软枣猕猴桃是猕猴桃科、猕猴桃属大型落叶藤本植物，分布广泛，物种资源丰富，是一种珍贵的经济果树，在食品和保健品领域具有良好的开发前景[1-2]。随着近几年关于软枣猕猴桃的研究越来越多，其中的生物活性成分不断被开发出来，主要有多酚类、蒽醌类和多糖类化合物。 软枣猕猴桃中的多酚类物质可以赋予人体较强的抗氧化能力，现有研究主要集中在软枣猕猴桃功能活性物质的提取和衍生食品的加工[3]，将软枣猕猴桃加工成老少皆宜的复合酵素饮料是一种有效提升农产品附加值的手段。
水果酵素饮料是指果蔬在多种有益菌的自然条件下发酵产出的富含酶、多种维生素、矿物质和次生代谢产物等功能成分的发酵饮品。酵素饮料在海外已被大众所认同，根据已有的学术报道，酵素饮料具有抑菌、抗氧化、改善肠道菌群等功效[4]，有利于人体健康。
目前，对于水果酵素饮料的研究较多，研究方向主要集中在生产工艺和功能作用领域。 如郭伟峰等[5]以超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力为指标，优化了利用乳酸杆菌发酵桑葚果汁制备桑葚酵素饮料的工艺； 宁楚洁等以总酸和DPPH 自由基清除率为指标，利用响应面试验方法优化玉米须果蔬复合饮料制备工艺，且产品对DPPH 自由基具有较强的清除作用[6]。 本研究以软枣猕猴桃、百香果和寒富苹果为主要原料，借助响应面试验方法研究了复合酵素饮料的生产工艺，考察发酵前后DPPH 自由基、羟自由基、ABTS+自由基清除能力等指标并与抗坏血酸进行对比评价其抗氧化活性[7-8]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
软枣猕猴桃、寒富苹果、百香果：市售；葡萄酒酵母：安琪酵母股份有限公司；复合乳酸菌（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌）：河北一然生物科技有限公司。
白砂糖：太古糖业有限公司；柠檬酸：河南万邦实业有限公司；抗坏血酸（分析纯）：卡而铭商贸有限公司；DPPH（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、无水碳酸钠、邻苯三酚、过氧化氢、硫酸亚铁（分析纯）：国药化学试剂厂；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS 法）：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
FA1104 电子天平： 东阳市英衡智能设备有限公司；VD650 超净工作台：浙江苏珀仪器设备有限公司；LDZX-50KBS 立式高压蒸汽灭菌锅： 浙江新丰医疗器械有限公司；DHP-9052 电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；TD-45/TD-92 手持糖度计：深圳市速维电子科技有限公司；ST2100/B pH 计：上海越平精密仪器设备有限公司。
1.3 软枣猕猴桃复合果蔬饮料的工艺流程
水果原料→无菌条件下清洗、去皮、切块（片）→平铺于发酵罐→接种复合发酵剂→过滤除菌→低温无菌灌装→成品
1.3.1 原料预处理
选择大小均一且无外部损伤的等质量软枣猕猴桃、寒富苹果和百香果，在超净工作台上用无菌水清洗并切片（块）。 发酵过程所使用的器皿和发酵罐均用高压灭菌锅充分灭菌。
1.3.2 酵素饮料的制备
将软枣猕猴桃、寒富苹果及百香果与白砂糖按照2∶1（质量比）平铺于已灭菌的发酵罐中，重复码放至7分或8 分满。
1.3.3 接种与发酵
取适量无菌水与乳酸菌-葡萄酒酵母复合发酵剂（1∶1）混合，再加入等质量的葡萄糖，置于35 ℃条件下活化30 min。待活化完全后倒入发酵罐，置于适宜的温度下发酵1～3 个月，直到无气体产生，pH 值为2～4，即发酵中止。 即得天然发酵的水果酵素[9]。
1.4 单因素试验
选取发酵时间30、40、50、60、70 d， 发酵温度26、28、30、32、34 ℃以及乳酸菌-葡萄酒酵母复合发酵剂接种量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%为单因素， 以产品总酸含量为评价指标进行单因素试验。
1.5 Box-Behnken 试验设计
依据单因素试验的结果选取合适的水平，并且以产品总酸含量为响应值，利用Design-Expert8.0.6 软件的Box-Benhnken 试验设计原理进行三因素三水平的响应面试验[10]，因素水平如表1 所示。
表1 Box-Benhnken 试验因素水平
Table 1 Factor levels in Box-Benhnken test
