桂花（Osmanthus fragrans）属于木犀科木犀属植物[1]，桂花子性温，椭圆形，成熟后果皮为紫黑色[2]，近年来，学者开始关注桂花子的化学成分[3]，尹伟等从其醇提溶液的乙酸乙酯萃取部分分离并鉴定出23个化合物[4]，唐伟卓等[5]从金桂种子醇提取物中分离出12个化合物，并对桂花种子脂肪酸成分进行分析，赵彩屹等从桂花果油脂中鉴定出9种脂肪酸，不饱和脂肪酸含量高达83.25%[3]，刘东阳从桂花子中提取分离出环烯醚萜苷[2]，甘典华对桂花果皮黑色素进行了研究[6]。综合前人研究，桂花子中含有黄酮类、多糖类、萜类、色素、脂肪酸等[4-10]化学成分。药理活性表明，桂花子具有抗炎镇痛、抗抑郁、抑制血小板聚集等药理作用[11-14]。
黄酮类化合物是两个苯环通过中央三碳链连接的一系列化合物[15]，多糖是一类重要的天然大分子物质[16]，黄酮类和多糖类化合物因具有抗氧化性、抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性[17]而备受关注，多种黄酮类化合物表现出较好的抗菌活性[18]。
我国拥有大量的桂花资源，目前主要是对桂花进行开发，对桂花子则未加以利用，对桂花子中化学成分的抗氧化活性和抑菌活性研究甚少，造成了资源浪费和部分污染。本研究从桂花子中提取黄酮类化合物和多糖类化合物，并进行抗氧化活性和抑菌活性的评价，以期为桂花子提取物的保健功能应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桂花子：采自曲靖师范学院校内（2018年）；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌：上海鲁微科技有限公司；芦丁标准品（纯度99%）：南京奥多福尼生物科技有限公司；DPPH、ABTS：sigma公司；硝酸铝、无水乙醇、抗坏血酸、过硫酸钾、H2O2、氢氧化钠、亚硝酸钠、苯甲酸钠、正丁醇、石油醚、硫酸亚铁、水杨酸、甲醇、氯仿（分析纯）：天津试剂公司三厂。
牛肉膏蛋白胨：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂25g，水1 000 mL，pH7.4～7.6，121℃高压灭菌30 min。
LB液体培养基：25 g LB肉汤，加入1 000 mL蒸馏水，加热搅拌至完全溶解，121℃高压灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
TU-1810紫外可见分光光度计：上海昂拉仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：上海析达仪器有限公司；DHG-9245电热鼓风干燥箱：上海微川精密仪器有限公司；WK-600A小型高速粉碎机：成都市天一元机械设备有限公司；NSKY-100C恒温培养振荡器：上海苏坤实业有限公司；RE-52旋转蒸发仪：西安远舰仪器设备有限公司；GNP-9160恒温培养箱：常州普天仪器制造有限公司；YXQ-LS-75G立式高压蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
1.3 试验方法
1.3.1 桂花子的脱色处理
桂花子在50℃下烘干，粉碎后过60目筛，用石油醚索氏回流脱色处理至无色，温度为50℃，时间6 h左右。
1.3.2 桂花子黄酮的提取与测定
取脱色后的桂花子，以60%乙醇为溶剂，在料液比为 1∶55（g/mL），85 ℃条件下提取 4.5 h，旋转蒸发回收乙醇得粗提物[19]。以甲醇溶解粗提物，减压回收甲醇，得桂花子黄酮样液，待测定。参照文献方法[20]绘制芦丁标准曲线，线性回归方程为y=0.263 4x-0.002 8，相关系数R2=0.999 8，在试验范围内呈现良好的线性关系，经测定桂花子黄酮样液浓度为10.87 mg/mL。
1.3.3 桂花子多糖的提取与测定
取脱色后的桂花子，以蒸馏水为溶剂，在料液比为1∶30（g/mL），温度为 70℃的条件下回流提取 3.5 h，减压抽滤得多糖粗提液。Sevag法去蛋白[21]，将除过蛋白的多糖溶液旋蒸后量取体积，加入3倍体积的无水乙醇，冷藏过夜。5000r/min条件下离心15min，少量蒸馏水溶解沉淀，得桂花子水提物多糖，待测定。参照文献[9]方法绘制葡萄糖标准曲线，线性回归方程为y=6.266 7x+0.0127，R2=0.999 3，在试验范围内呈现良好的线性关系，经测定桂花子多糖样液浓度为1.95 mg/mL。
1.3.4 抗氧化活性
1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的测定
参考文献方法稍作改动：准备若干支洁净干燥的25 mL比色管，将2.5 mL的0.004%DPPH甲醇溶液，分别加入到1.5 mL不同浓度的VC甲醇样品溶液、黄酮甲醇样品溶液、多糖蒸馏水样品溶液，于28℃恒温水浴30 min，515 nm快速测定吸光度，蒸馏水作空白，每支试管做3次平行。
DPPH 自由基清除率/%=（1-A1/A0）×100
式中：A0为空白组的吸光度；A1为加入样品溶液的吸光度。
1.3.4.2 羟自由基清除能力的测定
