柚子是芸香科乔木，具有清肠、助消化、利便、润肺、健脾胃、补血的功效，也可促进伤口愈合，对败血症有良好的疗效[1]。柚子在世界各地均有种植，我国柚子总产量可达300万吨，柚子皮约占柚子总量的40%[2]，经食用后柚子皮因得不到充分利用造成了严重的资源浪费。据研究报道柚子皮中活性物质如多糖、膳食纤维、果胶、黄酮、香精油类等均具有多种生理活性[3]，但柚子皮的深加工还待进一步扩大。
柚子皮多糖是柚子皮主要成分之一，具有抗炎症、抗氧化、增强机体免疫力、预防肿瘤、抗病毒、调节机体血糖血脂等功效[4-5]。目前对柚子皮多糖的研究仅在提取方面，多糖提取方法主要有溶剂提取、酶法、超声波辅助提取、化学法等[6-8]。其中超声辅助提取法具有节时、节能且绿色安全等优点，酶法具有安全性高、产品质量及纯度较高、反应条件温和但成本高等特点。王莹等[9]以柚皮为原料，利用纤维素酶与果胶酶辅助提取柚子皮多糖，结果表明在提取时间80 min、酶用量2.0%、提取温度60℃、pH值为4.0的最佳工艺条件下柚子皮中多糖得率为8.26%，江飞凤等[8]采用超声-微波协同提取柚子皮多糖，在液料比39∶1（mL/g），微波功率400 W，提取液pH 9.0，提取时间34 min的条件下制备得到的多糖得率为10.41%，张荔菲等[2]采用超声辅助酶法，在加酶量1.73%、酶解时间1.19 h和超声时间29.17 min的单因素试验基础上采用响应面优化试验制备得到的柚子皮多糖的平均提取率为82.4%，得率为27.3%。但关于柚子皮多糖模拟体外消化的研究鲜有报道。
模拟体外消化模型是通过模拟胃肠消化后食物的消化特性，已经成为体外模拟人体消化吸收的有效途径和最新趋势[10-11]。目前，有关柚子皮多糖在体外消化模型中的抗氧化活性评价鲜有报道，因此本研究采用超声波辅助提取技术，通过对超声温度、超声时间、复合酶添加量以及酶解时间为单因素，采用正交试验对结果进行优化分析，将最佳条件下制备得到的柚子多糖进行体外模拟唾液、胃液以及小肠液消化试验，全面地评价柚子皮多糖在消化过程中的抗氧化活性变化情况，以期为柚子皮多糖的营养健康产品的研发和工业化生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
沙田柚：市售，将其切成小块进行冻干，之后用粉碎机粉碎，过80目筛，取筛下物密封备用。胃蛋白酶（猪源，3 000 U/mg）、胰酶（猪胰腺，4 000 U/mg）、纤维素酶（400 U/mg）、果胶酶（500 U/mg）：阿拉丁试剂有限公司；邻菲罗啉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）：上海源叶生物科技有限公司；磷酸二氢钾、硫酸亚铁、邻苯三酚、无水乙醇、盐酸、H2O2、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠：西陇化工股份有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
XA-1高速粉碎机：上海烨昌食品机械有限公司；EL204电子天平：梅特勒托利多仪器有限公司；HH-2恒温水浴锅：国华（常州）仪器制造有限公司；RE52CS旋转蒸发仪：上海耀特仪器设备有限公司；TGL-16GB高速离心机：上海安亭高速台式离心机。
1.3 方法
柚子皮预处理（冻干后粉碎过80目，取筛下物）→超声处理→离心（6 500 r/min离心8min）→浓缩→醇沉（4倍体积的无水乙醇进行醇沉过夜）→取醇沉物冻干后称重即为柚子皮多糖质量。
1.4 柚子皮多糖得率测定
式中：m1为柚子皮多糖的干重，g；m为柚子皮干重，g。
1.5 基本营养成分分析
蛋白质测定：GB/T 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；脂肪测定：GB/T5009.9—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》；灰分测定：GB/T 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》；水分测定：GB/T 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》；膳食纤维测定：GB/T 5009.88—2014《食品安全国家标准食品中膳食纤维的测定》。
