亚硝酸盐（nitrite，NIT）外观与食用盐极为相似，颜色为白色或者黄色，普遍存在于自然界和日常生活中。在自然环境下，NIT由硝酸盐还原生成和铵盐氧化生成，硝酸盐和铵盐本身都是无毒的，在特定条件下经化学反应后就会生成有毒的NIT，NIT被用作添加剂是法定许可的，而且常作为添加剂广泛用于食品加工中。当然，NIT的使用量须严格管控，GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中明确规定其使用量不得超过150 mg/kg，残留量不得超过30 mg/kg[1]。现在常用降解NIT的方法有：加入酸性物质使亚硝酸盐生成不稳定的亚硝酸，亚硝酸分解又可以生成对心血管有益的NO；加入碱性氨基酸使NIT转变成亚硝胺；加入高浓度食盐溶液，使离子浓度增高，降低pH值的同时降低NIT浓度[2]。乳酸菌发酵法是一种更为安全、快速的方法[3]，当乳酸菌在有亚硝酸盐的环境时，自身会产生亚硝酸盐还原酶，从而达到降低亚硝酸盐含量的目的。乳酸菌发酵前期pH值较高，主要是通过亚硝酸盐还原酶来降解NIT，随着乳酸菌生产的乳酸越来越多，其pH值会一直下降，发酵后期降解NIT则主要由乳酸来实现。
亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase，NIR）能够还原亚硝酸盐，生成NH4+或N2。目前，亚硝酸盐还原酶已从多种高等植物、蓝藻、细菌分离提纯获得。此外，NIR是一种胞内酶，大多数位于周质间隙或细胞膜中。亚硝酸盐还原酶在植物和微生物细胞内分布在不同位置，因此需要利用不同的处理方法来提取酶液[4]。主要的方法原理是：根据酶的疏水性和分子大小等性质，用疏水相互作用、尺寸排阻色谱等方法纯化还原酶[5]。自20世纪80年代起，国内外研究者从分离纯化、定位、光谱性质、蛋白结构和编码基因等方面，探讨了亚硝酸盐还原酶的性质。迄今为止，人们研究发现了4种亚硝酸还原酶：nirK、nirS、nrfA、nasB[6]。亚硝酸还原酶基因和蛋白序列的差异性很大，同种类微生物中不同类型的亚硝酸还原酶，不同种类微生物中不同类型的亚硝酸还原酶，其序列也会表现出明显的差异性。大肠杆菌中的降解亚硝酸盐活性的功能基因片段，利用生物信息分析手段已经被确定[7]。目前植物乳杆菌上编码硝酸还原酶的功能性基因还未被明确，根据基因库中已知的亚硝酸盐还原酶蛋白序列的保守序列，查找到了植物乳杆菌功能基因组上的亚硝酸盐还原酶疑似基因[8-9]。
植物乳杆菌等产生的NIR在25℃～38℃时酶活均较高，其最适温度为30℃左右，当温度为15℃时，NIR的酶活会受到抑制，酶活力降至原来的10%；当温度为50℃时，酶会失去活性。NIR在pH值为5～6时，酶均表现有较明显活力，酶的最适反应pH值为5.5。与酸性环境不一样，在碱性环境中，酶活性将受到限制甚至全部消失。在这些最适反应条件下，测得酶的米氏常数Km值为120.5 μg/mL[10]。
目前研究表明，只有部分乳酸菌会产生NIR，且会因基因表达差异而产生不同类型的亚硝酸盐还原酶。本文对自然发酵泡菜中产生的亚硝酸盐微生物进行分离纯化，对其中降解NIT效率最高的菌株鼠李糖乳杆菌N-6的培养基和部分培养条件进行优化，对酶液进行初步纯化，并测定纯化后的酶活性。
1 材料与方法
1.1 材料
自然发酵泡菜：市售；MRS液体培养基：蛋白胨2g、葡萄糖 4 g、乙酸钠 1 g、硫酸镁0.04 g、硫酸锰 0.01 g、牛肉粉1 g、酵母粉0.8 g、磷酸氢二钾0.4 g、柠檬酸三铵0.4 g、吐温80 0.2 mL、蒸馏水200 mL；平板筛选培养基：MRS液体培养基加入2.8 g琼脂，200 mL去离子水；盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、亚硝酸钠：国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨、葡萄糖、乙酸钠、盐酸萘乙二胺、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、对氨基苯磺酸、硼酸钠、乙酸锌、亚氰化钾、盐酸、冰乙酸（分析纯）：北京北化精细化学品有限责任公司；引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；以上试剂均为分析纯。
