近年来火龙果（Hylocereus undulatus Britt）因其美丽的果形、鲜艳的色泽、独特的口感以及高营养、低热值等鲜明特色而产销两旺，深受欢迎[1-2]。同时围绕其开展的深加工品类也不断涌现，其中以红肉火龙果为原料而发酵制成的火龙果酒，更是因其较好地保留了其营养成分和天然、艳丽的紫红色泽，几乎成为果酒家族的“新宠”[3-4]。然而如何使其酒香如其色泽一样突出，真正彰显其果香和发酵香兼备的上乘品质，却是一个值得深入研究的课题。一般果酒发酵常采用发酵能力强的酿酒酵母菌种，但酿酒酵母一般产香能力有限，且因发酵旺盛易使果酒酒体单薄、风味欠佳。近年来非酿酒酵母在发酵果酒中广泛应用，因其对风味等感官特性的积极贡献而越来越受到重视[5]。Andorrá等[6]认为非酿酒酵母在果酒发酵中可以酶解释放香味物质和芳香化合物，有助于成品葡萄酒的感官更丰富完美。Philippe等[7]报道戴尔凯氏有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）在发酵中能生成更多的丙酸乙酯、异丁酸乙酯和二氢肉桂酸乙酯。MUÑOZ等[8]发现雪利酒陈酿过程中高级醇的生成量与酵母菌菌种有关，贝酵母F12酿造的雪利酒比用酿酒酵母G1酿造的高级醇含量低。Moreira等[9]发现与酿酒酵母单独发酵相比，季也蒙有孢汉逊酵母（Hanseniaspora guilliermondii）和葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）与酿酒酵母混合发酵能减少高级醇和重硫酸盐产量，增加乙酸异戊酯和乙酸乙酯的含量。总之非酿酒酵母参与的果酒发酵，不仅能增加果酒中的香味物质，而且对降低高级醇含量也有十分重要的意义。本课题组前期研制火龙果酒时发现其高级醇含量稍偏高，不利于酒体协调和清爽，本研究首次引入非酿酒酵母进行火龙果酒的混合发酵制备，探讨其与单菌种发酵的差异效果，同类研究未见报道。
通过前期筛选，发现一株产香能力较强的梅奇酵母（Metschnikowia agaves）P3-3在菠萝酒发酵改善香气方面效果不错[10]，本文拟选其与商业酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D254进行混合发酵，以期酿制出风味良好、高级醇含量低、色香味齐美的火龙果酒，为火龙果产业提质增效、延长产业链奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
火龙果（金都一号品系）：海南省东方市种植基地。
梅奇酵母（Metschnikowia agaves）P3-3：分离自番木瓜果皮，保存于海南大学食品科学与工程学院菌种保藏中心；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）D254：活性干酵母，购自上海杰兔工贸有限公司。
酵母浸出粉胨葡萄糖培养基：2.0%葡萄糖、1.0%酵母膏、0.5%蛋白胨，自然pH值，121℃灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
新世纪紫外-可见分光光度计（T6）：北京普析通用仪器有限公司；气相色谱仪（Agilent7890A）：安捷伦科技有限公司；pH 计（PB-10）、手持糖度仪（PAL-1）：广州市授科仪器科技有限公司；便携式密度计（DA-130N）：深圳埃科瑞仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 火龙果酒酿造基本工艺流程
火龙果→榨汁→酶解→成分调整→SO2处理→接种酵母菌→发酵→澄清、过滤、离心→分装→分析、感官评定
1.3.2 菌种活化和培养
非酿酒酵母P3-3：将斜面菌种接入酵母浸出粉胨葡萄糖培养基液体培养基、25℃振荡、活化培养24 h，连续二代、备用；酿酒酵母D254：按说明方法，将活性干酵母40℃活化培养30 min。为使后续方法一致，将其接入酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，然后同P3-3一样进行二代活化培养。
1.3.3 火龙果酒的制备工艺
