苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation，MLF）是葡萄酒酿造过程中一个重要的生物学过程，被认为是酿造优质红葡萄酒和部分白葡萄酒必不可少的环节[1-2]。MLF可以提高葡萄酒的微生物学稳定性、降低酸度和苦涩感、丰富酒体结构，使其更加饱满馥郁[3-4]。酒酒球菌（Oenococcus oeni）作为这一过程的主要承担者，对葡萄酒酿造过程具有重要意义，尤其是葡萄原料酸度较高的地区[5-6]。
我国葡萄种质资源丰富多样，包括毛葡萄（Vitis quinquangularis Rehd.）、山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）及刺葡萄（Vitis davidii var.davidii）等[7]。 它们具有极强的抗逆性，果实中的花色苷、白藜芦醇等物质含量也很高，是我国特有的潜在优质葡萄酿酒原料。杂交品种公酿一号是用玫瑰香葡萄与山葡萄杂交育成的优良酿酒葡萄品种，该品种具有抗性强、适宜栽培地区广、丰产性能好、易管理等优点[8]。用其酿制的红葡萄酒酒质优良，富含有机酸、维生素等多种益生成分[9]。
虽然具有上述优点，但由于其果实含酸量很高，其中公酿一号苹果酸含量占总有机酸的37.67%，而市场上又没有降酸能力强的优良MLF商业菌株，因此这些品种至今没有得到很好的利用，致使我国目前的葡萄酒主要是用国外引进的欧亚种（Vitis vinifera L.）酿造的，同质化严重，缺乏特色与市场竞争力。
本项目拟从山东地区种植面积较广的山葡萄品种公酿一号中分离苹果酸-乳酸发酵菌株，并对其进行胁迫耐受性及发酵性能分析，从而获得优良苹果酸-乳酸菌株，为后期进行胁迫应答机制及葡萄酒优良生产菌株的国产化、差异化奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 酒样
公酿一号干红葡萄酒：山东密水酒业有限公司。葡萄酒样品的理化指标参照王华[10]的方法进行测量。测得各指标值为：酒精度13.68%、残糖3.6 g/L、总酸10 g/L、挥发酸 0.32 g/L、总硫 66 mg/L、游离硫 13 mg/L、干浸出物31.8 g/L。
1.1.2 培养基
酸性番茄培养基（acidic tomato broth，ATB）（1 L）：葡萄糖10 g、蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO·44H2O 0.05 g、盐酸半胱氨酸0.5 g、番茄汁250 mL，pH4.8。配制固体培养基时添加1.2%（质量分数）的琼脂粉，筛选培养基需在倒平板前加入终浓度50 mg/L的放线菌酮[11]。
模拟酒培养基（1 L）：无水乙醇100 mL（酒精浓度10%）、葡萄汁 10 g、L-苹果酸 3 g、D-葡萄糖 2 g、D-果糖 2g、CaCl20.13g、KCl0.45g、（NH4）2SO41g、（CH3COO）Na 2 g、KH2PO40.6 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO40.05 g、酵母浸粉4 g，pH3.8。灭菌后添加100 mL无水乙醇[12]。
1.1.3 仪器设备
JA2003C电子天平：上海佑科仪器仪表有限公司；T6紫外可见分光光度计：北京普析分析仪器公司；SWCJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；Auegra X-30R高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；FE20K台式酸度计：梅特勒-托利多集团；T100 PCR仪：美国Bio-Rad公司；Aglient1220高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；GenoSens1860凝胶成像仪：上海勤翔科学仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 苹果酸-乳酸发酵菌株的筛选
取酒精发酵结束的公酿一号干红葡萄酒0.1 mL，在优选的分离培养基（ATB）上，采用平板涂布法分离酒酒球菌，培养温度为28℃，培养时间为5 d～7 d。
根据菌落形态挑取单菌落进行纯化操作[13]。
1.2.2 酸胁迫耐受性初筛
将纯化获得的菌株接种至ATB种子培养基中，活化3 d～5 d，活化完成后以1%的接种比例接种至酸胁迫耐受性筛选培养基中（ATB，pH 3.2），28℃静置培养7 d，以蒸馏水为对照，测量600 nm处吸光度值，并记录[14]。
1.2.3 复筛
不同菌株对pH值和酒精的抗性存在着很大差异。通过研究初筛菌株对酒精、pH值的耐受性，从中选择了吸光度较大的菌株进行酸胁迫耐受性（pH值为2.8、3.0、3.2）、乙醇胁迫耐受性（乙醇浓度为10%、12%、14%）复筛。
1.2.4 菌株鉴定
