衰老是一种复杂的自然现象，通常表现为机体的功能衰退、对环境的抵抗力减弱、代谢缓慢、应激反应迟钝等[1-2]。 目前针对衰老机理已有较多报道，包括免疫学说、自由基学说、蛋白质合成差错累积学说、线粒体损伤学说及端粒假说等[3]。 自由基增多和蛋白质羰基化增加是目前公认的导致机体衰老发生发展的主要原因。 衰老不可逆转，但可通过膳食干预抗氧化物质，提高机体抗氧化能力，清除体内过量自由基，减少其对细胞和组织的破坏，延缓衰老进程[4]。
南极磷虾（Euphausia superba）是一种生活在南极海域的小型甲壳类浮游动物，资源蕴藏量巨大，生物量达到6.5 亿吨～10 亿吨， 具有打造我国第二个远洋渔业的巨大潜力[5]。 南极磷虾油是目前南极磷虾陆基加工最重要的高值产品形式，其是从南极磷虾中提取而来的油脂， 富含磷脂、 二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等多不饱和脂肪酸以及虾青素等天然抗氧化物质[6]。 目前关于南极磷虾油在预防和治疗心脑血管疾病、改善脑细胞功能、改善骨质疏松、抑制炎症等方面的功能已有较多报道[6-7]，但针对其体内抗氧化效果，特别是有效剂量方面尚缺少充足数据支持。 综上，本研究通过构建D-半乳糖致衰老小鼠模型，观察不同剂量南极磷虾油干预对衰老小鼠血液中自由基氧化损伤和蛋白质羰基化相关生化指标的影响，探讨南极磷虾油的抗氧化作用，以期为南极磷虾油相关功能食品开发提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 动物、材料与试剂
SPF 级雄性ICR 小鼠，体重25 g～30 g，8～10 周龄，购自斯贝福（北京） 生物技术有限公司， 许可证号：SCXK（京）2019-0010。
南极磷虾油： 辽渔南极磷虾科技发展有限公司；D-半乳糖（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；生理盐水：四川科伦药业股份有限公司；大豆油：嘉里粮油（天津）有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）测定试剂盒、蛋白质羰基含量测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
BAS224S-CW 型电子天平：赛多利斯（北京）科学仪器有限公司；Neofuge 15R 型高速冷冻离心机： 上海力申科学仪器有限公司；HH-4 型数显恒温水浴锅：常州智博瑞仪器制造有限公司；UV1102 Ⅱ型紫外可见分光光度计： 上海天美科学仪器有限公司；CMax Plus型酶标仪：美谷分子仪器（上海）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 实验分组、造模与灌胃
雄性ICR 小鼠50 只，饲养于标准化动物房，环境温度（25±2）℃，相对湿度50%～60%，昼夜交替。 适应性喂养7 d 后，除正常组（10 只）外，其余小鼠（40 只）均采用颈背部皮下注射D-半乳糖（500 mg/kg bw）造模，注射量为0.1 mL/10 g，每日1 次，正常组注射等体积生理盐水，连续造模6 周。 造模6 周后，小鼠经眼眶静脉取血，分离血清测定MDA 含量。 按照MDA 水平将模型小鼠分为模型组、低剂量南极磷虾油组（低剂量组，50 mg/kg bw）、中剂量南极磷虾油组（中剂量组，150 mg/kg bw、高剂量南极磷虾油组（高剂量组，300 mg/kg bw），每组10 只，保证各南极磷虾油剂量组小鼠血清MDA 起始水平与模型组基本一致。 南极磷虾油用大豆油稀释至5、15、30 mg/mL， 按相应剂量灌胃小鼠，灌胃量为0.1 mL/10 g，正常组和模型组小鼠灌胃等体积大豆油，连续灌胃30 d。 给予受试物期间，模型组和各南极磷虾油剂量组小鼠继续颈背部皮下注射D-半乳糖，每隔15 d 记录体重。 实验结束后，小鼠经12 h 禁食不禁水， 称重后采尾尖血20 μL 制备4%溶血液，测定GSH 含量。而后小鼠经眼球取血后处死，血液于室温（25 ℃）静置30 min 后，4 ℃、4 000 r/min 离心15 min，分离血清，测定MDA、SOD、蛋白质羰基含量等指标。