1.2 仪器
BS2202S型电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；BXM-30R高压灭菌锅：上海博讯实业有限公司；HH-SY11-Ni1电热恒温水浴锅：北京长安科学仪器厂；UVmini－1240紫外可见分光光度计：日本岛津公司；4k15 3-18k冷冻高速离心机：Sigma公司；DYY-12C电泳仪：北京六一仪器厂。
1.3 亚硝酸钠含量测定
1.3.1 溶液配制
盐酸萘乙二胺溶液：准确称取0.1 g盐酸萘乙二胺，溶解于50 mL超纯水中，混匀，置棕色瓶中，避光4℃保存待用；对氨基苯磺酸溶液：称取0.4 g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%盐酸中，置于棕色瓶中混匀，避光保存待用。亚硝酸钠标准溶液：准确称取0.1 g亚硝酸钠，加入超纯水溶解，移入500 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液即为亚硝酸钠标准溶液。
1.3.2 亚硝酸钠标准曲线测定
准确吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、5.0 mL 亚硝酸钠标准溶液，分别置于50 mL容量瓶中，加入40 mL超纯水，摇匀，加入2 mL对氨基苯磺酸溶液，摇匀，置于避光处反应5 min；再加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，定容至50 mL，混匀，避光静置15 min。设置分光光度计波长为538 nm，分别测定吸光值，以亚硝酸钠溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制亚硝酸钠标准曲线。亚硝酸钠在0～0.25 μg/mL的浓度范围内与A538呈良好的线性关系，以吸光度A538对亚硝酸钠浓度进行线性回归，得到回归方程如下：y=1.058 3x+0.001 5（R2=0.998 72）；y 表示吸光度值 A538；x 表示亚硝酸钠浓度，μg/mL。
1.4 高产NIR的乳酸菌筛选
1.4.1 菌株活化
活化培养基为MRS液体培养基，配制100 mL MRS培养基，接种1 g双歧杆菌酸奶发酵剂，置于摇床中30 ℃，180 r/min，培养24 h。
1.4.2 分离筛选
配制300 mL MRS琼脂培养基将活化好的新鲜种子液分别稀释1、10、100、1 000倍，将这4种浓度的菌液以涂布法接种在平板中，每个浓度接种2个平板，30℃培养24 h。配制500 mL MRS液体培养基，121℃灭菌20 min，选取长势较好菌落，用接种环分别接种到锥形瓶中，30℃培养24 h。从平板中筛选的菌落序号分别为 N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-10、N-14、N-17、N-21、N-22、N-25、N-28、N-29、N-31[11]。
1.4.3 盐酸萘乙二胺分光光度法测定菌株分解亚硝酸盐能力
1.4.3.1 溶液配制
饱和硼酸钠溶液：称取50 g硼酸钠，溶于1 000 mL热水中，冷却备用；乙酸锌溶液：称取22 g乙酸锌，加入3 mL冰乙酸，最后再加水稀释到100 mL；亚铁氰化钾溶液：称取10.6 g亚铁氰化钾，加水至100 mL，搅拌溶解；盐酸萘乙二胺溶液：称取0.1 g盐酸萘乙二胺，溶解于50 mL水中，搅拌混匀，放入棕色瓶中备用；对氨基苯磺酸溶液：称取0.4 g对氨基苯磺酸，溶解于100 mL去离子水中，放进棕色瓶中备用。
配制NaNO2浓度为125 μg/mL的MRS液体培养基500 mL和不含NaNO2的液体培养基100 mL，以接种量3%，30℃培养24 h[12]。
1.4.3.2 吸光度测定