1.6 超声辅助酶法提取柚子皮多糖单因素试验
准确称取2 g柚子皮粉，分别设置超声温度（20、30、40、50、60℃）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、复合酶添加量（纤维素酶∶果胶酶质量比为1∶1）（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、酶解时间（20、30、40、50、60 min），考察超声温度、超声时间、复合酶添加量、酶解时间对柚子皮多糖得率的影响。
1.7 正交试验设计
在单因素的基础上，设计四因素三水平的正交试验优化提取工艺，试验自变量与水平见表1。
表1 试验自变量与水平
Table 1 Codes and levels factors chosen for experiment
水平因素A超声温度/℃B超声时间/min C复合酶添加量/%D酶解时间/min 1 30 30 1.0 40 2 40 40 1.5 50 3 50 50 2.0 60
1.8 体外模拟胃肠液抗氧化活性研究
1.8.1 体外模拟消化液的收集与配制
1.8.1.1 唾液收集
漱口后，将初始唾液舍弃后开始进行收集，收集周期为30 s，直至收集够试验需求量，将收集到的唾液于6 000 r/min转速下离心处理20 min，取上清液于-20℃保存。
1.8.1.2 模拟胃液的配制
准确称取10 g胃蛋白酶，加少量蒸馏水将其溶解后加入16.4 mL盐酸并定容至1 000 mL，1 mol/L磷酸缓冲液调pH值至1.3后放置在4℃冰箱中保存。
1.8.1.3 模拟肠液的配制
准确称取6.8 g磷酸二氢钾加少量蒸馏水将其溶解后用4%NaOH溶液并定容至1 000 mL，1 mol/L磷酸缓冲液调pH值至7.0；另准确称取10 g胰酶用100 mL蒸馏水将其充分溶解；两液混合后加蒸馏水定容至1 000 mL后放置在4℃冰箱中保存备用。
1.8.2 体外模拟消化系统方法
1.8.2.1 模拟口腔的消化
准确吸取2 mL唾液和2 mL待测液（4.0 mg/mL）于6支试管中，封口混匀，于37℃恒温水浴锅中进行消化试验，分别取消化 5、10、15、 20、30、60 min 后的消化液于沸水浴中灭酶10 min，冷却至室温（25℃）后于4 000 r/min离心10 min，取上清液于-20℃保存备用[12]。
1.8.2.2 模拟胃液的消化
样品溶液经唾液消化15 min后分别加入预热模拟胃液 4 mL，用1 mol/L NaHCO3调pH值至7.0，封口混匀，于37℃恒温水浴锅中进行消化试验，分别消化5、10、15、60、120、240 min 后于沸水浴中灭酶 10 min，冷却至室温（25℃）于4000r/min离心10min，取上清液于-20℃保存备用[12]。
1.8.2.3 模拟肠液的消化
将模拟胃液消化后消化液调pH值至5.5后加入预热的模拟肠液（反应液与肠液体积比为10∶3），封口混匀于37℃恒温水浴锅中进行消化试验，分别消化5、20、60、120、240、480 min 后于沸水浴中灭酶 10 min，冷却至室温（25℃）于4 000 r/min离心10 min，取上清液于-20℃保存备用[12]。
1.8.3 体外模拟消化液的抗氧化活性研究
1.8.3.1 DPPH·清除率测定
准确吸取 1mL 不同质量浓度的（0、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2 mg/mL）待测液、加入 3 mL DPPH-无水乙醇溶液（0.2 mmol/L），混匀后于暗处反应30 min，反应结束后于517 nm处测吸光度值[13]。
DPPH·清除率见公式（2）。
式中：A1为样品的吸光值；A为空白对照（蒸馏水）吸光值。
1.8.3.2 ·OH清除率测定
准确吸取1 mL待测液，依次加入H2O2（0.5 mL，20 mmol/L）、邻菲罗啉（1.0 mL，2.5 mmol/L）、硫酸亚铁（1.0 mL，2.5 mmol/L），调 pH 值为 7.0，室温（25℃）静置1h后于536nm处测吸光值[14]。·OH清除率公式如下。
