蚕蛹是蚕丝业的主要伴生产物，除18 种氨基酸组成比例符合营养最佳的组合模式[1-3]外，还有多种重要生理功能（如健脾、安神、益精、壮阳等），自古以来就在许多亚洲国家被广泛使用[4-9]，在20 多年前就已被卫生部纳入食品资源。 蚕蛹水解物中必需氨基酸含量高达40%，因此蚕蛹蛋白精深加工技术研究开发及产物的应用在国内外被广泛关注[10]。蚕蛹水解物[11-12]具有较强的清除自由基的能力，对DPPH 自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率分别可达到90.19%、24.79%和37.07%。 基于酶促作用是解决蚕蛹蛋白致敏风险的有效措施[13]，吴文湧等[14]建立了中性蛋白酶酶促水解蚕蛹工艺条件。 目前虽然有很多酶促水解蚕蛹蛋白的工艺，但迄今鲜见基于固态发酵方式制备蚕蛹多肽的研究。
本文以米曲霉（Aspergillus orzyae）为对象，探讨了水解温度、时间及加酶量等参数对脱脂蚕蛹蛋白粉水解度影响，并通过正交试验优化全细胞固态培养降解蚕蛹蛋白的条件，并对分离纯化后的多肽抗氧化性能进行研究，为开发无臭蚕蛹蛋白肽生产技术奠定基础。
1 材料和方法
1.1 原料与试剂
米曲霉（Aspergillu orzyae）：上海迪发酿造生物制品有限公司；脱脂蚕蛹粉：成都世煌生物科技有限责任公司；麸皮：成都牧山食品有限公司。
Sephadex G-25 凝胶树脂、DPPH： 美国Sigma 公司；焦性没食子酸、VC、VE、牛血清清蛋白（bovine albumin，BSA）、硫酸铜、硫酸钾、酒石酸钾钠、三氯乙酸、甲醛（分析纯）：四川蜀都化学试剂公司。
1.2 仪器与设备
GL-20G-C 高速冷冻离心机： 上海安亭科学仪器有限公司；ST3100/F pH 计：上海奥豪斯仪器有限公司；FW100 高速万能粉碎机：天津市泰斯特试验设备有限公司；FDZF-6030A 真空冷冻干燥箱： 上海博迅公司；Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶柱层析柱（1.8 cm×25 cm）、HL-2 恒流泵、BSZ-100 自动部分收集器： 上海沪西分析仪器厂；RLPHR1-4 LSC 型冷冻干燥机：CHRIST公司。
1.3 方法
1.3.1 试验方法
蚕蛹粉和麸皮充分混匀后加入90%蒸馏水，121 ℃灭菌30 min。 接种1%米曲霉孢子，48 h 后倒瓶培养，继续培养24 h，加入90%的生理盐水进行发酵，分别测定发酵产物水解度、多肽得率。
1.3.2 测定方法
1.3.2.1 酶活力测定
福林酚法测定中性蛋白酶酶活力[15]。
1.3.2.2 多肽得率的测定
称取1.00 g 发酵底物， 用研钵研磨5 min 后定容50 mL，静置30 min 后10 000 r/min 离心5 min，取10 mL滤液加入10 mL 10%三氯乙酸溶液静置沉淀30 min，10 000 r/min 离心5 min。 取1mL 上清液用双缩脲法测定多肽得率[16-17]。
1.3.2.3 水解度测定方法
采用pH-state 法[18]用下式计算水解度，此处水解度的含义为水解打断的肽键数目占原料蛋白质中总肽键数的百分数。
水解度/%=（C×V）/（α×mp×htot）×100
式中：C、V 分别为水解过程中所加NaOH 的浓度（mol/L）和体积（mL）；mp 为原料中蛋白质质量g；htot 为1 g 原料蛋白质中所含肽键的毫摩尔数，取为7.8 mmol/g 蛋白；α 为氨基的平均解离度，可按α=（10pH-pK）/（1+10 pH-pK）（pH 为水解溶液的pH 值；pK 为α-氨基的解离度的负对数，此处取值为7.0）。
1.3.3 蚕蛹多肽工艺的优化
在单因素试验的基础上，以水解温度、水解时间、加酶量为正交试验的影响因素，以多肽得率和水解度为评价指标，采用L9（33）正交设计确定米曲霉水解蚕蛹蛋白制备多肽的最佳工艺。 正交试验因素和水平见表1。
表1 蚕蛹水解工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for technology optimization of silkworm pupa meal
?水平A 水解温度/℃B 水解时间/dC 加酶量/（U/g）1 2532 150 2 3042 368 3 3552 632
1.3.4 多肽纯化
1.3.4.1 多肽纯化方法
