抗性淀粉（resistant starch，RS）作为一种新型的膳食纤维，在调节血糖、降脂减肥、降低胆固醇、预防肠道疾病等方面的功能特性引起人们的关注[1-6]。RS含量的准确测定对于评价一种食品是否具有减肥[7-8]、预防糖尿病[9]和结肠癌[10-11]等疾病的功效有重要影响。
RS的测定方法因其测定原理不同，结果差异较大。具有代表性的方法有 Berry 法[12]、Englyst法[13]、Goni法[14]、McCleary 法[15-16]、Champ 法及其改良法等[17]。Berry 法主要通过测定去除可溶性淀粉后所得到的不溶性淀粉来计算RS百分含量。由于淀粉溶解速度不同，在具体操作时溶解程度难以控制，导致结果真实性降低[18]。Englyst法通过测定淀粉总量以及被酶解的淀粉含量的差值得到RS的含量，该法操作时间长且重复性差。Goni法在Berry法的基础上增加胃蛋白酶，以消化蛋白质来模拟体内消化环境，此方法比Berry法和Englyst法简单，但缺少与人体实验对比相关数据。Champ改良法与Englyst法结果相似，但比后者更易于操作，缺点是需要做更多体内验证试验[19]。McCleary法被采用为国际公认的美国分析化学家协会 （Association of Official Analytical Chemists，AOAC）方法，是目前应用最多的方法。用AOAC法测定RS含量稳定性好，精确度高，但测量操作复杂，耗时长，费用昂贵，面对种类繁多的淀粉食品，能够快速、简单检测出其中的RS含量是亟待解决的问题。重量法[20-21]是一种操作简便、快速的测量方法，主要适用于研究以淀粉为主要成分的体系，尤其是无脂肪存在的环境中。AOAC法是将样品水解后得到的沉淀用碱液溶解后再调节至中性，然后用淀粉酶和葡萄糖苷酶再次水解淀粉得到葡萄糖，将葡萄糖换算为淀粉质量，这个质量与重量法中的沉淀的质量差异即是两种方法差异的本质所在。为此本文分别采用重量法与AOAC法测定常见的8种零食食品和课题组研发的玉米回生淀粉Ⅰ、玉米回生淀粉Ⅱ、含醇溶蛋白玉米回生淀粉、分别添加了40%和80%含醇溶蛋白玉米回生淀粉的馒头共13种样品中的RS含量，分析两种方法可以互换的测定条件及可能性，界定重量法可测定的食品种类和抗性淀粉含量的范围，为加快淀粉回生控制技术的研发速度提供快速、高效的评判手段。
1 材料和方法
1.1 材料
红豆薏仁粉、香蕉片：杭州市郝姆斯食品有限公司；原味切片面包：沈阳桃李面包有限公司；烤馍片：内蒙古美好食品有限公司；马铃薯薯片：百事食品有限公司；山药薯片：恰恰食品股份有限公司；雪饼：北京大旺食品有限公司；曲奇饼干：西安飞腾食品厂；玉米回生淀粉Ⅰ、玉米回生淀粉Ⅱ、含醇溶蛋白玉米回生淀粉、添加40%含醇溶蛋白玉米回生淀粉的馒头、添加80%含醇溶蛋白玉米回生淀粉的馒头：天津市食品生物技术重点实验室课题组研发生产。
1.2 主要试剂
中性蛋白酶（50 U/mg）、中性脂肪酶（100 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司；高温淀粉酶（20 000 U/mL）：天津诺奥酶生产力促进有限公司；α-胰腺淀粉酶（1000U/mg）、淀粉葡萄糖苷酶（amyloglucosidase，AMG，500 U/g）：Sigma公司；无水乙醇、无水亚硫酸钠：天津市化学试剂供销公司；氢氧化钾、氢氧化钠、柠檬酸、结晶酚、酒石酸钾钠：天津渤化化学试剂有限公司；磷酸氢二钠：天津市元力化工有限公司；二水合氯化钙：天津市科密欧化学试剂有限公司；3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、马来酸：天津市大茂化学试剂厂；葡萄糖：天津市华东试剂厂。以上化学试剂均为分析纯。