参考文献[22]方法稍作改动：取25 mL比色管若干，依次加入9 mmol/L硫酸亚铁溶液1.0 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.0 mL、1.5 mL不同浓度的VC甲醇样品溶液、黄酮甲醇样品溶液、多糖蒸馏水样品溶液，空白组用蒸馏水代替，加入8.8 mmol/L过氧化氢溶液1.0 mL启动反应，蒸馏水补足反应总体积为15 mL，混匀后将试管迅速移入37℃水浴锅中，静置30 min后于510 nm波长下测定不同浓度样品液的吸光度。由于样品本身具有吸光度，测定时用蒸馏水代替过氧化氢溶液。
羟自由基清除率/%=1-（A1-A2）/A0×100
式中：A0为空白组的吸光度；A1为加入样品溶液后的吸光度；A2为用蒸馏水代替H2O2后的吸光度。
1.3.4.3 ABTS+自由基清除能力的测定
参考文献方法[23]稍作改动：7.4 mmol/L的ABTS溶液和2.6 mmol/L的K2S2O8溶液等体积混合，25℃～28℃条件下黑暗处放置12 h～16 h，然后用甲醇稀释40倍～50倍，测量 A734=0.7±0.02，得 ABTS 工作液。25 mL比色管中依次加入3mL工作液、1mL无水乙醇，振荡10s充分混合，静置6 min在734 nm处测得A0。取3 mL工作液加入比色管后再加入1mL不同浓度的样品溶液，振荡10 s充分混合，静置6 min在734 nm下测得A1。
ABTS+自由基清除率/%=（A0-A1）/A0×100
式中：A0为空白组的吸光度；A1为加入样品溶液后的吸光度。
1.3.5 抑菌活性测定
经预试验后，结果表明桂花子多糖对3种试验菌没有抑菌效果，因此研究的为桂花子黄酮的抑菌活性。
供试菌种的活化及菌悬液的制备：参照文献[24]的方法使供试菌种活化，菌悬液浓度约为106CFU/mL～107CFU/mL。
抑菌试验-牛津杯法：参照文献[24]的牛津杯法，用无菌水作空白对照，每一个孔中注入300 μL黄酮样液，37℃下培养24 h后测量抑菌圈直径，取平均值。直径大于0.9 cm抑菌圈为有显著抑菌效果，小于0.6 cm为无抑菌效果，抑菌圈直径在0.6 cm～0.9 cm之间为有一定抑菌作用。研究不同浓度的桂花子黄酮及pH值对其抑菌效果的影响。
最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）-二倍稀释法[24]：参照文献的二倍稀释法，试管中分别加入 0、0.25、0.5、1、2、4 mg/L 不同浓度的桂花子黄酮溶液1 mL，对应试验菌0.1 mL，于30℃培养箱内培养24 h后，以完全无菌生长的最高稀释度为最低抑菌浓度（MIC），研究桂花子黄酮的抑菌作用。
2 结果与分析
2.1 抗氧化活性
2.1.1 DPPH自由基清除能力的测定结果
以VC作对照，不同浓度桂花子黄酮和多糖对DPPH自由基清除效果如图1所示。
由图1可知，不同质量浓度桂花子多糖和黄酮对DPPH自由基的清除效果均随着质量浓度的增加而增强，说明桂花子黄酮和多糖作为自由基清除剂与DPPH自由基发生了反应。结果表明，当质量浓度为0.08、0.10 mg/mL时，黄酮对DPPH自由基清除效果与同浓度的VC相当；多糖对DPPH自由基清除效果较弱，最高清除率为55.8%。综上，对DPPH自由基的清除能力顺序为：VC>黄酮>多糖，桂花子黄酮和多糖提取物都有一定的DPPH自由基清除能力，桂花子黄酮较多糖对DPPH自由基有更强的清除能力。
图1 对DPPH自由基的清除效果
Fig.1 Results of DPPH scavenging free radical activity
2.1.2 羟自由基清除能力的测定结果
对羟自由基的清除效果见图2。
图2 对羟自由基的清除效果
Fig.2 Results of OH scavenging free radical activity
由图2可知，桂花子多糖和黄酮提取物对羟自由基的清除能力均随样品质量浓度的增大先增大后趋于平缓。多糖质量浓度为0.25 mg/mL～1.0 mg/mL时，多糖溶液对羟自由基清除率为17.9%～48.5%，黄酮质量浓度为0.25 mg/mL～1.0 mg/mL，黄酮溶液对羟自由基清除率为22.7%～40.3%。结果表明，当黄酮和多糖质量浓度在0.5 mg/mL以下时，黄酮和多糖对羟自由基的清除率与VC比较接近，当质量浓度大于0.5 mg/mL后，黄酮和多糖对羟自由基的清除率与VC相差较多，原因是高浓度时，黄酮、多糖对羟自由基的捕捉能力远不如VC。清除能力顺序为：VC>多糖>黄酮，桂花子黄酮和多糖对羟自由基有一定的清除能力。
2.1.3 ABTS+自由基清除能力的测定
以VC作对照，不同浓度桂花子黄酮和多糖对ABTS+自由基清除效果如图3所示。
图3 对ABTS+自由基的清除效果
Fig.3 Results of ABTS+scavenging free radical activity
由图3可知，不同浓度桂花子多糖和黄酮质量浓度对ABTS+自由基的清除效果均随着质量浓度的增加而增强。对ABTS+自由基的清除能力顺序为：VC>黄酮>多糖，多糖溶液、黄酮溶液、VC对ABTS+自由基最高清除率为77.9%、93.4%、98.3%，黄酮和VC对ABTS+自由基的清除能力比较接近，是由于VC和黄酮对ABTS+自由基的捕捉能力接近。多糖对ABTS+自由基清除能力强于对DPPH自由基的清除能力，最高清除率为77.3%。因此说明桂花子黄酮和多糖对ABTS+自由基有较强的清除能力。
