花生红衣是花生精深加工过程中的副产物，产量较大，除用作动物饲料以外，在其他加工领域未得到有效利用。经研究发现，花生红衣中主要成分有水分（5%～9%）、蛋白质（11%～18%）、脂肪（10%～14%）、粗纤维（37%～42%）、碳水化合物（12%～28%）、灰分（8%～12%）、单宁（7%）以及多种色素和硒、锌、钙、钾、铁等元素[1-2]。花生红衣中多酚类物质含量为90 mg/g～125 mg/g，包括白藜芦醇、原花青素、酚酸等物质[3-4]，其中原花青素是在热、酸条件下能产生花色素的一种无色物质。原花青素是一种很强的抗氧化物质，它在人体内的抗氧化能力是维生素C的20倍，维生素E的50倍，可用作安全无毒的新型天然抗氧化剂[7-8]。若能充分利用花生红衣中的原花青素，将会获得较可观的经济效益[9]。
利用超声波、微波破碎植物细胞壁，可有效提升植物中功效成分的提取效率[10-12]。尤其是超声辅助提取技术在植物有效成分提取中有较为广泛的应用，在花生红衣的活性成分提取方面也有相应的研究，王菲等[13]、陈洋[14]、童愈元[15]、管文荻[16]用超声辅助提取花生红衣中原花青素；林樱姬等[17]、任虹等[18]用超声辅助技术对花生红衣中多酚进行提取，并取得较好的结果，证明此技术适用于花生红衣活性成分的提取。因此，本研究在超声辅助提取的基础上，结合水浴浸提以提高提取效果，并用正交试验优化原花青素的提取工艺，为花生红衣这一副产物的高值化开发利用提供一定参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
花生红衣：产地为山东，品种为四粒红；无水乙醇、甲醇：天津市北联精细化学品开发有限公司；香草醛（纯度≥99%）：天津市科密欧化学试剂有限公司；4%香草醛-甲醇溶液：精确称取4.00 g香草醛用甲醇溶解并在100 mL容量瓶中定容；盐酸：四川西陇化工有限公司；原花青素标准品（纯度≥98%）：合肥博美生物公司。试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
水浴恒温振荡器（SHA-B）：江苏金怡仪器科技有限公司；旋转蒸发器（RE-3000A）：上海亚荣生化仪器厂；数控超声波清洗器（SB-5200DT）：宁波新芝生物科技股份有限公司；循环水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：郑州长城科工贸有限公司；微型旋涡混合仪（WH-3）：上海沪西分析仪器厂有限公司；数显恒温磁力搅拌水浴锅（EMS-20）：金坛市科顺仪器厂；电子天平（LE203E/02）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；高速冷冻离心机（TGL-20br）：上海安亭科学仪器厂；紫外可见光分光光度计（UV-2450）：岛津公司。
1.3 方法
1.3.1 花生红衣中原花青素的提取方法
称取干燥花生红衣粉碎成粉末状。用适量石油醚对红衣粉末进行脱脂：常温下浸泡24 h，间歇搅拌，抽滤、烘干，得到花生红衣脱脂粉末。精确称取1.0 g脱脂后的花生红衣粉末与乙醇溶液（体积分数40%～80%）按比例[1∶20（g/mL）～1∶60（g/mL）]混合，在 30 ℃～70 ℃下超声处理10 min～50 min。参考王菲等[13]的方法，将超声处理后的样液转入30℃～70℃水浴浸提30 min～70 min。然后将得到的溶液在4 000 r/min条件下离心10min，将上层澄清液取出，用无水甲醇定容至100mL。从中吸取1 mL样液，用无水甲醇定容至10 mL，得到原花青素样品待测液[19-22]。数据均为3次平行试验所得平均值。
1.3.2 原花青素提取率的测定
1.3.2.1 原花青素的测定方法
盐酸-香草醛法测定原花青素：准确吸取3 mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL浓盐酸于试管中，再吸取样品液0.5 mL，迅速混匀，在避光条件下进行20 min显色反应，测定吸光度[23]。
1.3.2.2 原花青素最大吸收波长的确定
精确称取原花青素标准品配制成浓度为0.1mg/mL标准溶液，按照盐酸-香草醛法的条件反应后，在紫外可见分光光度计下进行光谱扫描，选择最大吸收波长。
1.3.2.3 标准曲线的绘制
精确称取50 mg原花青素标准品，用无水甲醇于50 mL容量瓶定容，得到1 mg/mL的标准液，之后分别稀释成 0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL（注：如由 1 mg/mL得到0.1 mg/mL稀释液，取1 mL 1 mg/mL标准液，再加入9 mL无水甲醇）这5个梯度，准确量取0.5 mL各梯度标准品溶液，分别加入含3 mL香草醛-甲醇溶液、1.5 mL浓盐酸的混合液中，快速混匀，避光条件下反应20 min，于500 nm波长下测定吸光度，空白对照为无水甲醇，绘制标准曲线。
1.3.2.4 原花青素提取率的计算
适当稀释原花青素提取液，按照1.3.2.1中方法测定吸光度。根据标准曲线函数计算出样品中原花青素的质量浓度（mg/mL），按照公式（1）计算出原花青素的提取率。
式中：C为原花青素质量浓度，mg/mL；V为提取液体积，mL；n为稀释倍数；m为花生红衣粉末质量，g。