试样处理：吸取5 mL样品，分别置于250 mL三角瓶中，加入饱和硼砂溶液12.5mL，摇匀后再加入约50 mL蒸馏水，沸水锅里加热15 min，取出后冷却至25℃，再转移到100mL容量瓶中，加入5mL亚铁氰化钾溶液，混匀，再加入5mL乙酸锌溶液，定容到100mL，充分混匀，静置约30 min，沉淀样品中的蛋白质。这沉淀进行抽滤，弃去初滤液30 mL，收集剩余的滤液。
吸取2 mL上述滤液于50 mL容量瓶中，加水40 mL，摇晃均匀，先加入2 mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，避光静置5 min，再加入1 mL盐酸萘乙二胺溶液，定容至50 mL，混匀，避光静置15 min，在波长538 nm处测定吸光值[13]。
1.5 菌株筛选
引物序列为 27f：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG；1492r：GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR的反应条件：95℃预变性 5 min，95℃变形 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸1.5min，共循环30次，最后72℃延伸10min。基因测序：由北京华大测序公司进行。
1.6 影响高产菌株NIR的培养条件优化
筛选出的高产菌株，以NIT为指标，以碳源、氮源、磷源、培养温度与培养方式作为影响因素进行单因素试验，初始培养条件设定为2%葡萄糖、0.5%酪蛋白胨、0.2%磷酸二氢钾、培养温度37℃，动态培养，其中碳源分别选取蔗糖、葡萄糖和乳糖，并以不加碳源为空白对照。氮源分别选取蛋白胨、酪蛋白胨及胰蛋白胨，以不加氮源为空白对照，磷源分别选取磷酸二氢钠、磷酸氢二钠及磷酸二氢钾，以不加磷源为无磷空白对照，培养温度分别选取 20、30、37、40 ℃，培养方式选用动态和静态两种不同培养方式[14]。
1.7 亚硝酸还原酶的提取与分离纯化
1.7.1 蛋白质浓度测定
双缩脲法测定蛋白含量，首先制定标准曲线，测得蛋白质含量的回归方程曲线y=0.077 3x+0.005，回归系数R2=0.999 3，线性度较好[15]。
1.7.2 酶活测定方法
1.7.2.1 酶活力计算
酶活力单位定义：每小时降解1 μg亚硝酸盐所需要的酶量为一个酶活力单位（U），即1 U=1 μg/h。
1.7.2.2 酶活反应体系
取干净试管，加入1%葡萄糖1mL，50μg/mLNaNO2 1 mL，0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲液（pH7.2）7 mL，酶液1 mL，在40℃保温反应24 h。加入0.4%对氨基苯磺酸溶液2 mL，混匀，避光静置5 min。再加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液1 mL，静置15 min，在538 nm波长下测吸光值计算酶活力。以磷酸缓冲液代替酶液为空白对照，以磷酸缓冲液代替NaNO2溶液和酶液作为调零值[16]。
1.7.3 粗酶液制备与纯化
亚硝酸还原酶粗酶液的提取制备方法为溶菌酶和超声波破碎，具体制备过程参照文献[17]。粗酶液的纯化步骤：粗酶液—硫酸铵分级盐析—透析—二乙基氨基乙基纤维素阴离子交换层析—透析—浓缩—目的蛋白，具体操作过程见文献[18]。
1.7.3.1 NIR粗酶液的制备
将初筛获得的菌株分别接入含0.2 mg/mL亚硝酸钠的培养基中，30℃培养24 h。分别取菌液100 mL，6 000 r/min 4℃离心10 min。收集沉淀，弃去上清液，用10 mL磷酸盐缓冲液（pH=7.2）。振荡，将菌体悬浮，加入溶菌酶，使其浓度为5 mg/mL，30℃反应24 h。经过超声波破碎后，8 000 r/min 4℃离心15 min。取上清液即为粗酶液[19]。
1.7.3.2 硫酸铵分级盐析
本研究采用硫酸铵沉淀法来沉淀上清液中的蛋白成分。
根据盐析粗酶液的体积，称取30%硫酸铵，置于4℃冰箱 4h，再离心（20 min、6 000 r/min），留上清液去沉淀。向上清液中继续添加硫酸铵（饱和度达到60%），4℃放置 4 h，离心（15 min，1 200 r/min），收集沉淀。将沉淀溶于粗酶液同体积的磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L、pH7.2）[20]。