火龙果原汁（pH 4.20、糖度 17.0°Birx）中首先添加60 mg/L焦亚硫酸钠溶液静置2 h，然后置40℃水浴中以果胶酶处理3 h使之酶解。以柠檬酸调整pH值至3.70±0.05，以市售白砂糖调整糖度至23°Birx左右。统一处理好的果汁原料以500 mL装液量分装到1L锥形瓶中备用。
1.3.4 两种酵母菌的接种比例
两种酵母菌接种比例见表1。
表1 两种酵母菌接种比例
Table1 Ratio of two yeast inoculations
注：每组均设置3组平行。
组别 接种比例 接种浓度（CFU/mL）P3-3 D254 D254组 0∶1 0 5×106 P3-3组 1∶0 5×106 0 CI-Ⅰ组 1∶1 5×106 5×106 CI-Ⅱ组 102∶1 5×106 5×104 CI-Ⅲ组 104∶1 5×106 5×102
1.3.5 火龙果酒常规理化分析
可溶性固形物测定：手持糖度计法；总酸含量测定：根据国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定[11]；酒精度测定：DA-130N便携式密度计法。
1.3.6 高级醇的测定
参考文献[12]进行。
1.3.7 挥发性香气成分测定
火龙果酒的挥发性成分分析，采用顶空固相微萃取（headspace-solid phase microextraction，HS-SPME）提取（发酵完成后存放30 d的样品），气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析。根据文献CHEN等[13]的方法测定，稍作修改。毛细管柱为 DB-wax（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），进样温度260 ℃；模式：不分流；流量：1 mL/min；柱温：40℃保持5 min，以5℃/min升至220℃，以20℃/min升至250℃，保持2.5 min；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃。
SPME的条件为萃取头：65 μm PDMS/DVB 1 cm；温度：50℃；时间：振荡15 min，萃取 30 min；振荡速度：250 r/min；解吸时间：5 min；GC 循环时间：45 min。样品中加入内标（2-甲基-3-庚酮）进样。
1.3.8 感官评定
参照标准GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[11]进行适当修改，如表2。
表2 火龙果酒感官评定标准
Table 2 Pitaya wine sensory evaluation standards
项目 评分标准 分值香气（35分） 火龙果果香，酒香浓郁幽雅果香酒香良好，尚愉悦火龙果香，酒香较少，但无异香31～35 21～30 11～20滋味（35分） 酒体丰满，有新鲜感，醇厚协调，舒服，爽口酒质柔软，酸甜爽口酒体协调，纯正无杂31～35 21～30 11～20色泽（10分） 深红色，悦目协调，有光泽红色，暗红色9～10 6～8澄清程度（5分）黄褐色，无光泽无悬浮，澄清透明有悬浮，酒体浑浊0～5 3～5 0～2
1.3.9 数据处理与分析
采用SPSS 17.0对试验数据进行差异显著性检验分析。用Simca-P13.0进行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）分析；采用绘图软件Origin 8.5进行绘图。
2 结果与分析
2.1 混合发酵对火龙果酒常规理化指标的影响
对梅奇酵母P3-3和酿酒酵母D254采用不同比例进行同时接种的混合发酵研究。发酵期间的常规理化指标见图1。
由图1可知，CI-Ⅰ组和D254单菌接种组的糖度和酒精度无明显差异，但CI-Ⅲ组和P3-3的pH值明显低于CI-Ⅰ组、CI-Ⅱ组和D254组。总酸在发酵8 d以后含量相对较高，但波动较大，说明该梅奇酵母产酸能力较强、特别是产有机酸（如醋酸类、多羧酸类等）能力较强，这与其后续风味特征也有关联性[10]。
图1 混合发酵体系中糖度、酒精度、总酸、pH值的变化趋势
Fig.1 Changes in brix，alcohol content，total acidity and pH value of pitaya wines during mixed fermentation