?水平因素A 发酵时间/d B 发酵温度/℃ C 复合发酵剂接种量/%-150281.5 0 60302.0 1 70322.5
1.6 酵素饮料的调配
发酵后的软枣猕猴桃复合饮料经过滤、离心后加入一定量的柠檬酸和白砂糖以平衡糖酸比和口感，进行全因子试验以达到最适的口感和风味。 全因子试验方案和感官评价标准如表2、表3 所示。
表2 全因子试验水平
Table 2 Full factor test level
水平因素A 白砂糖/%B 柠檬酸/%1 1 0.02 2 3 0.04 3 5 0.06
表3 软枣猕猴桃复合酵素饮料感官评价指标
Table 3 Sensory evaluation index for Actinidia arguta complex ferment beverage
感官指标判定标准总分色泽色泽均一稳定，呈淡绿色25香气具有软枣猕猴桃和其它水果的果香25滋味糖酸比适当、无酸涩感25口感产品形态均一稳定、口感顺滑、无卡喉感25
1.7 酵素饮料理化指标的测定
软枣猕猴桃复合酵素饮料的总酸含量采用GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的滴定法测定；pH 值采用GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH 值的测定》中的pH 计法测定；可溶性固形物含量采用GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》中的折光法测定。
1.8 酵素饮料微生物指标的测定
微生物指标主要有大肠菌群、霉菌、酵母菌和菌落总数。 大肠菌群采用GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》测定；霉菌和酵母菌计数采用GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母菌计数》测定；菌落总数采用GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》测定。
1.9 自由基清除率的测定
1.9.1 DPPH 自由基清除率的测定
取软枣猕猴桃酵素复合饮料2 mL 转移到10 mL的试管中， 再加入2 mL 浓度为2×10-4 mol/L 的DPPH-80%乙醇水溶液，充分混匀后，静置0.5 h，用80%乙醇溶液调零，在517 nm 处测其吸光度，记为A1；将DPPH溶液和80%乙醇溶液各2 mL 混匀后， 相同条件下测其吸光度为A0； 将样品和80%乙醇溶液各2 mL 混匀后，相同条件下测其吸光度为A2，重复3 次试验。 DPPH自由基清除率用以下公式计算[11-12]。
DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1－A2）/A0]×100
式中：A0 为2 mL 的DPPH 溶液和2 mL 80%的乙醇混合液的吸光度；A1 为2 mL DPPH-80%乙醇水溶液和2 mL 样品液的吸光度；A2 为2 mL 样品液与2 mL的80%乙醇混合溶液的吸光度。
1.9.2 ABTS+自由基清除能力的测定
ABTS+自由基清除能力采用试剂盒中说明书标注的方法进行测定，并根据已知的标准曲线计算该指标。
1.9.3 羟自由基清除率的测定
在0.45 mL 样品中加水定容至2 mL， 然后添加6 mmol/L 的过氧化氢1.4 mL、20 mmol/L 的水杨酸钠0.6 mL 和2 mL 浓度为1.5 mmol/L 的FeSO4·7H2O，最后置于37 ℃环境中水浴60 min。 蒸馏水进行调零，在760 nm 处对样品的吸光度A 进行测量， 重复次数为3次[13-14]。 羟自由基清除率用下列公式进行计算。
羟自由基清除率/%=[（A1－A2）/A1]×100式中：A1 为空白的平均吸光度；A2 为样品液的平均吸光度。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 发酵时间的确定
发酵时间对产品总酸含量的影响见图1。
图1 发酵时间对产品总酸含量的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on total acid content of products
由图1 可知， 软枣猕猴桃复合酵素饮料发酵时间在60 d 时总酸含量最高（4.08 g/L），总酸含量可以反映酵素饮料发酵体系进行的程度，0～60 d 内体系发酵程度逐渐增加，积累初级代谢产物。 而在60 d 后反应体系中的各种有机酸被转化成次级代谢产物，这是由于在发酵初期菌种大量繁殖，而在发酵一段时间后菌种逐渐沉淀，因此发酵时间为60 d 时的酵素饮料发酵最完全。