1.3.2 评价指标测定
MDA、GSH、蛋白质羰基含量和SOD 活力的测定按照试剂盒说明书进行。
1.4 数据统计分析
实验结果以平均值±标准差形式表示。 采用SPSS 18.0 软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析进行组间比较，以P<0.05 为具有统计学意义上的显著差异。
2 结果与分析
2.1 南极磷虾油对小鼠体重的影响
不同实验组小鼠体重变化数据见表1。
表1 南极磷虾油对模型小鼠体重的影响（n=10）
Table 1 Effects of Antarctic krill oil on the body weights of model mice（n=10）
?分组初始体重/g 中期体重/g 末期体重/g 体重增长量/g正常组49.80±2.20 51.90±2.01 53.34±1.563.54±1.34模型组49.96±2.46 51.85±2.51 53.20±2.743.24±0.68低剂量组 49.99±2.24 52.35±2.32 54.04±2.204.04±0.47中剂量组 50.26±2.54 52.31±2.29 54.21±2.323.95±0.81高剂量组 49.14±1.57 51.60±1.46 53.44±1.524.30±1.06
由表1 可知，各组小鼠初始体重无显著差异（P＞0.05），经灌胃不同剂量南极磷虾油后，小鼠体重增长量均较小， 推测与小鼠灌胃时已达到14～16 周龄，发育已成熟且生长趋于稳定有关。 各剂量组小鼠体重增长量与模型组比均无显著差异（P＞0.05），提示南极磷虾油对消化道无刺激作用，不影响小鼠正常生长。
2.2 南极磷虾油对小鼠血清MDA 含量的影响
不同实验组小鼠血清MDA 含量测定结果见图1。
图1 南极磷虾油对模型小鼠血清MDA 含量的影响
Fig.1 Effects of Antarctic krill oil on MDA contents in the serum of model mice
MDA 是脂肪氧化的终产物，其含量可直观反映机体内脂质过氧化水平。 由图1 可知，与正常组相比，模型组小鼠血清MDA 含量显著升高（P＜0.05）。灌胃给予不同剂量南极磷虾油30 d 后， 小鼠血清MDA 含量出现不同程度的降低。 与模型组相比，低剂量、中剂量、高剂量南极磷虾油组小鼠血清MDA 含量分别下降了22.98%（P ＞0.05）、43.20%（P ＜0.05）、50.10%（P ＜0.01），表明南极磷虾油可以通过降低小鼠脂质过氧化程度来保护机体免受氧化损伤。
2.3 南极磷虾油对小鼠血清SOD 活力的影响
不同实验组小鼠血清SOD 活力测定结果见图2。
图2 南极磷虾油对模型小鼠血清SOD 活力的影响
Fig.2 Effects of Antarctic krill oil on SOD activities in the serum of model mice
SOD 可清除体内氧自由基，维持机体内活性氧含量的动态平衡。 机体内SOD 活力降低，细胞将会发生脂质过氧化反应，产生MDA，诱导细胞发生氧化应激反应，导致细胞凋亡[8]。 由图2 可知，与正常组相比，模型组小鼠血清SOD 活力极显著下降（P＜0.01）。 与模型组相比，低剂量、中剂量、高剂量南极磷虾油组小鼠血清SOD 活力出现不同程度的提高， 分别增加了11.63%（P ＞0.05）、28.61%（P ＜0.05）、36.00%（P ＜0.01），表明南极磷虾油可以通过提升小鼠机体中SOD 活力来清除体内过多的活性氧自由基，起到保护机体免受氧化损伤的作用。
2.4 南极磷虾油对小鼠全血GSH 含量的影响
不同实验组小鼠全血GSH 含量测定结果见图3。