将多肽提取液过滤后用Sephadex G-25 葡聚糖凝胶树脂进行纯化，在上样浓度0.6 mg/mL、上样量1 mL的条件下，用流速为1.2 mL/min 的去离子水进行洗脱，并在检测波长为280 nm 的条件下，收集洗脱后的纯化多肽样品， 用冷冻干燥器将纯化多肽制备为粉末，并配制不同浓度多肽溶液进行抗氧化性能测定[19]。
1.3.4.2 纯化多肽抗氧化性能力测定
1）DPPH 自由基清除能力的测定
DPPH 自由基清除能力的测定参照Atoui 等[20]的方法。 按式（1）计算其对DPPH 自由基清除率。
DPPH 自由基清除率/% = [1-（AI-AJ）/A0]×100 （1）
式中：AI 为2 mL 样品液的吸光度；AJ 为2 mL 乙醇+2 mL 样品液的吸光度；A0 为2 mL 样品溶液+2 mL DPPH 溶液的吸光度。
2）羟自由基（·OH）清除能力
参照张宏梅等[21]的方法测定羟自由基（·OH）清除能力。 按式（2）计算·OH 清除率。
式中：A 样为样品的吸光度；A 损为双氧水+测试溶剂的吸光度；A 未为蒸馏水+测试溶剂的吸光度。
1.4 数据处理
每个样品3 次平行检测，结果采用SPSS19.0 软件对各项指标数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
各因素对蚕蛹蛋白水解度及多肽得率的影响见图1。
图1 各因素对蚕蛹蛋白水解度及多肽得率的影响
Fig.1 Influence of three factors on silkworm pupa protein degree of hydrolysis and peptide yield
由图1a 可知，多肽得率随着水解温度的升高呈现先降低后升高再降低的趋势，而水解度却随着水解温度的升高呈现递增的趋势。 在25℃恒温培养水解过程中，多肽得率达到最大为18.23 mg/mL，而水解度却在45 ℃水解过程中达到最大为12.35%。这是因为在一定的水解条件下， 温度是影响酶促反应的主要因素，随着温度的升高其酶促反应速度加快，水解度逐渐增大，但过高温度会导致多肽被分解转化为氨基酸， 不利于多肽的制备，因此选择水解温度25、30、35 ℃进行正交试验。
由图1b 可知随着水解时间的延长，多肽得率和水解度均呈现先增加后减小的趋势，这是因为前期菌体生长繁殖且不断产生蛋白酶水解蚕蛹蛋白，所以水解度和多肽得率均在增加， 水解度在第4 天达到最大14.32%，而多肽得率在第5 天达到最大值11.82 mg/mL。继续水解多肽得率降低，因为水解初期微生物生长代谢仅需少许蛋白用于自身的生长繁殖消耗，但到了发酵后期底物消耗较大虽然仍有部分大分子蛋白尚未被水解， 但部分分子量小的多肽被微生物优先利用，因此出现多肽得率下降的趋势[22-23]。 若继续水解肽类物质可能迅速减少， 因此选择水解时间3、4、5 d 进行正交试验。
由图1c 可知，水解度和多肽得率随加酶量的增加均先增加后降低，在加酶量2 368 U/g 时，多肽得率达到最高为10.54 mg/mL。在相同时间内随着加酶量的升高其水解程度更为彻底，在加酶量为2 895 U/g 时水解度达到最大10.51%，而其水解程度越大所产生多肽的含量就会相应减少[24-25]。 而另一方面由于微生物发酵制备多肽是一个动态的过程，在水解过程中过量的酶分子又会抑制中间产物向酶解反应终产物的转化，即其水解度和多肽的含量就会略有降低。 因此最佳加酶量选择为2 368 U/g， 并选择加酶量为2 150、2 368、2 632 U/g 进行正交试验。
2.2 正交试验结果分析
正交试验结果见表2， 以多肽得率和水解度为指标的方差分析结果分别见表3 和表4。
表2 蚕蛹水解工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation technology optimization of silkworm pupa meal
序号水解度/%11118.0411.12 12221.214.62 1334.0521.42 21215.008.52 22316.977.58 23114.679.42 31316.417.43 3214.5520.22 3327.5918.32 14.46 16.51 12.41 15.54 14.24 14.62 9.518.7512.48 6.037.762.21 12.419.0413.61 8.5110.82 10.50 15.34 16.41 12.15 6.837.733.11 ABC多肽得率/（mg/mL）123456789多肽得率k1 k2水解度k3Rk1 k2 k3R