2.1.2 发酵温度的确定
发酵温度对产品总酸含量的影响见图2。
由图2 可知，当发酵温度低于28 ℃时发酵体系中代谢产物积累缓慢，当发酵温度高于28 ℃后反应速度加快，产物合成增多。 当发酵温度大于30 ℃后体系温度不利于微生物代谢，酵母菌与乳酸菌生长受到抑制导致体系总酸含量降低。 因此软枣猕猴桃复合酵素饮料最适的发酵温度为30 ℃。
图2 发酵温度对产品总酸含量的影响
Fig.2 Effect of fermentation temperature on total acid content of products
2.1.3 复合发酵剂接种量的确定
复合发酵剂接种量对产品总酸含量的影响见图3。
图3 复合发酵剂接种量对产品总酸含量的影响
Fig.3 Effect of compound starters inoculum amount on total acid content of products
由图3 可知，当复合发酵剂接种量小于1.5%时总酸积累速率较慢，而当复合发酵剂接种量大于1.5%时体系总酸含量趋于稳定且增速放缓。 考虑到实际发酵控制和生产成本两个因素，选择1.5%为最适的复合发酵剂接种量，此时总酸含量为3.31 g/L。
2.2 Box-Behnken 试验设计结果
响应面法优化软枣猕猴桃复合酵素饮料的发酵工艺结果如表4 所示。
2.3 二次回归方程的拟合及响应面分析与方差分析
对表4 中的响应值进行多元回归拟合分析，确立如下回归方程：Y=3.71+0.08A+0.08B+0.065C+0.075AB+0.03AC+0.04BC-0.16A2-0.17B2-0.14C2。 方差分析结果见表5。
表4 软枣猕猴桃复合酵素饮料Box-Behnken 试验设计结果
Table 4 Results of Box-Behnken design of Actinidia arguta complex ferment beverage
试验号ABC总酸含量/（g/L）1 0 0 0 3.67 2 0 0 0 3.72 3-103.29 4 0-1-13.31 1-113.35 6-1-103.31 7 0 1-13.38 5 0 3.61 9 1 0-13.41 8 1 1 0 101013.61 110003.71 12-1013.36 13-10-13.28 140003.74 150113.58 160003.71 17-1103.33
由表5 结果可知，模型极显著，失拟项不显著，相关系数R2=0.990 6， 调整系数R2adj=0.978 5， 变异系数（CV）=0.75%。 以上数据表明了该模型拟合性较好，重现性稳定。 显著性检验表明，在所取的各因素范围内，影响软枣猕猴桃复合酵素饮料发酵工艺条件的主次顺序为A（发酵时间）=B（发酵温度）＞C（复合发酵剂接种量）。 其中一次项A、B 和C， 交互项AB 和二次项A2、B2 和C2 对软枣猕猴桃复合酵素饮料发酵工艺的影响均为极显著（P＜0.01）， 交互项BC 影响显著（P<0.05）。
表5 响应面试验方差分析
Table 5 Response surface test analysis of variance
注：**表示差异极显著，P<0.01；*表示差异显著，P<0.05。
方差来源 平方和 自由度均方F 值P 值显著性模型0.5190.05682.01 <0.000 1**A0.05110.05174.67 <0.000 1**B0.05110.05174.67 <0.000 1**C0.03410.03449.29 0.000 2**AB0.02210.02232.81 0.000 7**AC3.60×10-313.60×10-3 5.250.055 7 BC6.40×10-316.40×10-3 9.330.018 5*A20.110.1152.32 <0.000 1**B20.1210.12172.28 <0.000 1**C20.0810.08116.09 <0.000 1**残差 4.80×10-376.86×10-4失拟项 2.20×10-337.33×10-4 1.130.437 6 不显著纯误差 2.60×10-346.50×10-4总离差0.5116
响应面分析结果见图4。
响应面分析图可直观地看出各因素的交互作用对产品感官评分的影响，曲面越陡峭则说明该因素对响应值的结果影响越大。 由图4 可知，发酵温度、发酵时间和复合发酵剂接种量两两相互作用对产品总酸含量的影响较为显著。
图4 因素交互效应对饮料总酸含量影响的响应面图