收集对数生长期的菌液1 mL，提取基因组DNA，以基因组总DNA为模板，16S rRNA基因通用引物，进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，扩增产物送Life Technologies公司进行测序。测序获得序列提交至NCBI进行Blast比对（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），并使用MEGA 5进行系统发育树的构建[15]。
1.2.5 发酵性能分析
1.2.5.1 β-葡萄糖苷酶样品制备及活性测定
取对数生长中期（OD600=1.0）菌液各1 mL，于9 000 r/min离心10 min收集菌体，加入0.85%NaCl溶液洗涤2次，并悬浮于0.5 mL 0.85%NaCl溶液。
β-葡萄糖苷酶活力测定方法参照Barbagallo等的方法[16-17]。
β-葡萄糖苷酶活力定义为以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷（4'-nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside，p-NPG）为底物，每克菌体（干质量）每分钟水解该底物生成对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）的量，单位为μmol/（g·min）。
标准曲线由浓度为10 μmol/L～60 μmol/L的p-NP溶液在400 nm下比色获得。
1.2.5.2 模拟酒环境下菌株的苹果酸-乳酸发酵能力
配制模拟酒培养基，并使模拟酒培养基的酒精浓度为10%，pH3.8，以4%接种量接种于模拟酒中，分别在0、2、4、6、8 d取样采用高效液相色谱法测定苹果酸和乳酸含量[18-19]。参数为色谱柱：安捷伦ZORBAX SBAq色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相：1% 甲醇，99% 磷酸盐缓冲液（pH2.8），流速 1mL/min，柱温 35℃，检测波长210 nm，进样量20μL，各样品分析时间均为10 min，并重复2次。
1.2.5.3 模拟酒环境下菌株存活率
分别在 0、2、4、6、8 d 吸取待测菌株的模拟酒培养基进行梯度稀释，取不同梯度的稀释液各5 μL点在ATB平板的指定位置处，每个菌株做4个重复，28℃正置培养，待液滴消失后倒置培养，约5 d，拍照观察结果[20]。
1.3 DNA测序数据
菌株16SrRNA基因序列提交NCBI。编号：GM1038为MT368004，GM1041为MT368005，GM1039为MT368006，GM1023为 MT368007，GM1048为 MT368008。
2 结果与分析
2.1 初筛结果
分离菌株在酸胁迫培养基中的生长情况见表1。
表1 分离菌株在酸胁迫培养基中的生长情况
Table 1 The growth of isolated strains in acid stress medium
菌株 OD600 nm 菌株 OD600 nm 菌株 OD600 nm GM1001 0.740 GM1022 0.871 GM1043 0.397 GM1002 0.514 GM1023 1.792 GM1044 0.576 GM1003 0.571 GM1024 1.175 GM1045 0.468 GM1004 0.458 GM1025 1.499 GM1046 1.217 GM1005 1.435 GM1026 0.760 GM1047 1.017 GM1006 0.818 GM1027 1.226 GM1048 1.813 GM1007 0.294 GM1028 1.378 GM1049 0.490 GM1008 1.236 GM1029 1.450 GM1050 0.635 GM1009 1.395 GM1030 0.528 GM1051 0.937 GM1010 1.371 GM1031 0.758 GM1052 0.945 GM1011 1.044 GM1032 1.140 GM1053 1.088 GM1012 0.567 GM1033 0.880 GM1054 1.076 GM1013 0.263 GM1034 0.501 GM1055 1.464 GM1014 0.488 GM1035 1.203 GM1056 1.192 GM1015 0.391 GM1036 0.949 GM1057 1.477 GM1016 0.322 GM1037 1.472 GM1058 0.724 GM1017 0.490 GM1038 1.600 GM1059 1.370 GM1018 0.539 GM1039 1.724 GM1060 0.940 GM1019 0.565 GM1040 0.879 GM1061 1.123 GM1020 0.727 GM1041 1.993 GM1062 1.427 GM1021 0.607 GM1042 0.678 GM1063 0.750
如表1所示，共从酒样中分离出63株酸胁迫耐受性各异的 菌株。 其中，GM1023、GM1038、GM1039、GM1041和GM1048在初筛中表现出较好的生长性能，被选定进行复筛。