2.2 混合发酵对火龙果酒高级醇生成量的影响
高级醇类物质是构成果酒风味的一部分，但异丁醇和异戊醇类的高级醇含量过高时常常会有上头、头重之类的表现[14-15]。一般高级醇中正丙醇、异丁醇和异戊醇3种醇类可占总高级醇的90%[12]。3种高级醇含量见图2。
图2 混合发酵火龙果酒高级醇产生量比较
Fig.2 Comparison of higher alcohol production in pitaya wines by mixed fermentation
不同上标字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，P3-3发酵的正丙醇含量显著高于其它组别，混合发酵的3组之间无显著差异；CI-Ⅰ组的异丁醇含量最低为45.7 mg/L，显著低于其它组别；所有组的异戊醇含量无显著差异。总高级醇含量方面，CI-Ⅰ组和CI-Ⅱ组间无显著差异，但都显著低于其它组别。其中CI-Ⅰ组总高级醇含量比D254组降低11.9%，比P3-3组降低11.2%。显示两种酵母菌1∶1比例同时接种进行混合发酵的高级醇含量最低，说明非酿酒酵母参与的果酒发酵在控制高级醇含量方面具有积极作用。
2.3 感官评价
对发酵终止且陈酿一个月的火龙果酒，组织10人感官评定小组（4男6女）进行逐一感官评定，见图3。
图3 火龙果酒的感官评分
Fig.3 Sensory scores of pitaya wines
不同上标字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，CI-Ⅰ组感官评分最高，发酵的火龙果酒悦目协调、有浓郁的酒香，酒体丰满，具有典型性。
2.4 挥发性香气成分分析
香气是决定最终果酒产品风味和品质的重要因素[16]。通过固相微萃取-气相色谱-质谱（solid phase microextraction-gas chromatograph-mass spectrometry，SPMEGC-MS）对感官评分最高的CI-Ⅰ组的主要挥发性风味物质进行分析，结果见表3。CI-Ⅰ组、D254组、P3-3组分别检测出118、111、116种挥发性物质，显示CI-Ⅰ组具有较好的挥发性物质丰度。
表3 火龙果酒中的主要挥发性物质
Table 3 The main volatile compounds in pitaya wines
images/BZ_67_1581_984_2268_1006.png化合物名称P3-3 D254 CI-Ⅰ相对含量/%含量/（ng/mL）相对含量/%含量/（ng/mL）相对含量/%酸酯丁酸乙酸2-甲基丙酸壬酸2-甲基-丁酸3-甲基-丁酸己酸辛酸异丁酸乙酯乙酸异丁酯丁酸乙酯乙酸异戊酯戊酸乙酯己酸乙酯庚酸乙酯辛酸甲酯己酸丁酯辛酸乙酯丙二酸二乙酯己酸己酯癸酸乙酯苯甲酸乙酯丁二酸二乙酯苯乙酸乙酯十二酸乙酯苯丙酸乙酯十四烷酸乙酯含量/（ng/mL）0.04 21.95 0.00 0.00 0.05 20.59 0.85 517.16 1.27 753.98 1.16 525.87 0.10 61.19 0.10 60.03 0.08 38.09 0.05 26.97 0.01 2.45 0.03 12.25 0.06 37.55 0.06 35.05 0.08 35.51 0.19 112.39 0.17 102.27 0.16 70.37 0.95 576.14 0.78 461.11 0.92 416.41 2.37 1 437.09 1.81 1 074.15 1.85 834.36 0.00 0.00 0.00 0.00 0.01 0.60 0.03 15.37 0.01 6.46 0.02 7.98 0.04 21.74 0.02 13.55 0.04 17.19 0.00 0.00 0.26 151.12 0.33 151.07 0.01 1.13 0.00 0.29 0.01 3.26 1.45 879.85 1.19 702.85 1.63 738.61 0.02 12.93 0.02 11.45 0.05 23.98 0.01 7.38 0.01 6.00 0.01 4.91 0.00 0.15 0.00 0.00 0.01 3.30 3.95 2 393.44 3.73 2 206.59 4.00 1 808.09 0.01 