木犀草素（3′，4′，5，7-四羟基黄酮）是一种最为常见的天然黄酮类物质，广泛存在于多种植物中，如金银花、菊花、白毛夏枯草等天然药物和芹菜、甜椒、辣椒、落花生等蔬菜果实中[1]。作为一种天然的抗氧化剂，木犀草素具有多种显著的生物活性，如抗癌[2-6]、抗菌、抗炎[8-10]、保护心血管[11]、改善和治疗阿尔茨海默症[12-13]等，具有广泛的医药价值和应用前景。目前，国内多以白毛夏枯草等为原料生产木犀草素，价格高，收益率低。木犀草素化学结构如图1所示。
图1 木犀草素的化学结构
Fig.1 Chemical structure of luteolin
花生壳中富含木犀草素，是木犀草素的理想来源之一[14]。花生是一年生草本植物，是世界上重要的五大油料作物之一，其生产遍及世界各地[15]。我国是花生生产、消费和出口贸易最大的国家，每年花生壳的产量高达500万吨[16]。郑州市位于河南省中部，经济作物主要以花生为主，花生加工业每年产出大量的花生壳，仅有少量用作饲料或化工原料，其余大部分被用于燃料或当作废弃物处理，既严重污染环境，又造成资源的极大浪费。因此，开发利用花生壳中的有效成分木犀草素等天然黄酮类化合物，对于有效延长花生产业链，提高花生资源综合利用效益，具有重要的社会意义。
归纳近几年相关研究报道，提取花生壳中木犀草素的方法主要有水浴回流法[17]、有机溶剂提取法[18-19]、碱水提取法[20]，辅助方法主要有微波辅助提取技术[21]、超声辅助提取技术[22]、超临界流体萃取技术[23]及生物酶解技术[24]、离子液提取技术[25]等。传统的水浴回流法、有机溶剂提取法及碱水提取法等存在得率较低的问题，微波辅助法和超声波辅助法能耗和成本较高，酶提取法及离子液提取技术操作繁琐，不适于工业生产。
本文采用连续萃取法提取花生壳中的木犀草素，考察不同萃取剂、萃取剂体积分数、萃取剂用量、萃取温度及萃取时间等因素对木犀草素提取率的影响，考察石油醚脱脂预处理对提取的花生壳中木犀草素纯度的影响，采用高效液相色谱法对花生壳中木犀草素的提取率及产品纯度进行测定。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
木犀草素标准品（98%）：上海麦克林生化科技有限公司；花生壳：花生果产于河南省郑州市，手工剥壳，洗净后60℃干燥箱烘干，粉碎备用；甲醇：色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司。其它所用试剂均为分析纯。
萃取器：郑州市高等学校生药学名师技术技能工作室自制；RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；HJ-3型恒温磁力加热搅拌器：常州翔天实验仪器厂；SQP型分析天平：赛多利斯科学仪器有限公司；SHZ-D（III）循环水式多用真空泵：天津华鑫仪器厂；ZW-3型紫外分析仪：巩义市予华仪器有限责任公司；FW-100型药用植物粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；Agilent-1260型高效液相色谱仪、Zorbax SB型C18色谱柱（4.6 mm×4 250 mm，5 μm）：美国Agilent公司。
1.2 试验方法
称取100 g过40目筛的花生壳干粉于1 000 mL烧杯中，加入500 mL石油醚，搅拌密封放置24 h进行脱脂处理。过滤，石油醚回收，花生壳自然挥干24 h。将挥干后的花生壳置于萃取器中，加入2 000 mL 75%乙醇，在萃取器中加热回流，控制温度为80℃，连续提取2 h。立即切换另一个新的已经装好花生壳干粉的萃取器，开始新一轮的连续萃取。
提取完成后，旋蒸浓缩提取液至浸膏状，加入10倍体积的蒸馏水，静置后取沉淀，置于50℃恒温干燥箱烘干，得粗提物。然后依次加入适量的无水乙醇、丙酮，使其完全溶解，过滤，石油醚进行二次脱脂，脱脂完成后加入适量乙酸乙酯再次重结晶，干燥，得到木犀草素供试样品。
1.3 薄层层析（thin layer chromatography，TLC）鉴定