1.3 主要仪器设备
KDM可调控温电热套：山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；ME104电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DZKW-D-2电热恒温水浴锅、101-0E电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器有限公司；BCD-229KB海尔冰箱：青岛海尔股份有限公司；HNY-100D水涡恒温振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；L535-1湘仪低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；UV2600紫外可见分光光度计：天美（中国）科学仪器有限公司天津分公司；6020小型高速粉碎机：欣镇精密企业有限公司；远洋牌精密pH试纸（pH 3.8～5.4）、B-广泛试纸（pH1～14）：天津市塘沽区化学试剂厂。
1.4 试验方法
1.4.1 原料的预处理
由于香蕉片、山药薯片、曲奇饼干、红豆薏仁粉、原味切片面包、烤馍片、马铃薯薯片和雪饼8种零食食品中油脂含量较大，测定前需用索氏提取器脱除其中的油脂，再烘干至恒重并粉碎筛分后备用。
1.4.2 重量法
参考文献[12]的Berry法，准确称取质量为M的待测样品粉末，加入去离子水并搅拌使样品充分溶解；置于55℃水浴锅中，加入样品质量1%的中性蛋白酶并搅拌水解1 h，以除去样品中的蛋白质；置于45℃的水浴锅中，加入0.1%的中性脂肪酶，并搅拌，水解1 h，除去索氏提取未除尽的脂肪；置于90℃的水浴锅中，滴加适量高温淀粉酶，并搅拌，水解样品约1.5 h，使淀粉得到充分的水解；所得样品在3 000 g的条件下离心10 min后倾倒上清液，以除去可溶性淀粉；离心后的样品置于鼓风干燥箱中80℃烘干至恒重；并称取干燥后的质量，记为M1（g）。样品的RS含量/%=M1/M×100。
1.4.3 AOAC法
参照AOAC 2002.02《淀粉与植物性基质中的抗性淀粉酶消化法》测定样品中RS含量。称取100 mg样品，加入4 mL α-胰腺淀粉酶悬浮液，旋紧试管盖，置于水涡恒温振荡器中混匀，于37℃振荡16 h；将样品中非抗性淀粉全部水解为葡萄糖，再加入4 mL的无水乙醇和50%的乙醇对葡萄糖进行多次洗涤，离心除去上清液得到RS沉淀。该沉淀经KOH溶液和AMG处理后，采用DNS法测定葡萄糖含量M2（g）。葡萄糖与DNS反应可以产生显色复合物。用分光光度计在波长为540 nm下测定其吸光度值，吸光度值与葡萄糖的含量呈正比的关系（葡萄糖标准曲线方程为：Y=1.794 7X+0.015 9，R2=0.998 2）。样品的 RS 含量/g=M2×0.9。
1.5 统计学处理
每个数据均取自3个重复试验的均值。利用方差分析和最小显著差异（least significant difference，LSD）法分析数据的差异显著性（采用Excel软件）。
2 结果和分析
2.1 8种零食样品的含水量
表1为8种零食样品的含水量。
表1 8种零食样品含水量
Table 1 Analysis of the moisture contents of the 8 kinds of commonly snacks samples
样品名称 初始质量/g 烘干后的质量/g 含水量/%香蕉片 115.20±0.10 114.41±0.11 0.69红豆薏仁粉 28.70±0.04 28.32±0.06 1.32原味切片面包 206.00±0.31 142.81±0.40 30.67烤馍片 98.10±0.20 95.02±0.24 3.14马铃薯薯片 134.80±0.11 132.09±0.10 2.01山药薯片 149.40±0.11 148.40±0.11 0.70雪饼 141.10±0.12 141.10±0.12 0曲奇饼干 158.50±0.21 150.60±0.10 4.98