式中：A2为样品组吸光度值；A1为对照组吸光度值；A0为空白组（蒸馏水）的吸光度值。
1.8.3.3 O2-·清除率测定
准确吸取4.5 mL Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH 8.2）于试管中，置于25℃水浴中保持20 min，加0.4 mL待测液和0.08 mL邻苯三酚（25 mmol/L，用10 mmol/L HCl配制），封口混匀后于325 nm波长处测定吸光值，之后每隔0.5 min记录1次，共记录4 min。10 mmol/L HCl代替邻苯三酚溶液，蒸馏水代替样液作为自氧化管[15]。 O2-·清除率见公式（4）、（5）。
式中：D1为样品4 min记录的吸光度值；D2为样品0 min记录的吸光度值；T=4 min；V1为自氧化管氧化速率，ΔA/min；V2为样品管氧化速率，ΔA/min。
1.9 统计学分析
所有试验均重复3次，用SPSS11.5统计软件进行方差分析，结果用平均值（
±s）表示，采用 Origin Pro 9.0对试验数据进行处理。
2 结果与分析
2.1 超声辅助酶法提取柚子皮多糖单因素试验
2.1.1 超声温度对柚子皮多糖得率的影响
超声温度对柚子皮多糖得率的影响见图1。
图1 超声温度对柚子皮多糖得率的影响
Fig.1 The effect of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharides in grapefruit peel
柚子皮多糖得率随着超声温度的升高而逐渐增加，当超声温度为40℃时柚子皮多糖得率最高可达（24.44±0.53）%，这是因为适当的超声温度增大了超声波的空化效应，有利于多糖的溶出；继续升高超声温度多糖得率略有下降，这可能由于过高的超声温度会破坏柚子皮多糖的分子结构，多糖发生轻度水解，同时增加了溶液的黏稠度，不利于多糖的溶出，从而导致多糖得率下降[16-17]。因此，超声温度宜选择为40℃。
2.1.2 超声时间对柚子皮多糖得率的影响
超声时间对柚子皮多糖得率的影响见图2。
图2 超声时间对柚子皮多糖得率的影响
Fig.2 The effect of ultrasound time on the yield of grapefruit peel polysaccharides
当超声时间在20 min～40 min时柚子皮多糖得率逐渐增加，且在超声时间为40 min时多糖得率最高为（25.43±0.59）%，继续延长超声时间柚子皮多糖得率无明显变化且有略微下降，这可能是由于在超声时间为40min时，使柚子皮中的多糖溶出最多，随着超声时间的延长导致柚子皮多糖得率逐渐降低，可能是因为柚子皮多糖已以最高含量溶出，继续延长超声时间至60 min，柚子皮多糖细胞结构破坏，多糖发生降解，且溶剂中的其他物质溶出过多使得多糖的溶出空间下降[18]。因此，从节能角度超声时间宜选择为40 min。
2.1.3 复合酶添加量对柚子皮多糖得率的影响
复合酶添加量对柚子皮多糖得率的影响见图3。
图3 复合酶添加量对柚子皮多糖得率的影响
Fig.3 The effect of compound enzyme addition amount on the yield of grapefruit peel polysaccharide
当复合酶添加量为0.5%～1.5%时柚子皮多糖得率逐渐增加，复合酶添加量为1.5%时柚子皮多糖得率达到最高为（24.87±0.36）%，这可能是因为纤维素酶和果胶酶可使柚子皮中纤维素和果胶得细胞结构破坏，从而使柚子皮中的可溶性多糖溶出[2]；继续增加酶比例，柚子皮多糖得率开始下降。这可能是因为柚子皮多糖发生水解，生成了小分子的多糖、低聚糖或单糖，乙醇无法醇沉下来，从而使得可溶性膳食纤维得率下降[15]。因此复合酶添加量宜选择为1.5%。
2.1.4 酶解时间对柚子皮多糖得率的影响
酶解时间对柚子皮多糖得率的影响见图4。
图4 酶解时间对柚子皮多糖得率的影响
Fig.4 The effect of enzymolysis time on the yield of grapefruit peel polysaccharides
