多肽类物质自从被发现以来，已被证明具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme，ACE）抑制、抗肿瘤、抗炎、增强免疫等。玉米肽主要来源于玉米籽粒经食品工业生产或酿酒工业提纯后的玉米淀粉或玉米蛋白粉。 据报道，玉米肽具有许多生物活性，如抗肿瘤[1-4]、抗氧化[5-7]、促进酒精代谢[8-9]、抗高血压[10-12]、降低血糖[13]、抗疲劳[14]、保肝护肝[15-16]等，特别是玉米肽的保肝护肝作用，如玉米肽可以减轻Con A 诱导的肝损伤[17]、对脂多糖和卡介苗诱导的小鼠肝损伤有保护作用[18]、玉米寡肽可以预防由四氯化碳引起的早期肝损伤[19]等。
在研究中发现，玉米蛋白的酶解产物肽具有很好的抗人肝癌细胞HepG2 生长的活性，但其结构和组成及作用机制尚不清楚。 本研究对玉米蛋白水解物进行分离和纯化， 筛选出具有抗肿瘤细胞HepG2 的活性肽，研究其结构特点，并初步研究了其对HepG2 细胞抑制作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玉米肽原料： 武汉新生肽生物科技有限公司；噻唑蓝[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美国Sigma 公司；双抗（青霉素-链霉素）、高糖DMEM 完全培养液、1640 完全培养液：美国Gibco 生物科技公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）： 美国Hyclone 生物科技公司；5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）：上海生工生物工程有限公司；其它所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
ThermoFisher Multiskan GO 全波长酶标仪、 尼康Nikon ECLIPSE Ti-S 荧光倒置显微镜、150i 型CO2细胞培养箱：美国Thermo 公司；BS-100A 型自动部份收集器：上海沪西分析仪器厂有限公司；YZ1515x 型恒流泵： 兰格恒流泵有限公司；DELTA-320pH 计： 法国METTLER－TOLEDO 公司；HR60-ⅡA2 型生物安全柜： 青岛海尔股份有限公司；AF100 电子制冰机：SANYO 制冰系统有限公司；JA2003 型电子分析天平：上海精科天平厂；RE-3000 旋转蒸发仪： 上海亚荣生化仪器厂。
1.3 方法
1.3.1 分离纯化
将玉米肽溶解在0.05 mol/L 的Tris-HCl 缓冲溶液中，加到DEAE-FF 柱（1.5 cm×10 cm）上，并以4 mL/min的流速加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L 的NaCl-Tris-HCl 溶液，用作洗脱液，每40 min 一个梯度。 洗脱液由自动收集器以2 min 的间隔自动收集。 并通过酶标仪检测每管吸光度。 根据峰图收集玉米肽组分，浓缩并冷冻干燥。
用Sephadex G-15 柱（1.0 cm×70 cm）进一步纯化得到的玉米肽组分，将玉米肽溶解在蒸馏水中，并用蒸馏水以1 mL/min 的流速洗脱该柱。 洗脱液为蒸馏水，收集与上述相同。 收集纯化的玉米肽组分，浓缩并冷冻干燥。
1.3.2 结构鉴定
使用高效液相色谱串联质谱电喷雾法（liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）进行结构鉴定。使用de novo 数据分析软件对质谱原始数据进行解析。
1.3.3 多肽合成
委托江苏强耀公司，采用固态合成的方法进行多肽合成。
1.3.4 细胞培养
人肝癌细胞株HepG2 培养在含10% 胎牛血清（FBS）和1%双抗溶液（青霉素-链霉素混合溶液）的DMEM 培养基中， 人正常肝细胞株L-02 培养在血清含量和抗生素含量与上述条件相同的1640 培养基中，置于培养箱中常规培养，根据细胞状态传代[20-21]。
1.3.5 细胞活力测定
用MTT 法分析玉米肽对HepG2 癌细胞的杀伤作用[22]。胰酶消化对数生长期的细胞，加入完全培养液制成单细胞悬液，按照血细胞计数法调整细胞密度为5×104 个/mL。将细胞接种到96 孔板中，常规培养24 h，每孔加入200 μL 含有不同浓度待测样品和阳性对照（5-FU 的细胞培养液）， 空白组只加入200 μL 基础培养液，每组6 个平行。培养24 h，吸去废弃培养液，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL 和180 μL 基础培养液，继续培养4 h 后，吸出旧培养液，加入磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS） 冲洗， 每孔加入150 μL DMSO，置于酶标仪中孵育10 min，测试其在570 nm 处的吸光度值，按照下式计算抑制率。
式中：A对照和A 空白分别表示阳性对照组和空白组在570 nm 处的吸光度值。
1.4 数据分析
本研究中获得的所有数据将使用统计程序Excel进行分析，SPSS 结果以平均±标准误表示。 不同处理之间的差异性显著通过方差分析（analysis of variance，ANOVA），用Fisher 最小显著性差异方法进行显著性比较，显著性水平为p<0.05 或p<0.01。
2 结果与分析
2.1 玉米肽的分离纯化
2.1.1 离子交换层析分离玉米肽
实验室前期采用MTT 比色法检测样品对不同癌细胞的抑制率， 对19 种生物活性肽或蛋白进行了初筛，发现玉米低聚肽对肝癌细胞的抑制率较高，且对人正常肝细胞的毒性较小。 本研究在前期工作基础上，对玉米肽进行分离和纯化。