由表1可知，8种零食样品含水量范围为0%～30.67%，不同样品的含水量差异很大，其中含水量最高的是原味切片面包，为30.67%，膨化食品雪饼含水量最低为0%。试验过程尝试不经干燥处理脱除样品中的脂肪，发现水分存在对样品中脂肪脱除影响很大，脱除效率不高。为了高效彻底脱除测试样品中的油脂，试验前需要对8种零食样品进行烘干处理。其它5种样品不含油脂，没有测定其含水量，馒头样品干燥后进行粉碎过筛处理。因此，在测定食品中抗性淀粉含量时，需先对食品样品进行干燥脱水处理，以便后续酶解等试验过程顺利进行。
2.2 8种零食样品的油脂含量
脂类是大多数食品中必不可缺少的添加物之一。如微波膨化食品中，向淀粉中添加油脂能够改善膨化食品的脆度、风味、口感、质构等[22]。油脂可以和食品中直链淀粉结合形成第5种抗性淀粉（resistant starch 5，RS5）[23]。现有AOAC法无法测定这部分抗性淀粉含量，这部分油脂在测定过程被脂肪酶水解。按照重量法测定前处理样品的预试验发现，酶解前油脂含量高，食品粉末加水搅拌过程会形成黏稠凝胶，加入脂肪酶后凝胶强度更大，无法搅拌，难以进行正常酶解，测定无法继续进行。这种黏稠凝胶是脂肪酶水解样品中脂肪生成的中短链脂肪在食品添加剂单甘油脂肪酸酯等凝胶剂作用下形成的，限制了脂肪酶进一步对脂类水解，后续抗性淀粉含量测定无法完成。因此重量法测定食品中抗性淀粉含量前需要利用索氏提取器对样品进行去油脂的预处理。表2是8种零食样品油脂含量。
表2 8种零食样品中油脂含量
Table 2 Analysis of the oil contents of the 8 kinds of commonly snacks samples
样品名称 样品质量/g 去脂后的质量/g 油脂含量/%香蕉片 31.10±0.17 15.49±0.11 50.19红豆薏仁粉 27.90±0.06 21.85±0.06 21.69原味切片面包 31.50±0.15 29.04±0.09 7.81烤馍片 34.10±0.21 29.61±0.33 13.17马铃薯薯片 46.80±0.13 40.64±0.15 13.16山药薯片 45.20±0.14 35.53±0.25 21.40雪饼 27.90±0.12 21.63±0.32 22.46曲奇饼干 33.90±0.21 25.88±0.32 23.66
由表2可知，香蕉片、曲奇饼干、雪饼、山药薯片和红豆薏仁粉食品中油脂含量较高，均超过了20%。原味切片面包中最少，仅为7.81%。于文萃报道过5类食品中的脂肪含量，其中奶酪和方便面的脂肪含量也超过了20%[24]。所有样品脱脂处理后初步进行RS含量测定，发现酶解过程没有出现黏稠凝胶状，后续离心、分离、水洗等步骤都可顺利完成。
2.3 重量法和AOAC法的比较
表3是重量法和AOAC法测定样品RS含量的对比。
表3 重量法和AOAC法测定样品中RS含量的对比
Table 3 Comparison of the determination of resistant starch content between gravimetric method and AOAC method
注：误差列数据前面的“-”表示两种方法测定RS含量的差值，不表示运算符号。