Fig.4 Response surface of interaction effects of factors on total acid content of beverage
2.4 酵素饮料发酵条件的验证试验
根据Design-Expert8.0.6 数学建模的优化分析，得出软枣猕猴桃复合饮料的最优发酵条件为：发酵时间62 d、发酵温度30.66 ℃、复合发酵剂接种量2.21%，预测总酸含量为3.747 9 g/L。为了方便实际生产，将工艺参数调整为：发酵时间62 d、发酵温度30.6 ℃、复合发酵剂接种量2.2%，进行3 次重复试验，测得平均总酸含量为3.78 g/L，与预测值接近，误差值为0.86%，表明该模型在实践中可行。
2.5 软枣猕猴桃复合酵素饮料的调配结果
软枣猕猴桃复合酵素饮料的调配试验结果见表6。
表6 软枣猕猴桃复合酵素饮料的调配试验结果
Table 6 Experimental results of preparation of Actinidia arguta complex ferment beverage
试验号因素感官评分A B 89.76 2 1 2 94.61 1 1 1 92.11 4 2 1 94.12 3 1 3 93.21 6 2 3 96.36 5 2 2 94.27 8 3 2 96.54 7 3 1 9 3 3 93.76
根据全因子试验结果， 得出当白砂糖添加量为5%，柠檬酸添加量为0.04%时风味最佳，此时的产品色泽均一稳定、果香浓郁、糖酸比适中。
2.6 软枣猕猴桃复合酵素饮料的微生物指标
对优化方案加工的软枣猕猴桃复合酵素饮料进行微生物检测显示，微生物菌落总数5 CFU/mL；大肠杆菌及其它致病菌均未检出，符合GB 7101—2015《食品安全国家标准饮料》中关于微生物的限量要求。
2.7 软枣猕猴桃复合酵素饮料的理化指标
对优化方案制备的软枣猕猴桃复合酵素饮料进行理化检验，得到产品pH 值为2.86；产品总酸含量为3.78 g/L；产品可溶性固形物含量为11.23%。
2.8 发酵前后中酵素饮料体外抗氧化能力的变化
发酵前和按最优发酵方式制备的软枣猕猴桃复合酵素饮料的DPPH 自由基清除率、 羟自由基清除率和ABTS+自由基清除能力如表7 所示。
表7 发酵前后软枣猕猴桃复合酵素饮料对产品不同自由基
清除能力的变化
Table 7 Changes of free radical scavenging ability of Actinidia arguta complex ferment beverage before and after fermentation
组别DPPH 自由基清除率/%ABTS+自由基清除能力/（mmol/L）抗坏血酸（4 mg/mL）94.3072.130.910 0发酵前71.4364.690.412 5发酵后68.1272.150.368 4羟自由基清除率/%
软枣猕猴桃复合酵素饮料在发酵前后DPPH 自由基清除率和ABTS+自由基清除能力均稍有下降，但是羟自由基清除能力有较明显的上升，由发酵前的64.69%上升至72.15%，增幅达11.53%，且高于4 mg/mL 抗坏血酸的羟自由基清除能力，上述数据说明该酵素饮料具有良好的抗氧化效果。
3 结论
本试验以软枣猕猴桃、寒富苹果及百香果为原料研制软枣猕猴桃复合酵素饮料，在单因素试验基础上以总酸含量为响应值，以发酵时间、发酵温度和复合发酵剂接种量为考察因素，通过Box-Behnken 中心组合试验原理进行响应面分析。 结果表明软枣猕猴桃复合发酵饮料的最佳发酵工艺条件为发酵时间62 d、发酵温度30.6 ℃、 乳酸菌-葡萄酒酵母复合发酵剂接种量2.2%，测得产品平均总酸含量为3.78 g/L。 并以感官评分为评价标准进行全因子试验得出产品最佳调配工艺为：白砂糖添加量5%，柠檬酸添加量0.04%，以上工艺条件制备的产品色泽均一稳定，口感清爽，富含果香，平均感官评分为96.54 分，相关微生物指标与理化指标符合相关国家标准。 同时该酵素饮料的DPPH 自由基清除率、 羟自由基清除率和ABTS+自由基清除能力较高。 该试验为日后的酵素饮料研究和复合发酵剂研究提供了理论指导和实践基础。
[1] ZHU R,ZHANG X,WANG Y,et al.Characterization of polysaccharide fractions from fruit of Actinidia arguta and assessment of their antioxidant and antiglycated activities[J]. Carbohydrate Polymers 2019,210:73-84.