取适量木犀草素标准品、木犀草素供试品用无水乙醇溶解，以氯仿-甲醇-冰乙酸（9∶0.5∶0.5，体积比）的混合溶液为展开剂，置于紫外灯下（365 nm）检视。
1.4 高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）测定
1.4.1 溶液配制
标准品溶液：精密称取木犀草素标准品1.00 mg，取适量甲醇溶解，转移至1 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，超声混匀，得浓度为1 mg/mL木犀草素标准品溶液[26]。
供试品溶液：精密称取木犀草素供试品1.00 mg，取适量甲醇溶解，转移至1 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，超声混匀，得1 mg/mL的供试品溶液[26]。
1.4.2 色谱条件选择
色谱柱：Zorbax SB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.5%磷酸溶液（体积比，70∶30），流速：1 mL/min；进样量：10 μL；柱温：30 ℃；检测波长（λ）∶348 nm。
1.4.3 线性关系考察和花生壳中木犀草素含量测定
准确量取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 木犀草素标准品溶液于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按“1.4.2”色谱条件依次进样分析，平行测定5次，取平均值。以木犀草素标准品浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，建立回归方程。
对木犀草素供试品溶液进样测定，测定结果代入回归方程计算木犀草素的浓度，并按照下列公式计算木犀草素供试品纯度ω和木犀草素的提取率W。
式中：n为稀释倍数；c为供试品溶液的浓度，mg/mL；V为供试品溶液的体积，mL；m1为称取的木犀草素供试品质量，mg。
式中：m2为提取的木犀草素产品总质量，mg；m为试验称取的花生壳质量，g；ω为木犀草素供试品纯度，%。
1.4.4 精密度试验
对同一木犀草素标准品溶液重复进样8次，进样体积为20 μL，计算峰面积的相对标准偏差（rlative sandard deviation，RSD）。
1.4.5 稳定性试验
对同一木犀草素供试品溶液12 h内每隔1 h进样测定1次，进样体积为20 μL，计算峰面积的RSD。
1.4.6 重复性试验
对同一木犀草素供试品溶液重复进样5次，进样体积为20 μL，计算峰面积的RSD。
2 结果与分析
2.1 薄层层析鉴定结果
薄层层析鉴定结果如图2所示。
图2 TLC分析
Fig.2 TLC analysis
A.木犀草素供试品；B.木犀草素标准品。
在紫外灯检视下发现，标准品与供试品溶液在同一硅胶G薄层层析板相同位置显示相同颜色斑点。
2.2 木犀草素含量测定结果
2.2.1 线性关系试验
以色谱峰面积（Y）对木犀草素标准品浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y=29538X+380.98（r=0.9974），线性关系良好。在本试验的色谱条件下，木犀草素的保留效果较好，出峰时间约为3.8 min，分析时间较短，有利于快速分析。木犀草素标照品的HPLC图见图3，木犀草素供试品的HPLC图见图4。
图3 木犀草素标准品色谱图
Fig.3 Chromatogram of luteolin standard product
图4 木犀草素供试品色谱图
Fig.4 Chromatogram of luteolin test product
2.2.2 精密度试验、稳定性试验、重复性试验结果
精密度试验测得木犀草素的峰面积RSD为0.62%（n=8），表明仪器精密度良好；稳定性试验测得木犀草素的峰面积RSD为0.64%（n=12），表明木犀草素供试品溶液在12 h内具有良好的稳定性；重复性试验测得木犀草素的峰面积RSD为0.13%（n=5），表明该方法重现性良好，在测定过程中木犀草素供试品溶液能够保持稳定。