1.4 正交试验优化花生红衣中原花青素提取工艺
在单因素试验的基础上，对料液比、乙醇体积分数、超声温度、超声时间进行四因素三水平正交试验，选择最佳工艺，因素水平如表1所示。
表1 正交试验L9（34）因素水平
Table 1 Factor and levels of the orthogonal experiment L9（34）
因素水平A料液比/（g/mL）B超声温度/℃C超声时间/min D乙醇体积分数/%1 1∶35 35 15 50 2 1∶40 40 20 60 3 1∶45 45 25 70
2 结果与分析
2.1 最大吸收波长选择
在紫外可见分光光度计下进行光谱扫描，原花青素最大吸收波长光谱图见图1。
图1 原花青素最大吸收波长光谱图
Fig.1 Spectrogram of the maximum absorption wavelength of procyanidin
如图1所示，选择出最大吸收波长为500 nm。
2.2 标准曲线绘制
根据原花青素标品所测结果得出标准曲线如图2所示。
图2 原花青素标准曲线
Fig.2 Standard curve of procyanidins
原花青素其标准曲线函数为：y=1.176x+0.007，相关系数R2=0.997 8。式中：x为样品中原花青素质量浓度，mg/mL；y为吸光度。
2.3 单因素试验
2.3.1 水浴温度对原花青素提取率的影响
称取1 g脱脂花生红衣粉末，固定料液比1∶50（g/mL）、超声时间 30 min、超声温度 30 ℃，乙醇体积分数60%，水浴时间50 min，考察水浴温度对原花青素提取效果的影响，见图3。
图3 水浴温度对原花青素提取率的影响
Fig.3 Influence of water bath temperature on extraction rate of procyanidins
如图3所示，在30℃～50℃时提取率随温度升高而上升，50℃之后随温度上升提取率几乎呈直线降低，原因可能是当温度超过一定数值时，原花青素结构受到破坏，使提取率下降，且水浴温度越高所需能耗越大。因此，最适水浴温度选择为50℃。
2.3.2 水浴时间对原花青素提取率的影响
称取1 g脱脂花生红衣粉末，固定料液比1∶50（g/mL）、超声时间 30 min、超声温度 30℃，乙醇体积分数60%，水浴温度60℃，考察水浴时间对原花青素提取效果的影响，见图4。
图4 水浴时间对原花青素提取率的影响
Fig.4 Influence of water bath time on extraction rate of procyanidins
如图4所示，水浴时间在30 min～50 min期间，提取率随时间增加而增加，时间达到50 min后，提取率随时间变化不显著，且略有下降趋势。其原因可能是在水浴时间达到50 min后，原料中原花青素提取达到上限，因此提取率不随时间增长而增长，同时浸提液中原花青素在60℃下发生少量分解使提取率略有降低。综上所得，水浴时间为50 min最佳。
2.3.3 乙醇体积分数对原花青素提取率的影响
称取1 g脱脂花生红衣粉末，固定料液比1∶50（g/mL）、超声时间 30 min、超声温度 30 ℃、水浴温度60℃、水浴时间50 min，考察乙醇体积分数对原花青素提取效果的影响，见图5。
图5 乙醇体积分数对原花青素提取率的影响
Fig.5 Effcect of ethanol concentration on the extraction rate of proanthocyanidins
如图5所示，随着乙醇体积分数增高，原花青素提取率呈上升趋势，在体积分数达到70%后，提取率开始降低。可能是由于随乙醇体积分数增加，极性增大，原料中醇溶性和脂溶性成分溶出率增加，使原花青素与乙醇-水分子结合率降低，从而使原花青素提取率降低。另外，高浓度乙醇使原料中蛋白质等生物大分子变性沉淀，使原花青素溶出阻力增大，降低提取效果。体积分数在60%和70%时，提取率无显著差异，综合考虑，确定乙醇体积分数为60%。
2.3.4 料液比对原花青素提取率的影响
称取1 g脱脂花生红衣粉末，固定乙醇体积分数60%、超声时间30 min、超声温度30℃、水浴温度60 ℃、水浴时间50min，考察料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）对原花青素提取效果的影响，见图6。
图6 料液比对原花青素提取率的影响
Fig.6 Effcect of solid-liquid ratio on the extraction rate of proanthocyanidins
如图6所示，原花青素提取效果随料液比的增加呈先增大后降低趋势，料液比为1∶40（g/mL）时提取率最高。随着溶剂含量上升，溶质不断从原料中析出，当料液比达到1∶40（g/mL）时，溶质析出呈最高水平，继续增加溶剂则使原料中各种杂质析出，使原花青素提取率下降，另外，原花青素含量一定时，溶剂体积增加使原花青素在溶液中浓度下降，使得提取率降低。因此，选择料液比为1∶40（g/mL）最佳。
2.3.5 超声温度对原花青素提取率的影响