随着酶解时间的增加，柚子皮多糖的得率呈先上升后下降趋势，当酶解时间达到50 min时柚子皮多糖得率最高可达（25.77±0.89）%。这可能是因为酶的作用导致多糖分子链变短，使得更多的可溶性柚子皮多糖溶出，继续延长酶解时间，柚子皮多糖的得率降低是因为酶解时间过高会使得多糖分子结构被破坏，多糖发生降解，且柚子皮多糖具有溶胀性，溶剂增加导致胶质增大，同时增加溶剂黏度导致得率下降[19]。因此酶解时间宜选择为50 min。
2.2 正交试验优化柚子皮多糖提取工艺
采用L9（34）正交表对柚子皮多糖得率进行优化，其因素水平和分析结果与综合指标见表2。
由表2可知，主次因素顺序为C＞A＞B＞D，超声辅助酶法提取柚子皮多糖的最佳工艺条件A1B2C2D2，即超声温度为30℃，超声时间为40 min，复合酶添加量为1.5%，酶解时间为50 min，在最佳优化条件下验证得出柚子皮多糖得率为（27.21±0.51）%，均高于其他工艺条件下各指标值。
表2 正交试验设计与结果
Table 2 Orthogonal experimental design and results
试验号 A超声温度/℃B超声时间/min C复合酶添加量/%D酶解时间/min多糖得率/%1 1（30）1（30）1（1.0）1（40）15.42±0.32 2 1 2（40）2（1.5）2（50）27.21±0.51 3 1 3（50）3（2.0）3（60）22.02±0.34 4 2（40）1 2 3 26.64±0.26 5 2 2 3 1 22.23±0.21 6 2 3 1 2 19.42±0.26 7 3（50）1 3 2 24.34±0.17 8 3 2 1 3 21.62±0.11 9 3 3 2 1 19.42±0.27 k1 21.550 22.133 18.820 20.690 k2 22.763 23.687 24.423 20.323 k3 21.793 20.287 22.863 23.427 R 1.213 3.400 5.603 4.634主次因素 C＞D＞B＞A最优组合 A1B2C2D2
2.3 模拟体外消化产物的抗氧化活性变化
2.3.1 体外模拟口腔唾液消化过程中柚子皮多糖消化液的抗氧化活性变化
柚子皮多糖模拟口腔唾液消化过程中DPPH·、·OH和O2-·清除率的变化见图5。
图5 模拟口腔唾液消化过程中DPPH·、·OH和O2-·清除率变化规律
Fig.5 Changes of DPPH·，·OH and O2-·scavenging ability during the digestion process of simulated oral saliva
由图5可知柚子皮多糖模拟体外口腔唾液消化产物具有DPPH·、·OH和O2-·清除能力。在模拟消化5min时柚子皮多糖消化液的DPPH·、·OH和O2-·清除率分别为（30.2±2.10）%、（50.7±1.12）%和（13.45±2.41）%。随着消化时间的延长，DPPH·清除率和·OH清除率呈先上升后下降趋势，在唾液消化20 min时，DPPH·、·OH和O2-·清除率分别达到最大为（58.65±2.67）%、（76.12±2.31）%和（16.73±2.20）%，推测原因可能与唾液里的消化酶作用时间有关，这与姚思雯等[10]的研究结果一致。但DPPH·清除率达到最高清除能力时低于1 mg/mL的VC溶液，·OH清除率低于3 mg/mL的VC溶液，O2-·清除率达到最高清除能力时远低于0.1 mg/mL的VC溶液。
2.3.2 体外模拟胃液消化过程中柚子皮多糖消化液的抗氧化活性变化
柚子皮多糖模拟胃液消化过程中DPPH·、·OH和O2-·清除率的变化见图6。
图6 模拟胃液消化过程中DPPH·、·OH和O2-·清除率变化规律
Fig.6 Changes of DPPH·、·OH and O2-·scavenging ability during simulated gastric juice digestion