2.2 复筛结果
对初筛获得的5个菌株进行单因素胁迫耐受分析。生长情况如图1所示。
图1 待测菌株在不同胁迫条件下的生长情况
Fig.1 The growth of the tested strains under different stress conditions
不同小写字母表示与对照菌株SD-2a相比存在显著性差异，p<0.05。
在pH值为2.8、3.0和3.2条件下，菌株GM1023、GM1038、GM1039、GM1041 和 GM1048 具有较高的酸性胁迫耐受性，累计生物量较大的是GM1039和GM1041，与对照菌株SD-2a存在显著差异。
复筛菌株及对照菌株的生长情况随乙醇浓度的变化而变化，且不同菌株的生长情况也不相同。在10%乙醇浓度下，GM1041的生物量最大，是对照菌株的1.5倍，其它菌株与对照菌株之间无显著差异。在12%乙醇浓度的条件下，各菌株的生长性能均显著优于对照菌株，其中GM1041的生长性能最好。在14%乙醇浓度条件下，GM1038、GM1041和GM1048的生长性能显著优于对照菌株，其中GM1041和GM1048较好，GM1023和GM1039与对照菌株无显著差异。
2.3 菌种鉴定
为了对菌株进行鉴定，进行了16S rRNA基因扩增、测序、基因比对和系统发育分析（见图2）。
图2 待测菌株基于16S rRNA的系统发育树
Fig.2 The phylogenetic tress of the tested strains based on 16S rRNA
16S rRNA基因序列提交NCBI进行Blast分析，所有菌株与Oenococcus oeni均具有较高的同源性。系统发育分析表明，所有菌株与酒酒球菌属于同一分支。因此，5株均鉴定为Oenococcus oeni。
2.4 β-葡萄糖苷酶活性
待测菌株的β-葡萄糖苷酶活性见图3。
在生长过程中，Oenococcus oeni代谢并产生糖苷酶，特别是β-葡萄糖苷酶，可以促进葡萄酒中香气物质的释放，丰富香气的浓度和复杂性[17，21]。β-葡萄糖苷酶有利于提高葡萄酒的感官质量。因此，β-葡萄糖苷酶活性和MLF能力是筛选优良菌株的重要指标[22]。如图3所示，菌株GM1039的β-葡萄糖苷酶活性是对照菌株的1.6倍，菌株GM1041的β-葡萄糖苷酶活性与对照菌株无显著差异，其它菌株的β-葡萄糖苷酶活性均低于对照菌株。
图3 待测菌株的β-葡萄糖苷酶活性
Fig.3 The β-glucosidase activity of the tested strains
不同小写字母表示与对照菌株SD-2a相比存在显著性差异，p<0.05。
2.5 降酸能力
除了β-葡萄糖苷酶的活性外，MLF对葡萄酒质量影响最大的方面就是将苹果酸转化为乳酸的能力，从而降低葡萄酒中的总酸[23-24]。因此，本研究测定了菌株在模拟酒中的苹果酸-乳酸发酵能力，结果见图4。
图4 待测菌株在模拟酒中降解苹果酸与生成乳酸能力
Fig.4 The ability of the tested strains to degrade malic acid and produce lactic acid in simulate wine
如图4所示，随着培养时间的延长，模拟酒中的苹果酸浓度逐渐降低。由第8天苹果酸浓度数据可知，菌株GM1039和GM1041的苹果酸消耗能力显著优于对照菌株。其中，GM1041降酸能力最强，第8天可以降低到0.63 g/L。模拟酒中乳酸浓度的变化规律与苹果酸相反，随着培养时间的延长，苹果酸逐渐转化为乳酸。培养至第8天时，除GM1048外，其它菌株产生的乳酸浓度都显著高于对照菌株。
2.6 存活率
在MLF中Oenococcus oeni的另一个关键指标是存活率，MLF需要足够的活细胞来维持其运行[25-26]。菌株的存活率如图5所示。
图5 待测菌株在模拟酒中活菌数变化
Fig.5 The changes in the number of viable bacteria of the tested strains in simulated wine
0 d 为对照菌株 SD-2a，试验时菌株起始 OD 值一致；10-1、10-2、10-3、10-4、10-5为稀释度。
如图5所示，每天取各菌株5个梯度的稀释液点平板，由生长出菌苔的最高稀释倍数可判断不同培养时间菌体浓度变化情况。所有菌株在接种后存活率都呈下降趋势。其中菌株GM1039、GM1041和GM1048与对照菌株存活率相近，活菌数在第2天后趋于稳定，保持在10-4稀释度水平。
3 结论
本研究分离获得63株细菌，其中5株为耐酸、耐乙醇菌株。通过16S rRNA基因序列分析鉴定为Oenococcus oeni。在发酵性能分析中，菌株GM1039和GM1041在模拟葡萄酒中的降酸能力显著优于对照菌株，在发酵过程中保持了较高的活细胞数。这些结果表明，它们将是很好的候选发酵菌株。这些分离菌株将做进一步发酵性能研究，以期用于工业生产。
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