1.7.3.3 透析
选用的透析袋截留范围是8 000～14 000，透析袋的预处理参考文献[21]。
1.7.3.4 二乙基氨基乙基纤维素（diethylaminoethylcellulose，DEAE）阴离子交换层析
选择的阴离子交换层析为DEAE琼脂糖凝胶CL-6B，层析柱规格为1.6 cm×30 cm。具体操作步骤如下：根据柱子大小取适量的凝胶。凝胶高度达到柱子高度的80%左右，自然沉降。沉降完成后用去离子水平衡12 h，备用，取粗酶液，上样量3 mL。上样前过0.22 mm孔径聚醚砜滤膜，除去不溶物。洗脱：用含0.5 mol/L NaCl的0.002 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在2 mL/min的流速下进行洗脱，洗脱液每5 min收集一管，每管3 mL，共收集80管；检测：经酶标仪在280 nm波长下测定每一管蛋白溶液的吸光值，并绘制层析图谱。然后收集峰值较高处的蛋白，用双缩脲法检测蛋白质含量；再生：用洗脱液洗脱各组分直到完全洗脱，即可加入新的样品，继续使用。
1.8 数据处理
利用Excel进行数据汇总，并利用Origin95进行绘图。
2 结果与分析
2.1 菌落初步筛选
不同菌落作用后的亚硝酸钠含量见图1。
通过盐酸萘乙二胺分光光度法测试菌株分解亚硝酸盐能力，由图1可知，亚硝酸钠含量越高，意味着降解率越底，因此初步筛选出亚硝酸钠含量较低的菌落，分别为 N-6、N-25、N-28、N-31。
图1 不同菌落作用后的亚硝酸钠含量
Fig.1 Sodium nitrite content after different colonies
2.2 高产NIR酶活测定结果
不同菌落的NIT降解率结果见图2。
图2 不同菌落的NIT降解率
Fig.2 NIT degradation rate of different colonies
如图2所示，从泡菜样品中，初步筛选得出N-6、N-25、N-28、N-31号乳酸杆菌可高效降解NIT，其中N-6的降解率最高。经16SrDNA序列测序鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。
2.3 鼠李糖乳杆菌N-6培养条件优化
试验得出了鼠李糖乳杆菌N-6为最高产亚硝酸盐还原酶的乳杆菌，因此将进一步研究探索出影响鼠李糖乳杆菌产生NIR的最佳条件。影响乳杆菌降解NIT因素有很多，包括碳源、氮源、磷源、培养方式及培养温度等，本文对上述影响因素进行试验，得到鼠李糖乳杆菌产生NIR的最佳条件。
2.3.1 碳源对亚硝酸还原酶活性的影响
不同碳源对鼠李糖乳杆菌降解亚硝酸盐结果见图3。
由图3可知，无碳对照的NIT降解率为0.01%，由此说明碳源对鼠李糖乳杆菌影响较大，其中葡萄糖为最佳碳源，其降解率为52.22%，其降解亚硝酸钠的能力明显更强。这可能是由于鼠李糖乳杆菌自身对糖的转运和代谢效率会因糖而异，导致在降解亚硝酸盐上的差别。
图3 不同碳源对降解NIT的影响
Fig.3 Effect of different carbon sources on degradation of NIT
2.3.2 氮源对亚硝酸还原酶活性的影响
不同氮源对降解NIT的影响见图4。
图4 不同氮源对降解NIT的影响
Fig.4 Effect of different nitrogen sources on degradation of NIT
由图4可知，无氮对照的NIT降解率为44.44%，其中氮源为酪蛋白胨时鼠李糖乳杆菌的降解率最高，为68.89%。因此，此菌的最佳氮源为酪蛋白胨。
2.3.3 磷源对亚硝酸还原酶活性的影响
不同磷源对鼠李糖乳杆菌降解亚硝酸盐结果见图5。
由图5可知，无磷对照的降解率高于磷酸二氢钠与磷酸氢二钠，而低于磷酸二氢钾，因此鼠李糖乳杆菌的最佳磷源为磷酸二氢钾。
图5 不同磷源对NIT降解率的影响
Fig.5 Effect of different phosphorus sources on the degradation rate of NIT