8.67 0.02 10.19 0.02 8.22 0.01 2.42 0.01 0.76 0.02 7.38 2.55 1 544.83 3.05 1 808.68 4.05 1 832.55 0.04 25.48 0.03 17.48 0.06 27.47 1.31 793.61 1.57 929.13 1.58 716.65 0.51 305.98 0.55 324.43 0.61 273.80 0.66 401.75 0.67 398.20 0.60 270.11 0.01 3.14 0.01 1.65 0.01 5.78 0.21 124.59 0.21 126.29 0.19 85.36十六酸乙酯内0.36 217.12 0.38 223.03 0.31 137.86酯 α-甲基-γ-丁内酯0.02 12.17 0.01 1.15 0.01 1.32丁内酯 0.05 30.63 0.05 29.54 0.04 19.42 5-正内酯 0.02 9.87 0.01 4.15 0.01 1.89醛和酮己醛 0.01 0.91 0.01 1.43 0.01 0.89 2-庚酮 0.01 2.13 0.01 3.51 0.01 2.39 6-甲基-5-庚-2-酮0.02 9.40 0.02 9.53 0.03 11.25 2-壬酮 0.03 18.97 0.04 20.62 0.05 24.31壬醛 0.02 10.60 0.02 13.69 0.02 7.86糠醛 0.04 25.05 0.03 14.73 0.25 114.39苯甲醛 0.05 29.22 0.05 28.83 0.11 50.20
续表3 火龙果酒中的主要挥发性物质
Continue table 3 The main volatile compounds in pitaya wines
化合物名称P3-3 D254 CI-Ⅰ相对含量/%images/BZ_68_705_451_718_473.png含量/（ng/mL）相对含量/%含量/（ng/mL）images/BZ_68_933_451_946_473.png相对含量/%醇酚 硫化物 其它甲基丁烯醇异丁醇丁醇异戊醇正戊醇2-庚醇己醇庚醇2-乙基-1-己醇2-壬醇壬醇香茅醇香叶醇苯甲醇苯乙醇4-乙基-2-甲氧基苯酚2,4-二叔丁基苯酚3-甲硫基丙醇含量/（ng/mL）0.01 5.12 0.01 3.88 0.01 5.80 1.72 1 040.36 1.60 949.66 1.49 673.64 0.11 67.73 0.11 64.19 0.11 51.54 16.02 9 702.64 16.77 9 930.49 15.90 7 190.70 0.01 6.13 0.02 13.93 0.02 10.55 0.04 24.52 0.10 59.74 0.04 18.08 1.94 1 174.02 1.83 1 085.82 1.45 657.60 0.06 37.49 0.10 60.71 0.10 44.71 0.05 29.68 0.16 93.92 0.05 22.89 0.10 59.23 0.12 72.75 0.11 51.08 0.08 48.43 0.14 84.29 0.11 51.35 0.18 107.01 0.20 119.60 0.19 86.44 0.03 20.60 0.04 22.83 0.04 16.82 0.03 18.71 0.00 0.00 0.00 0.00 17.1310 372.6816.9610 044.6615.08 6 822.92 0.28 169.82 0.13 78.34 0.09 42.02 4.71 2 849.40 4.89 2 896.65 4.65 2 104.30 0.03 20.59 0.04 22.52 0.03 12.99萜烯和萜类化合物芳樟醇苯乙烯去甲安定2-苯-2-丁烯0.05 27.38 0.05 32.01 0.05 20.80 0.01 6.30 0.05 30.47 0.01 0.99 0.03 17.75 0.03 16.95 0.03 14.00 0.10 59.28 0.11 63.58 0.10 46.20
火龙果酒中挥发性物质相对含量的比较图见图4。