2.3 单因素试验结果
2.3.1 石油醚脱脂预处理对花生壳中木犀草素产品纯度的影响
固定料液比为1∶20（g/mL），萃取温度为80℃，萃取时间为2.0 h，考察石油醚脱脂预处理对花生壳提取物中木犀草素产品纯度的影响，试验结果如图5所示。
图5 石油醚脱脂预处理对花生壳中木犀草素纯度的影响
Fig.5 Effect of petroleum ether degreasing pretreatment on the purity of luteolin in peanut shells
结果显示，石油醚脱脂预处理后，花生壳提取物中木犀草素产品的纯度可达到67.86%，而未经石油醚脱脂预处理的花生壳提取物中木犀草素产品的纯度仅为10.05%。花生壳的主要成分是半纤维素和粗纤维素，另有粗蛋白、粗脂肪、糖类、黄酮类物质及矿物质成分等[27]。其中粗蛋白含量为4.8%～7.2%，粗脂肪含量为1.2%～1.8%[28]，主要是油脂类成分及脂肪烷烃类成分，如二十六烷酸-α-单甘油酯、十八烷酸-α-单甘油酯、十六烷酸-α-单甘油酯、正二十六碳酸乙酯、磷脂等。采用石油醚密封浸泡搅拌预处理可除去花生壳中大量的粗蛋白、粗脂肪、木犀草素苷等低极性杂质，从而提高木犀草素产品的纯度。
2.3.2 不同萃取剂对花生壳中木犀草素提取率的影响
采用石油醚对花生壳脱脂预处理24 h，固定料液比为1∶20（g/mL），萃取温度为80℃，萃取时间为2.0h，考察不同萃取剂对花生壳提取物中木犀草素提取率的影响。分别选用75%乙醇溶液、75%甲醇溶液、75%丙酮溶液、乙酸乙酯、0.2 mol/L NaOH溶液以及水作为萃取剂进行提取，试验结果如表1所示。
表1 不同萃取剂花生壳提取物中木犀草素的提取率和纯度
Table 1 Luteolin extraction rate and purity of peanut shell extracts with different extractants
萃取剂提取率/（mg/g）纯度/%75%乙醇溶液 0.32 67.86 75%甲醇溶液 0.29 60.45 75%丙酮溶液 0.31 75.10乙酸乙酯 0.20 42.52 0.2 mol/L NaOH溶液 0.25 51.92水0.39 13.89
从表1中可以看出，各萃取剂对花生壳中木犀草素提取率的影响顺序为：水＞75%乙醇溶液＞75%丙酮溶液＞75%甲醇溶液＞0.2 mol/L NaOH溶液＞乙酸乙酯，而提取物中木犀草素产品纯度大小为：75%丙酮溶液＞75%乙醇溶液＞75%甲醇溶液＞0.2 mol/L NaOH溶液＞乙酸乙酯＞水。而根据价格、性能、来源、对环境的影响等综合考虑，选择乙醇溶液作为萃取剂比较合适。
2.3.3 乙醇溶液体积分数对花生壳中木犀草素提取率的影响
采用石油醚对花生壳脱脂预处理24 h，固定料液比为1∶20（g/mL），萃取温度为 80℃，萃取时间为2.0h，考察乙醇溶液体积分数（45%、55%、65%、75%、85%、90%）对花生壳提取物中木犀草素提取率的影响，试验结果如图6所示。
图6 乙醇溶液体积分数对花生壳中木犀草素提取率的影响
Fig.6 Effect of ethanol solution volume fraction on extraction rate of luteolin from peanut shell
从图6中可以看出，当乙醇溶液体积分数低于75%时，花生壳中木犀草素提取率随乙醇溶液体积分数的增大而提高，而当乙醇溶液体积分数达到85%、90%时，木犀草素提取率呈缓慢下降趋势。这是由于木犀草素母核是由两个具有酚羟基的苯环通过一个成环的C3相互连接而成，是一种弱极性化合物，因此易溶于乙醇。同时木犀草素还是一种平面性较强的分子，各个分子间排列紧密，引力较大，故难溶于水。因此，根据相似相溶原理，木犀草素的溶解度随萃取剂中乙醇含量的升高而增大。但是，当乙醇含量过高，即超过75%时，导致萃取剂极性过低，也不利于木犀草素的提取。因此，当乙醇溶液体积分数为75%时，萃取效果较好。