表3 以多肽得率为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results using flavonoids content as evaluation index
注：*表示差异显著（P＜0.05）。
变异来源 偏差平方和 自由度均方F 值显著性A186.30293.154.37*B286.092143.046.72*C 28.48214.240.67误差426.062021.30总计5 608.7327校正的总数926.9226
表4 以水解度为评价指标的正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using degree of hydrolysis as evaluation index
注：*表示差异显著（P＜0.05）。
变异来源偏差平方和 自由度均方F 值 显著性A 211.142105.575.13*B 266.552133.276.48*C 13.40221.701.06误差411.482020.57总计4 877.1727校正的总数932.2726
由表2 可知，影响多肽得率的各因素的主次顺序为B＞A＞C，影响水解度的各因素的顺序为B＞A＞C。 由表3 可知，水解温度、水解时间均对多肽得率有显著性影响（P<0.05）。由表4 可知，水解时间、水解温度均对水解度有显著性影响（P＜0.05），加酶量对水解度和多肽得率的影响均不显著（P＞0.05）。综合考虑，选择最优组合为A2B1C2，即水解温度30 ℃、水解时间3 d、加酶量2 368 U/g，并在此条件下进行验证试验，其多肽得率为21.35 mg/mL，其水解度为4.58%，优于正交试验的各组合。 因此全细胞固态培养水解蚕蛹蛋白的最优工艺条件选择为水解温度30℃、水解时间3d、加酶量2368 U/g。
2.3 蚕蛹多肽分离纯化效果
多肽洗脱图谱如图2 所示。
图2 蚕蛹多肽洗脱图谱
Fig.2 Eluction chart of polypeptide
有两个组分的肽段被分离，且组分Ⅱ峰高明显大于组分Ⅰ。闵建华等[26]使用Sephadex G-25 交联葡聚糖凝胶柱分离蚕蛹蛋白水解液后也得到两个不同组分，但其组分Ⅰ为主要成分。 而赵鹏等[27]将蚕蛹蛋白水解液用Sephadex G-25 交联葡聚糖凝胶柱分离后，得到3 个较明显的峰。 这可能是由水解产生的肽单位的分子大小差异产生的结果。
2.4 纯化多肽清除自由基的能力
2.4.1 纯化多肽DPPH 自由基清除能力
将纯化后多肽组分Ⅰ和组分Ⅱ与VC、VE 进行抗氧化活性比较，结果见图3。
从图3 可知，组分Ⅰ抗氧化性优于组分Ⅱ，但均低于对照组抗氧化性。 在试验浓度范围内，随着蚕蛹多肽浓度的升高， 蚕蛹多肽对DPPH 自由基清除率线性增加，当蚕蛹多肽浓度为0.6 mg/mL 时，组分Ⅰ和组分Ⅱ对DPPH 自由基清除率达到37%、36%，但远远低于VC、VE 的抗氧化能力。
图3 多肽对DPPH 自由基的清除率
Fig.3 Scavenging rate of DPPH free radical by polypeptide
2.4.2 纯化多肽·OH 清除能力
纯化多肽对·OH 的清除率结果如图4 所示。
图4 多肽对·OH 的清除率
Fig.4 Scavenging rate of·OH by polypeptide
当纯化多肽浓度在0.4 mg/mL～0.6 mg/mL 范围时，组分Ⅰ和组分Ⅱ对·OH 清除能力显著高于对照组VC和VE，多肽浓度在0.6 mg/mL 时，组分Ⅰ和组分Ⅱ对·OH 的清除率分别为83%、94%，且组分Ⅱ在不同浓度下对·OH 的清除率均高于对照组VC 和VE。 蚕蛹蛋白水解制备的多肽具有较好的抗氧化能力，尤其·OH 的清除能力较强。
3 结论
本研究以蚕蛹粉和麸皮为原料，通过单因素和正交试验对蚕蛹粉水解条件进行优化，得到制备蚕蛹多肽的最优水解条件为：水解时间3 d、水解温度30 ℃、加酶量2368U/g。在此优化条件下多肽得率为21.35mg/mL，水解度为4.58%。蚕蛹多肽具有较强的·OH 清除能力，清除率达到94%。 此工艺制备多肽虽然水解时间稍长， 但此水解工艺简便且可以得到安全无臭多肽产品，在一定程度上为蚕蛹资源的开发和利用提供理论和技术支撑。
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