由图4可知，酯类在CI-Ⅰ组中相对含量为17.1%，P3-3组为15.03%，D254组为15.12%，表明CI-Ⅰ组酯类相对含量最高。酯类种类方面，混合发酵CI-Ⅰ组生成更多种类的酯类风味物质，拥有D254组和P3-3组特有的酯类物质（如异丁酸乙酯和乙酸异戊酯），产生较低的可以释放不愉快的蜡味物质（十六酸乙酯）和醚味物质（十四烷酸乙酯）。产生水果味的酯类含量最高，主要有异丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯丙酸乙酯等。这可能是由于非酿酒酵母P3-3具有β-葡萄糖苷酶活力，可以水解糖苷键释放香味物质为火龙果酒增香。这与Clemente-Jimenez等[17]、Hu 等[18]和 Sun 等[19]的研究结果一致。
图4 火龙果酒中挥发性物质相对含量的比较
Fig.4 Comparison of volatile compounds in pitaya wines
不同上标字母表示差异显著（P＜0.05）。
火龙果酒中挥发性酸的含量和数量均低于醇类和酯类，代表性物质为辛酸和乙酸。CI-Ⅰ组、D254组、P3-3组挥发性酸相对含量分别为4.57%、4.42%、4.86%，无明显差异。CI-Ⅰ组的醇类物质相对含量和D254组无明显差异，但P3-3醇类含量和相对含量较低，这可能是由于非酿酒酵母产醇能力弱而导致。挥发性酚对果酒的香气和风味产生不利影响[20]，混合发酵CI-Ⅰ组含有较低的4-乙基-2-甲氧基苯酚和2，4-二叔丁基苯酚等挥发性酚类物质，对火龙果酒的风味具有积极的作用。
2.5 主成分分析（principal component analysis，PCA）
对3个组别的挥发性成分进行主成分分析，共获得2个主成分，混合发酵火龙果酒PCA得分图见图5。
图5 混合发酵火龙果酒PCA得分图
Fig.5 PCA score chart of pitaya wines by mixed fermentation
为获得导致这种显著差异的代谢物信息，进一步采用最小二乘方判别分析（PLS-DA）对两组样本进行统计分析。PLS-DA得分图见图6。
图6 混合发酵火龙果酒PLS-DA得分图
Fig.6 PLS-DA score chart of pitaya wines
进一步采用有监督式方法OPLS-DA进行建模分析，结果得到2个主成分和1个正交成分。OPLS-DA得分图如图7所示。
图7 混合发酵火龙果酒OPLS-DA得分图
Fig.7 OPLS-DA score chart of pitaya wines by mixed fermentation
各组发酵的火龙果酒均处于置信区间内，3组样本均有明显的样本聚集区，且组间的差异显著大于组内差异，表明单菌发酵和混合发酵之间挥发性成分差异显著。进一步采用最小二乘方判别分析（PLS-DA）对两组样本进行统计分析，并采用OPLS-DA模型的VIP（VIP scores>1）值，并结合 t-test的 P 值（P<0.05）来寻找得到主要差异性表达代谢物主要有：壬酸、己酸、2，4-二羟基苯甲酸、苯丙酸乙酯、辛酸异戊酯、十一酸乙酯、苯甲酸乙酯、己酸己酯、2-癸醇、2-庚醇、壬醛。
3 结论
采用同时接种M.agaves P3-3与S.cerevisiae D254的方式混合发酵酿造火龙果酒，研究了混合发酵方式对火龙果酒高级醇含量和挥发性物质的影响。各组常规理化指标显示无明显差异，混合接种火龙果汁且菌种比例为1∶1时，可以明显降低火龙果酒中高级醇含量，含量为183.10 mg/L，分别比D254、P3-3单菌发酵组降低11.9%、11.2%。CI-Ⅰ组感官评分最高，为88.9分。SPME-GC-MS结果显示：CI-Ⅰ组、D254组、P3-3组分别检测出118、111、116种挥发性物质，其中CI-Ⅰ组产生水果味酯类含量最高，酯类相对含量占比最高为17.1%，酯类种类最多，含有较低物质浓度的挥发性酚类物质。可见，同时接种M.agaves P3-3与S.cerevisiae D254且接种比例为1∶1的方式能降低火龙果酒的高级醇含量，增加香气物质种类并减少不愉快气味的产生，使得火龙果酒悦目协调、酒体丰满，具有典型性。对CI-Ⅰ组、D254组、P3-3组的挥发性物质进行差异分析，差异代谢物主要是酯类物质。
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