 3 个因素的F 值分别为0.32、2.87、1.53，说明3 个因素对脱蛋白率的影响程度由大到小依次是：处理温度＞水与醋酸体积比＞处理时间。
表6 脱钙盐工艺的响应面试验方差分析
Table 6 Variance analysis of response surface test for decalcification process
注：**表示当P＜0.01 时，差异性极显著。
来源平方和 自由度均方F 值P 值显著性模型0.1390.01435.09 ＜0.000 1**A1.280×10-411.280×10-4 0.32 0.589 6 B1.152×10-311.152×10-3 2.87 0.133 8 C6.125×10-416.125×10-4 1.53 0.256 2 AB1.960×10-411.960×10-4 0.49 0.506 9 AC1.600×10-311.600×10-3 3.99 0.085 9 BC1.225×10-311.225×10-3 3.06 0.123 9 A20.02910.02972.20 ＜0.000 1**B20.02110.02152.81 0.000 2**C20.06010.060148.53 ＜0.000 1**残差 2.805×10-374.008×10-4失拟项 5.005×10-431.668×10-4 0.29 0.831 8纯误差 2.305×10-345.76×10-4总方差0.1316 R2=0.9783，R2Adj=0.950 4，CV=0.48%
脱钙盐试验的残差正态图见图5。
图5 脱钙盐试验的残差正态分布
Fig.5 Residual normal diagram of decalcification test
由图5 可知， 所有数据均匀地分布在拟合分布线的两侧，不存在严重的偏差。
各因素交互作用EDTA 消耗量影响的响应曲面及等高线见图6。
由图6 可知，在处理时间、处理温度和水与醋酸体积比任一因素固定时，随着另外两个因素的升高，响应值先升高后下降。综上可得，当处理时间1 h、处理温度20 ℃、水与醋酸体积比8.92 ∶1 时，响应值最高，曲线较陡。 且等高线图及相应曲面图均与方差分析表中数据相对应，结果一致。
图6 各因素交互作用EDTA 消耗量影响的响应曲面及等高线
Fig.6 Response surface and contour map of EDTA consumption influenced by interaction of various factors
2.8 醋酸脱钙盐的工艺验证
依照响应面分析法所得到的最优脱钙盐条件为：处理时间1.02 h、 处理温度20.17 ℃， 水与醋酸体积比8.92 ∶1。 结合现实情况和试验的便利性，确定处理时间1 h，处理温度20 ℃，水与醋酸体积比9 ∶1 为最优工艺。以此条件进行5 次验证试验，得到EDTA 的消耗量为4.26 mL，与预测值4.258 mL 差别很小，可以判定该模型适用，确定此工艺为使用醋酸处理黄骅皮皮虾虾壳脱钙盐的最优工艺。
2.9 甲壳素得率
准确称量1 g 经过预处理的虾壳粉进行脱除蛋白质后，计算第一级产物得率，3 个平行试验得率分别为38.09%、38.19%和37.86%。 因此第一级产物最终得率为38.04%。
以1 g 第一级产物进行脱钙，3 个平行试验得率分别为17.92%、18.20%和18.04%， 该步骤最终得率为18.05%。
两步骤得率乘积即为甲壳素最终得率。 所以，以黄骅当地特产皮皮虾为材料，经本试验优化方案制备甲壳素，得率为6.87%。
3 结论
本试验以河北省沧州黄骅市的特产皮皮虾虾壳为原料，采取中性蛋白酶脱蛋白质、醋酸脱钙盐相结合的方式处理皮皮虾虾壳，探索并优化工艺条件，得到更加环保、有效率的甲壳素制备工艺。 本试验确定中性蛋白酶脱蛋白的最佳工艺条件为处理时间2 h、 处理温度48 ℃、酶添加量5 000 U；醋酸脱钙盐的最佳工艺条件为处理时间1 h、处理温度20 ℃、水与醋酸体积比9 ∶1。经本研究优化后的甲壳素工艺，其得率为6.87%。 本试验为利用中性蛋白酶结合醋酸制备甲壳素的工艺探究，为生物法结合化学法制备甲壳素提供一定的数据支持，以此拓宽利用水产品废弃物进行精深加工的思路。
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