2.3.4 料液比对花生壳中木犀草素提取率的影响
采用石油醚对花生壳脱脂预处理24 h，固定萃取温度为80℃，萃取时间为2.0 h，乙醇溶液体积分数为75%，考察料液比为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1：25、1∶30（g/mL）时对花生壳中木犀草素提取率的影响，试验结果如图7所示。
从图7可以看出，木犀草素提取率随萃取剂用量的增大而提高，在 1∶5（g/mL）～1∶20（g/mL）区间时，木犀草素的提取率增加较快，而当料液比大于1∶20（g/mL）时，木犀草素提取率的增加趋势比较缓慢。因此，选择料液比为 1∶20（g/mL）。
图7 料液比对花生壳中木犀草素提取率的影响
Fig.7 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of luteolin from peanut shell
2.3.5 萃取温度对花生壳中木犀草素提取率的影响
采用石油醚对花生壳脱脂预处理24 h，固定料液比为1∶20（g/mL），萃取时间为2.0 h，乙醇溶液体积分数为 75%，考察萃取温度（40、50、60、70、80、85、90 ℃）对花生壳中木犀草素提取率的影响，结果如图8所示。
图8 萃取温度对花生壳中木犀草素提取率的影响
Fig.8 Effect of extraction temperature on extraction rate of luteolin from peanut shell
从图8可以看出，萃取温度对花生壳中木犀草素提取率的影响很明显。当萃取温度低于80℃时，木犀草素提取率随温度的升高而增加，而当萃取温度高于80℃时，木犀草素提取率随温度的升高反而有所降低。这是由于在乙醇溶液提取木犀草素的过程中，温度既影响溶质在溶剂中的溶解速度，又影响溶质向外扩散的速度。另外，温度的升高也会提高木犀草素在萃取剂中的溶解度。但是由于木犀草素为黄酮类化合物，对热比较敏感，高温会加速其氧化，所以萃取温度也不是越高越好。当萃取温度为80℃左右时，萃取效果较好。
2.3.6 萃取时间对花生壳中木犀草素提取率的影响
采用石油醚对花生壳脱脂预处理24 h，固定料液比为1∶20（g/mL），萃取温度为80℃，乙醇溶液体积分数为 75%，考察萃取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）对花生壳提取物中木犀草素提取率的影响，结果如图9所示。
图9 萃取时间对花生壳中木犀草素提取率的影响
Fig.9 Effect of extraction time on extraction rate of luteolin from peanut shell
从图9可以看出，随着萃取时间的增加，花生壳中木犀草素的提取率也增加，但是当时间超过2.0 h时，木犀草素的提取率呈降低趋势。这是由于长时间的加热会造成木犀草素受热氧化，从而使得木犀草素提取率降低，因此，选择萃取时间为2.0 h效果较好。
3 结论
采用连续萃取法从花生壳中提取木犀草素，节省溶剂，操作简单，工艺流程短，提取率高，含杂质少，残渣少，耗能小，符合绿色环保、可持续发展原则，经济和社会效益显著，具有省工省时，便于工业化生产的优点。本试验结果表明，使用石油醚对花生壳进行脱脂预处理，以75%乙醇溶液为萃取剂，采用连续萃取法从花生壳中提取木犀草素，料液比为1∶20（g/mL），萃取温度为80℃，萃取时间为2.0 h时，提取率可达到0.32 mg/g，纯度可达到67.86%，可明显增加花生壳提取物中木犀草素的提取率。
花生壳资源的综合利用属于典型的低碳经济。郑州市花生种植面积大，产量高，花生壳资源丰富，价格低廉，但回收利用较少，造成自然资源的浪费及一定程度的环境污染。本研究旨在为花生壳中木犀草素的生产提供参考，使花生壳资源得到综合利用，同时也能获得良好的经济效益和社会效益，具有广阔的开发前景和重要的社会价值。
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