2.3.4 培养温度对鼠李糖乳杆菌降解亚硝酸盐的影响
不同培养温度对鼠李糖乳杆菌降解亚硝酸盐结果见图6。
由图6可知，鼠李糖乳杆菌的最适培养温度为37℃。
图6 不同温度条件下的NIT降解率
Fig.6 NIT degradation rate under different temperature conditions
2.3.5 不同培养方式对亚硝酸还原酶活性的影响
采用静置培养和动态培养（摇床通气培养）两种培养方式，结果见图7。
图7 不同培养方式对NIT降解率的影响
Fig.7 Effects of different culture methods on the degradation rate of NIT
由图7可知，动态培养鼠李糖乳杆菌时，其亚硝酸盐降解率较高，而静态培养对亚硝酸盐降解率相对较低，在动态培养中培养基的营养成分能被充分利用，菌株活力变强，而静态培养的菌株则相对不能充分利用营养。
2.4 亚硝酸还原酶的分离纯化
2.4.1 硫酸铵分级盐析结果分析
盐析过程酶活性见表1。
表1 盐析过程酶活性
Table 1 Enzyme activity during salting out
images/BZ_194_464_857_1170_888.png硫酸铵浓度NaNO2含量/（μg/mL）酶活力/（U/mL）离心沉淀 离心上清液 离心沉淀 离心上清液30%硫酸铵盐析 3.07 0 303.875 2.82 60%硫酸铵盐析 3.48 10.33 309.375 0
由表1可知，经30%硫酸铵盐析处理，离心后所得蛋白沉淀测得酶活：303.875 U/mL；经60%硫酸铵处理上清液，离心后所得蛋白沉淀测得酶活力：309.375 U/mL，上清液中无酶活性。上清液已经无法检测出酶活性，表明酶蛋白已经完全经盐析沉淀下来，得到很好的分离。同时也表明，60%的硫酸铵浓度更有利于蛋白质的析出。因此，对于此还原酶来说，盐析时选择较高浓度的盐浓度（60%）比较有利于蛋白质沉淀完全。
2.4.2 DEAE阴离子层析交换结果分析
DEAE琼脂糖凝胶CL-6B层析图谱见图8。
图8 DEAE琼脂糖凝胶CL-6B层析图谱
Fig.8 DEAE agarose gel CL-6B chromatogram
A.洗脱蛋白。
如图8所示，DEAE琼脂糖凝胶CL-6B层析图谱包含4个洗脱峰值，收集这4个峰值附近的几个酶活力高的洗脱液进行浓缩，测定蛋白含量和酶活力。A处的洗脱液酶活力最高为764.49 U/mL，其它洗脱峰经检测后均无酶活，可能为杂蛋白。
粗酶液、盐析、透析与阴离子交换柱的蛋白含量与酶活力见表2。
由表2可知，经过盐析后亚硝酸盐还原酶的活性无显著提升，在采用透析袋，透析24 h后，经透析后测得还原酶活力为：208.48 U/mL。经透析除盐后，相对于上述盐析后的酶液酶活性有所提高。经DEAE柱层析分离纯化后还原酶的酶活力由60.83 U/mL提高到764.49 U/mL，纯化倍数为12.57倍。
表2 分离纯化亚硝酸还原酶蛋白含量及酶活力变化
Table 2 Isolation and purification of nitrite reductase protein content and enzyme activity
项目 蛋白含量/（mg/mL）酶活力/（U/mL） 纯化倍数粗酶液 5.402 60.83 1盐析 4.239 72.99 1.2透析 2.858 208.48 3.43 DEAE柱层析 0.665 764.49 12.57
3 结论
通过筛选多种乳酸杆菌后得出鼠李糖乳杆菌N-6所产生的亚硝酸盐还原酶的降解能力最强。进一步研究出影响鼠李糖产生NIR的最佳条件，培养基中的最适碳源、氮源、磷源、培养方式和温度分别为2%葡萄糖、0.5%酪蛋白胨、0.2%磷酸二氢钾、动态培养、37℃。
对菌液进行粗提，对结合超声波法得到的粗酶液、再经硫酸铵盐析、透析、阴离子层析法3种方法逐级分离纯化所提粗酶液，提高酶活性。经分离纯化后还原酶酶活力由60.83 U/mL提高到764.49 U/mL，有效地提高了还原酶纯度。
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