GSH 是体内重要的非酶性抗氧化剂，其含量高低是衡量机体抗氧化能力大小的重要标志[9]。 由图3 可知，与正常组相比，模型组小鼠全血GSH 含量极显著减少（P＜0.01）。与模型组相比，低剂量、中剂量、高剂量南极磷虾油组小鼠全血GSH 含量出现不同程度的提高， 分别增加了36.13%（P＞0.05）、50.53%（P＜0.05）、60.80%（P＜0.01）， 表明南极磷虾油可以通过提升小鼠机体中GSH 含量，清除机体中的过氧化物，减轻机体氧化损伤的程度。
图3 南极磷虾油对模型小鼠全血GSH 含量的影响
Fig.3 Effects of Antarctic krill oil on GSH contents in the whole blood of model mice
2.5 南极磷虾油对小鼠血清蛋白质羰基含量的影响
不同实验组小鼠血清蛋白质羰基含量测定结果见图4。
图4 南极磷虾油对模型小鼠血清蛋白质羰基含量的影响
Fig.4 Effects of Antarctic krill oil on protein carbonyl contents in the serum of model mice
蛋白质羰基化是蛋白质分子受到自由基攻击后发生的非酶促不可逆变化， 羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有功能。 蛋白质羰基含量是反映机体氧化损伤程度的重要指标[10]。 由图4 可知，与正常组相比，模型组小鼠血清蛋白质羰基含量显著升高（P＜0.05）。 与模型组相比，低剂量、中剂量、 高剂量南极磷虾油组小鼠血清蛋白质羰基含量出现不同程度的降低，分别下降了17.99%（P＞0.05）、28.93%（P＜0.05）、31.55%（P＜0.01），表明南极磷虾油可有效降低机体自由基含量， 减少蛋白质羰基化的发生，减轻蛋白质功能下降。
3 讨论与结论
目前用于抗氧化功能研究的衰老动物模型主要是自然衰老动物和D-半乳糖致衰老动物。已有研究证实，D-半乳糖致衰老动物与自然衰老动物具有较高的一致性，而前者模型具有组间差异小、试验周期短的优点[11]。本研究采用颈背部皮下注射D-半乳糖建立小鼠过氧化损伤模型，造模6 周后，小鼠血清MDA 含量从（7.55±0.85）nmol/mL 增加到（10.05±0.92）nmol/mL。实验末期， 模型组小鼠较正常组血清MDA 和蛋白质羰基含量显著升高（P＜0.05）、血清SOD 活力和全血GSH 含量极显著降低（P＜0.01），提示D-半乳糖供给过量，导致小鼠体内超常产生活性氧，使体内活性氧产生与消除的平衡状态遭到破坏，引起小鼠氧化损伤，加速衰老。 不同剂量南极磷虾油干预后，小鼠血清SOD 活力和全血GSH 含量得到提高、 血清MDA和蛋白质羰基含量出现下降，其中，中剂量（150 mg/kg bw）和高剂量（300 mg/kg bw）干预效果显著，证明南极磷虾油能够有效改善D-半乳糖致衰老动物的氧化损伤。
南极磷虾油中磷脂含量高达40%以上，EPA 和DHA 含量可达到18%以上，虾青素含量为60 mg/kg 以上[6，12]。 EPA、DHA 等n-3 系列多不饱和脂肪酸具有良好的抗氧化作用，值得关注的是，区别于传统鱼油制品，EPA、DHA 在南极磷虾油中更多地以磷脂型式存在[13-14]，生物利用度更高[15-16]，在体内可发挥更优的生理功能。 已有研究证明南极磷虾EPA/DHA 磷脂能够有效改善D-半乳糖致衰老小鼠的氧化损伤并修复皮肤衰老症状[17]。 虾青素是目前已知的抗氧化能力最强的类胡萝卜素[18]，其抗氧化能力高于β-胡萝卜素、叶黄素、辅酶Q10 和维生素E 等物质，可通过淬灭单线态氧、消除自由基等途径发挥抗氧化作用[19-20]。 已有研究证明南极磷虾来源虾青素提取物能够有效改善D-半乳糖致衰老小鼠的氧化损伤，且效果优于合成虾青素[21]。
综上，南极磷虾油由于富含多种天然抗氧化营养成分，能够通过提高机体自由基清除能力、抑制脂质过氧化和蛋白质羰基化， 改善衰老小鼠的抗氧化能力，进而起到延缓衰老的作用。 本研究可为南极磷虾油在相关功能食品领域的应用提供理论支持。
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