样品名称RS含量重量法 AOAC法 两者误差/%标准差images/BZ_156_792_637_807_672.pngRS含量标准差香蕉片 36.55 0.005 23.69 0.005 12.86红豆薏仁粉 23.90 0.009 20.35 0.009 1 2.55原味切片面包 18.15 0.006 23.12 0.003 4 -5.47烤馍片 18.95 0.017 18.47 0.004 5 0.48马铃薯薯片 24.30 0.007 24.77 0.016 7 -0.47山药薯片 12.40 0.015 15.44 0 -3.04雪饼 11.40 0.01 14.46 0.000 3 -3.06曲奇饼干 11.44 0.011 10.09 0.004 7 1.35玉米回生淀粉Ⅰ 26.95 0.021 24.79 0.005 4 2.16玉米回生淀粉Ⅱ 17.70 0.008 21.34 0.015 -3.64含醇溶蛋白玉米回生淀粉 17.80 0.014 13.67 0.002 2 4.13馒头①（添加40%含醇溶蛋白玉米回生淀粉） 17.60 0.016 22.37 0.002 2 -4.77馒头②（添加80%含醇溶蛋白玉米回生淀粉） 22.25 0.018 26.78 0.008 6 -4.53
由表3可知，重量法测定样品RS含量结果显示，香蕉片中RS的含量最高，达到36.55%，RS含量超过20%的样品还有玉米回生淀粉Ⅰ、马铃薯薯片、红豆薏仁粉、馒头②。其它样品RS含量由高到低依次为：烤馍片、原味切片面包、含醇溶蛋白玉米回生淀粉、玉米回生淀粉Ⅱ、馒头①、山药薯片、曲奇饼干、雪饼。由两组含回生抗性淀粉馒头样品测定结果可知，馒头中所含的回生淀粉越多，RS的含量也随之增加，甚至达到或超过了本身回生淀粉产品中RS的含量。说明馒头中这些抗性淀粉添加可促进未回生的面团中淀粉回生转化为抗性淀粉，起到了晶种添加促进淀粉回生的作用[25]。对于淀粉含量高的样品，重量法的灵敏度较高。AOAC法测定所有样品中RS的含量，馒头②含量最高，达到26.78%，其它样品RS含量由高到低依次为：玉米回生淀粉Ⅰ、马铃薯薯片、香蕉片、原味切片面包、馒头①、玉米回生淀粉Ⅱ、红豆薏仁粉、烤馍片、山药薯片、雪饼、含醇溶蛋白玉米回生淀粉、曲奇饼干。
对比表3的数据可知，分析由重量法和AOAC法所测得的所有样品中RS的含量，除香蕉片（油脂含量50.19%）和原味切片面包（含水量30.67%）以外，两种方法测定结果之间误差均在5%以内，所有样品的重复样所得标准差均不超过0.002 1，具有较高的重现性。因此，当样品油脂或水分含量超过30%时，采用重量法测定抗性淀粉含量与AOAC法测定结果误差会大于5%，其它样品采用重量法测定的结果相对标准偏差均在5%以下。对于香蕉片来说，其中的淀粉在油炸过程可能形成RS5类淀粉-油脂混合抗性淀粉[23，26]，这部分淀粉在重量法中被认定为是抗性淀粉，因而测得抗性淀粉含量高。而AOAC法中采用碱液溶解样品所得沉淀物时，这类RS5不能溶解，不被看作是抗性淀粉，因而测定所得抗性淀粉含量低。两种方法测定面包中RS含量的误差可能来源于重量法所用的高温淀粉酶比AOAC法中的α-胰腺淀粉酶所需酶解温度高，可水解一部分在低温下不被淀粉酶水解的支链回生淀粉，因而测定含量偏低。所以测定含水量较高的食品中RS含量时，最好采用AOAC法。
3 结论
本研究通过对13种含淀粉食品样品中RS含量的测定，比较分析重量法和AOAC法测量RS含量时可以互换的测定条件及可能性。结果表明，当食品中油脂或水分含量超过30%时，不能用重量法替代AOAC法测定样品中抗性淀粉含量。AOAC法无法测定RS5型抗性淀粉的含量，有必要深入开展此类抗性淀粉含量标准测定方法的研究试验。重量法快速、准确、成本低，采用重量法有利于促进我国淀粉回生控制技术的发展。
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