称取1 g脱脂花生红衣粉末，固定料液比1∶40（g/mL）、乙醇体积分数60%、超声时间30 min、水浴温度60℃、水浴时间50 min，考察超声温度30、40、50、60、70℃对原花青素提取效果的影响，见图7。
如图7所示，原花青素提取率随温度变化趋势为先升高后降低，在40℃时达到最高。其原因可能是，温度升高，分子动能增大，原花青素快速大量溶出；温度过高，部分原花青素被破坏，使提取率降低。由此确定最佳超声温度为40℃。
图7 超声温度对原花青素提取率的影响
Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of proanthocyanidins
2.3.6 超声时间对原花青素提取率的影响
称取1 g脱脂花生红衣粉末，固定料液比1∶40（g/mL）、乙醇体积分数60%、超声温度40℃、水浴温度 60 ℃、水浴时间 50 min，考察超声时间 10、20、30、40、50 min对原花青素提取效果的影响，见图8。
图8 超声时间对原花青素提取率的影响
Fig.8 Effcect of ultrasonic time on the extraction rate of proanthocyanidins
如图8所示，原花青素提取率在超声时间为20min时达到最高，此时原花青素已基本提取完全。超声处理时间过长，可能导致原花青素结构被破坏，同时，原花青素长时间暴露空气中易受氧化，使提取率下降。且长时间超声处理，增加能耗，延长提取周期，增加提取成本，因此20 min为最佳超声时间。
2.2 正交试验优化提取工艺
在单因素试验的基础上，对料液比、乙醇体积分数、超声温度和超声时间4个因素进行四因素三水平正交试验。探究各因素对原花青素提取效果的影响情况，并对提取条件进行优化。正交试验结果如表2、表3所示。
如表3所示，F检验结果表明，4个因素对原花青素提取率的影响都不显著。究其原因可能是本例试验误差过大且误差自由度小（仅为2），使检验的灵敏度低，从而掩盖了考察因素的显著性。由于各因素对提取率的影响都不显著，因此不必再进行各因素水平间的多重比较。可直接进行直观分析。直观分析法又称极差分析方法，通过比较各因素水平极差的大小，确定各因素主、次地位及最佳水平，极差越大，对原花青素提取率的影响越大[24]。如表2所示，极差分析结果表明，在ABCD这4个因素中，影响主次为C＞D＞A＞B，说明超声时间（C因素）对原花青素提取率的影响最大，占影响因素43.38%，其次为乙醇体积分数（D因素），占影响因素28.68%，料液比（A因素）和超声温度（B因素）影响较少，分别占17.65%和10.29%。最优条件为 A3B1C1D2，即料液比为 1∶45（g/mL）、超声温度 35℃、超声时间15 min、乙醇体积分数60%。按照最优工艺条件进行验证试验，经过3次平行试验得到原花青素提取率平均值为9.07%。与正交试验最优组结果相比有所增加，因此所得最佳提取工艺具有参考价值。
表2 正交试验结果直观分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal test
试验号 A料液比 B超声温度C超声时间D乙醇体积分数原花青素提取率/%1 1 1 1 1 8.16 2 1 2 2 2 7.79 3 1 3 3 3 7.86 4 2 1 2 3 7.82 5 2 2 3 1 7.99 6 2 3 1 2 8.71 7 3 1 3 2 8.50 8 3 2 1 3 8.27 9 3 3 2 1 7.76 K1 23.81 24.48 25.14 23.91 -K2 24.52 24.05 23.37 25.00 -K3 24.53 24.33 24.35 23.95 -k1 7.94 8.16 8.38 7.97 -k2 8.17 8.02 7.79 8.33 -k3 8.18 8.11 8.12 7.98 -R 0.24 0.14 0.59 0.36 -最佳水平 A3 B1 C1 D2 -
表3 各因素结果方差分析
Table 3 Variance analysis of the results of various factors
注：F0.05（2.2）=19.00；-表示差异不显著，P＞0.05。
因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性A料液比 0.114 2 0.493 4.460 -B超声温度 0.032 2 0.138 4.460 -C超声时间 0.524 2 2.266 4.460 -D乙醇体积分数 0.255 2 1.103 4.460 -误差 0.93 8 -
3 结论
本研究在经过超声波辅助提取后，再利用水浴浸提进一步提高提取效果，并用正交试验对原花青素的提取工艺进行优化。综合单因素试验和正交试验结果，最终确定各因素对原花青素提取效果的影响主次依次为：超声时间＞乙醇体积分数＞料液比＞超声温度；最佳提取条件为：超声时间15 min、乙醇体积分数60%、料液比 1∶45（g/mL）、超声温度 35℃、水浴温度50℃、水浴时间50 min。在此条件下，原花青素最大提取率为9.07%，试验结果较单独使用超声提取或水浴浸提皆有所提高。本研究为花生红衣这一副产物高质化利用提供一定参考依据，具有较好的应用前景。
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