2.2 抑菌活性
2.2.1 黄酮浓度对抑菌效果的影响
不同浓度桂花子黄酮的抑菌效果如图4所示。
图4 黄酮浓度对抑菌效果的影响
Fig.4 Effect of flavonoid concentration on antibacterial effect
由图4可知，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性随着黄酮质量浓度的增加而增强，黄酮质量浓度为0.68 mg/mL～2.72 mg/mL时，不同浓度黄酮溶液对3种菌的抑菌效果明显上升，黄酮质量浓度为2.72 mg/mL～10.87 mg/mL时，不同浓度黄酮溶液对3种菌的抑菌效果逐渐趋于平缓，黄酮质量浓度在0.68 mg/mL～10.87 mg/mL时，对大肠杆菌的抑菌圈直径在0.99 cm～1.22 cm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在0.9 cm～1.27 cm，对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径在0.92 cm～1.35 cm。结果表明，桂花子黄酮对3种菌有显著的抑菌效果。
2.2.2 pH值对抑菌效果的影响
将10.87 mg/mL的黄酮溶液，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH调pH值，不同pH值黄酮溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的抑菌活性如图5所示。
图5 pH值对抑菌效果的影响
Fig.5 Effect of pH on antibacterial effect
由图5可知，当黄酮溶液pH值在4～8范围内变化时，对3种菌的抑菌圈直径先增大后减小，金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径在pH值为5时达到最大，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径在pH值为6时达到最大，试验结果表明，不同pH值的黄酮溶液对试验菌的抑菌活性不同，且pH值越小，溶液越偏酸性，抑菌效果越好，抑菌圈直径越大。原因一方面可能是pH值增大会破坏桂花子黄酮的结构，另一方面可能是pH值增大会影响菌株的生长，因此酸性条件有利于黄酮的抑菌活性。
2.2.3 桂花子黄酮对试验菌的最低抑菌浓度（MIC）
最低抑菌浓度的测定结果见表1。
表1 最低抑菌浓度的测定结果
Table 1 Results of determination of minimum inhibitory concentration
样液MIC/（mg/mL）金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 枯草芽孢杆菌10.87 mg/mL黄酮溶液0.5 0.5 0.25苯甲酸钠 0.625 0.625 1.25
由表1可知，桂花子黄酮溶液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌均具有较好的抑菌效果。以无菌水作为其空白，苯甲酸钠为阳性对照，桂花子黄酮的抑制作用表现为：对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.5 mg/mL，低于苯甲酸钠的最低抑菌浓度0.625 mg/mL；对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度为0.25 mg/mL，明显低于苯甲酸钠的最低抑菌浓度1.25 mg/mL。综上可知：桂花子黄酮溶液的抑菌活性优于苯甲酸钠，具有成为新型天然防腐剂的潜力。
3 结论
本研究从烘干粉碎脱色后的成熟桂花子提取黄酮类化合物和多糖类化合物，研究了桂花子黄酮和多糖的体外抗氧化活性，采用抑菌圈法和最低抑菌浓度法研究桂花子黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及枯草芽孢杆菌的抑菌活性。桂花子黄酮对DPPH自由基有较强的清除能力，多糖对DPPH自由基清除效果较弱；桂花子黄酮和多糖对羟自由基有一定的清除能力，但清除能力不如对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力；桂花子黄酮和多糖对ABTS+自由基有较强的清除能力。桂花子黄酮对3种自由基的清除能力优于多糖。抑菌试验结果表明，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性随着黄酮质量浓度的增加而增强，在同一黄酮浓度，桂花子黄酮对3种菌的抑菌效果比较接近。桂花子黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度低于苯甲酸钠的最低抑菌浓度，对枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度明显低于苯甲酸钠的最低抑菌浓度。抗氧化活性和抑菌活性的评价为桂花子提取物保健功能的应用提供了依据。
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