玉米肽经DEAE-FF 离子交换层析分离后得到两个组分，如图1 所示，命名为D-1 和D-2。收集D-1 和D-2 组分，冷冻干燥后置于-20 ℃低温冰箱保存备用。
图1 玉米肽经DEAE-FF 阴离子交换柱洗脱曲线
Fig.1 Chromatomap of corn peptide separated by DEAE-FF
2.1.2 分子筛层析方法分离玉米肽
玉米肽经DEAE-FF 阴离子交换柱分离出来的两个组分D-1 和D-2， 使用Sephadex G-15 分子筛层析进一步分离。经Sephadex G-15 分子筛层析，以D-1 为分离样品，检测波长为214 nm，分离出两个组分，命名为D-1-1 和D-1-2。经Sephadex G-15 分子筛层析，以D-2 为分离样品，检测波长为214 nm，分离出两个组分，命名为D-2-1 和D-2-2。 收集D-1-1、D-1-2、D-2-1 和D-2-2 组分， 冷冻干燥后置于-20 ℃低温冰箱保存备用。
具体分离曲线见图2 和图3。
图2 D-1 经Sephadex G-15 分离曲线
Fig.2 Chromatomap of D-1 separated by Sephadex G-15
图3 D-2 经Sephadex G-15 分离曲线
Fig.3 Chromatomap of D-2 separated by Sephadex G-15
Sephadex G-15 分子筛层析的分离范围在分子量1 500 Da 以下，所以D-1-1、D-1-2、D-2-1 和D-2-2 4 个组分内的肽理论上应该是分子量比较小的玉米肽。
2.2 不同组分对HepG2 的抑制作用
采用MTT 法检测溶于不含胎牛血清的基础培养液、 浓度为1 000 μg/mL 的D-1、D-2、D-1-1、D-1-2、D-2-1 和D-2-2 6 个玉米肽组分对人肝癌细胞HepG2 的抑制作用以及对人正常肝细胞L-02 的毒性作用，结果如图4 所示。
图4 对人肝癌细胞HepG2 和人正常肝细胞L-02 生长的抑制率
Fig.4 Inhibition rate of growth of human liver cancer cell HepG2 and human normal liver cell L-02
由图4 可知，作用时间为24 h 时，浓度为1000μg/mL的D-1、D-2、D-1-1、D-1-2、D-2-1 和D-2-2 6 种玉米肽不同组分对人肝癌细胞HepG2 细胞均有抑制作用，其中D-2-2 对人肝癌细胞HepG2 抑制率最高，接近阳性对照抑癌药物5-FU。 而且D-2-2 对人正常肝细胞的毒性作用低于5-FU。 所以选择D-2-2 进行结构鉴定与抑制HepG2 活性的研究。
2.3 抑制HepG2 活性肽的结构分析
玉米活性肽的结构分析结果见表1。
表1 玉米活性肽的结构分析
Table 1 Potentially active peptides
多肽序列 多肽匹配度 氨基酸长度/个 相对丰度 分子量/Da LPPYLP9263.97×108698.400 3 LPFYPQ9261.91×108763.390 4 LPPYLSP9171.82×108785.432 3 LAPPYY9869.02×107722.363 9 LPPYY9856.24×107651.326 8
图5 和图6 分别为液相分离D-2-2 组分的总离子流图和LPPYLP 的二级质谱图。
图5 D-2-2 组分总离子流图
Fig.5 D-2-2 components total ion chromatography diagram
图6 LPPYLP 的二级质谱图
Fig.6 Tandem mass spectrum of LPPYLP
D-2-2 组分分析中， 相对丰度排名前5 的肽段有LPPYLP、LPFYPQ、LPPYLSP、LAPPYY、LPPYY，可以分析出这5 条肽段都含有脯氨酸、 亮氨酸和酪氨酸，且“LP”这个片段出现频率较高。氨基酸结构为“LPPYLP”的玉米肽多肽匹配度及相对丰度均较高，组成该肽的氨基酸均为疏水性氨基酸且其氨基酸序列中脯氨酸占比为50%，亮氨酸占比为33%。 最终筛选出氨基酸结构为“LPPYLP”的玉米肽，命名为CPs-6，研究其对人肝癌细胞HepG2 的抗肿瘤活性。
2.4 玉米六肽CPs-6 的抑制HepG2 活性验证
通过固相合成法按照之前筛选出CPs-6 的氨基酸结构LPPYLP 进行了合成， 得到了纯度≥95%的合成肽CPs-6，采用MTT 法检测活性，结果如图7 所示。
图7 CPs-6、CP、D-2-2 组分对人肝癌细胞HepG2、Hep3B 和人正常肝细胞L-02 的抑制率
Fig.7 Inhibition rate of CPs-6，CP，D-2-2 components on human liver cancer cells HepG2，Hep3B and human normal liver cells L-02
作用浓度为1 000 μg/mL，作用时间为24 h 时，玉米六肽CPs-6 相比分离前的玉米肽，对HepG2 细胞的抑制率由30%提高到50%，提高了20%。 对Hep3B 细胞的抑制率由10%提高到42%， 抗肿瘤活性提高了32%。 玉米六肽CPs-6 相比较D-2-2 组分对L-02 的毒性由36%降低到17%，损伤减少了19%。
3 结论
采用离子交换和葡聚糖凝胶层析方法分离、纯化玉米肽的混合物，鉴定出其中具有抑制HepG2 细胞生长活性的玉米活性短肽，其一级结构为LPPYLP（CPs-6）；以5-Fu 为对照，玉米六肽CPs-6 在1 000 μg/mL，作用24 h， 对HepG2 细胞的抑制率达到50%；对Hep3B 细胞的抑制率为42%，且对人正常肝细胞的毒性作用依然维持在一个比较低的水平。 本研究结果为玉米肽的护肝保肝作用提供了理论依据，为肝癌的治疗药物和预防肝病的功能性食品的开发提供了理论基础。
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