[2] LATOCHA P. The nutritional and health benefits of kiwiberry (Actinidia arguta)—A review[J]. Plant Foods for Human Nutrition,2017,72:325-334.
[3] AN X,LEE SG,KANG H,et al.Antioxidant and anti-inflammatory effects of various cultivars of kiwiberry(Actinidia arguta)on lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 Cells[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2016,26:1367-1374.
[4] 张巧,柯博芳,唐小闲,等.不同发酵菌种对大果山楂酵素品质的影响[J].食品工业,2020,41(6):162-166.ZHANG Qiao,KE Bofang,TANG Xiaoxian,et al.Effects of different fermentation strain on quality of Malus domeri(Bois)Chev.[J].Food Industry,2020,41(6):162-166.
[5] 郭伟峰,王红梅,邹晓桐,等.桑葚酵素饮料的发酵工艺研究及其质量评价[J].食品研究与开发,2019,40(5):88-93.GUO Weifeng, WANG Hongmei, ZOU Xiaotong, et al. Research on ferment beverage and its quality evaluation[J].Food Research and Development,2019,40(5):88-93.
[6] 宁楚洁,赵倩,谢春阳,等.玉米须果蔬复合酵素饮料的研制及其抗氧化活性[J].食品研究与开发,2019,40(20):116-122.NING Chujie,ZHAO Qian,XIE Chunyang,et al.Extraction of functional components from corn stigma and preparation of corn stigma,fruit and vegetable complex enzyme beverage[J].Food Research and Development,2019,40(20): 116-122.
[7] 凡军民,谢正林,谢春芹,等.超声波辅助双水相体系提取蝉花多糖及抗氧化研究[J].食品科技,2020,45(5):196-201.FAN Junmin,XIE Zhenglin,XIE Chunqin,et al.Study on Ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of Cordyceps cicadae polyscaccharide[J].Food Science and Technology,2020,45(5):196-201.
[8] 葛瑞宏,储瑞蔼,李井泉,等.桂圆酵素制备及其抗氧化性研究[J].食品科技,2015,40(8):262-267.GE Ruihong, CHU Ruiai, LI Jingquan, et al. Study on preparation and antioxidant activty of longon ferment[J].Food Science and Technology,2015,40(8):262-267.
[9] 李豆.新型水果酵素的研制及生物活性研究[D].沈阳:沈阳农业大学,2018.LI Dou.Study on the development of a new type of fruit enzyme and its biological activity[D].Shenyang:Shenyang Agricultural University,2018.
[10] 胡喜兰,韩照祥,陶莹,等.DPPH·法测定17 种植物的抗氧化活性[J].食品科技,2006(10):264-268.HU Xilan, HAN Zhaoxiang, TAO Ying, et al. Antioxidant activity detection of 17 plant samples by using DPPH·method[J].Food Science and Technology,2006(10):264-268.
[11] 郑燕菲,黄秋萍,罗贤泉,等.单性木兰叶多糖提取及其对DPPH自由基清除能力研究[J].食品科技,2020,45(5):202-206.ZHENG Yanfei, HUANG Qiuping, LUO Xianquan, et al. Study on extraction and DPPH radical scavenging ability of polysaccharide from Magnolia kwangsiensis Figlar＆Noot.leaves[J].Food Science and Technology,2020,45(5):202-206.
[12] HE Y,LIN Y,LI Q,et al.The contribution ratio of various characteristic tea compounds in antioxidant capacity by DPPH assay[J].Journal of Food Biochemistry,2020,44(3):1-11.
[13] 郑显义,郑傲雪.不同原料对米酒的酚类成分及抗氧化活性的影响[J].食品科技,2020,45(5):47-51.ZHENG Xianyi, ZHENG Aoxue. Effects of different raw materials on phenolic components and antioxidant activity of rice wine[J].Food Science and Technology,2020,45(5):47-51.
[14] 王鹏.丹东地区野生软枣猕猴桃中多酚提取工艺[J].辽东学院学报(自然科学版),2013,20(1):8-11.WANG Peng.Extraction process of polyphenols from wild Actinidia arguta in Dandong[J].Journal of Eastern Liaoning University(Natural Science),2013,20(1):8-11.