图6表明柚子皮多糖在模拟胃液中的消化产物具有DPPH·、·OH和O2-·清除能力。体外模拟胃液消化5 min时柚子皮多糖消化液的DPPH·、·OH和O2-·和清除率分别为（45.23±2.20）%、（51.17±3.02）%和（20.12±2.02）%。DPPH·清除率随着消化时间的延长先上升后下降，在模拟消化2h时达到最大清除率为（70.16±2.26）%。继续延长消化时间，DPPH·清除率下降，这可能是因为柚子皮多糖消化后其结构和化学性质发生了变化[10]。·OH清除率在消化1 h时间内变化不大，在消化1 h时，清除率最大为（58.34±2.45）%。O2-·清除率在胃液消化1 h时清除率达到最大为（32.12±1.78）%。但DPPH·达到最高清除能力时低于2 mg/mL的VC溶液，·OH达到最高清除能力低于化2 mg/mL的VC溶液，O2-·达到最高清除能力远低于化0.1 mg/mL的VC溶液。
2.3.3 体外模拟肠液消化过程中柚子皮多糖消化液的抗氧化活性变化
柚子皮多糖模拟肠液消化过程中DPPH·、·OH和O2-·清除率的变化见图7。
图7表明柚子皮多糖在模拟肠液中的消化产物具有·OH、O2-·和DPPH·清除能力。体外模拟肠液消化5 min时柚子皮多糖消化液的DPPH·、·OH和O2-·清除率分别为（34.3±2.31）%、（37.6±2.22）%和（38.72±2.25）%。在小肠消化8 h时，DPPH·清除率达到最大为（47.22±2.27）%，·OH清除率在模拟消化6 h时达到最大清除率（68.50±2.20）%，继续延长消化时间，·OH 清除率下降，这可能是因为在模拟肠液消化过程中，柚子皮多糖消化液可能收到了消化酶或者温度等因素的影响，使得结构和性质发生了改变，从而引起了活性的变化[10]。O2·-清除率在小肠消化4 h时，清除率达到最大为（53.80±2.15）%。但DPPH·达到最高清除能力远低于0.1 mg/mL的VC溶液，·OH达到最高清除能力低于2 mg/mL的VC溶液，O2·-达到最高清除能力远低于0.1 mg/mL的VC溶液。VC溶液DPPH·、·OH和O2-·清除率见表 3。
图7 模拟肠液消化过程中DPPH·、·OH和O2-·清除率变化规律
Fig.7 Changes of DPPH·，·OH and O2-·clearing ability during the digestion of simulated intestinal juice
表3 VC溶液 DPPH·、·OH 和 O2-·清除率
Table 3 The ability of VCsolution to remove DPPH·，·OH and O2-·radicals
VC溶液/（mg/mL）DPPH·清除率/%·OH清除率/%O2-·清除率/%0.1 54.21±0.13 30.45±0.05 56.43±0.09 0.5 56.45±0.08 49.21±0.12 68.99±0.13 1.0 61.32±0.11 63.00±0.21 79.87±0.09 2.0 80.21±0.07 74.45±0.15 86.89±0.21 3.0 86.76±0.13 82.22±0.12 93.43±0.22 4.0 89.32±0.12 89.86±0.05 96.43±0.17 5.0 95.32±0.10 96.53±0.13 98.76±0.13
3 结论
采用超声辅助酶法提取柚子皮多糖，在单因素试验基础上利用正交试验进行分析优化，获得的最佳工艺参数为：超声温度30℃、超声时间40 min、复合酶添加量为1.5%、酶解时间50 min，在此条件下多糖得率为（27.21±0.51）%，在此条件下柚子皮多糖纯度为68.12%，由体外模拟消化抗氧化试验可知柚子皮多糖消化产物均具有DPPH·、·OH和O2-·的清除能力。结果表明，柚子皮多糖消化产物在模拟口腔唾液20 min时，DPPH·、·OH和 O2-·清除能力分别达到最高为（58.65±2.67）%、（76.12 ±2.31）%和（16.73 ±2.20）%。在模拟胃液消化时，DPPH·清除率在消化2 h时最强为（70.16±2.26）%，·OH 和 O2-·清除能力在 1 h 时最强，分别达到（58.34±2.45）%和（32.12±1.78）%。 在模拟小肠消化时，DPPH·、·OH和O2-·清除率分别在消化8、6、4 h时达到最强。在模拟小肠消化8 h时，DPPH·清除率达到了（47.22±2.27）%、·OH 在消化 6 h时达到最大为（68.50±2.24）%，O2-·清除率在消化时间为 4 h时达到最大为（53.80±2.15）%。
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