金针菇源维生素D2复合片剂对去卵巢骨质疏松大鼠血清生化指标、骨及脏器影响

胡代花1，2，杨旭1，陈旺1，冯自立1，张嘉昕1，李翠丽1，隋香菊1，祁珊珊1*，雒志恒1

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院维生素D生理与应用研究所，陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723000；2.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100）

摘 要：为探讨金针菇源维生素D（2vitamin D2，）复合片剂对去卵巢骨质疏松大鼠血清生化指标、骨及脏器影响，采用双侧卵巢切除术建立绝经后骨质疏松大鼠模型，将SD大鼠分成假手术组（Sham组）、去卵巢组（OVX组）、OVX+市售组（OVX+组）、OVX+金针菇源复合片剂组（OVX+MVHP组），连续16周隔天灌胃给药。给药结束后采集动物血清，检测血清钙、磷、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，StrACP）等生化指标，取心、肝、脾、肾、子宫等计算脏器指数，采集子宫和股骨、胫骨组织标本，制备组织切片，进行苏木精-伊红染色，运用病理图像分析系统进行观察和检测。结果表明，与OVX组相比，OVX+MVHP组血清钙浓度显著升高（p<0.05），AKP浓度显著降低（p<0.05），而血清磷和StrACP浓度无显著差异（p>0.05），心、肝、肾、子宫等脏器指数差异显著（p<0.05），而脾脏无显著差异（p>0.05）；子宫管径厚度和子宫黏膜上皮厚度显著升高（p<0.05），子宫腔径厚度显著降低（p<0.05），股骨和胫骨骨小梁致密，小梁间距和骨髓腔变小。初步表明金针菇源复合片剂可一定程度预防绝经后骨质疏松症的发生。

关键词：绝经后骨质疏松症；维生素D2；食用菌；骨组织；形态计量学；组织病理学

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种全身性骨骼疾病，主要特征为低骨量和骨组织的微细结构退变，易导致骨脆性增加和骨折的发生。妇女绝经后因卵巢功能衰退，血液及组织内的雌激素水平大幅降低，破骨细胞活跃程度增强，骨转化率加快，骨吸收大于骨形成，引发绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）。统计数据显示，PMOP发病率高达60%～70%，严重威胁患者的健康和生活质量[1-3]。

维生素D2（VD2）作为维生素D家族的重要一员，与维生素D3（VD3）具有相近的生物功能，均能调节钙磷的代谢，促进骨骼的健康，在临床上用于预防和治疗佝偻病、骨质软化、骨质疏松等疾病[4-6]。人体自身不能合成VD2，需通过食物补充。高营养价值的食用菌中不含VD2或含量极低，但却含有较高的VD2前体——麦角甾醇[7-8]。在紫外照射下，食用菌中麦角甾醇发生B环开环生成VD2前体，再经1，7-氢迁移和重排周环反应生成VD2。食用菌通过紫外辐照处理，其VD2含量大幅度提高[10-18]，可作为补充VD的食品及药品的重要天然原料。关于高含量VD2食用菌的体内生物利用率，文献多对正常大鼠或缺乏VD人群补充不同剂量的紫外照射食用菌，从血清Ca2+浓度、25-羟基-VD2含量、甲状旁腺激素表达水平、股骨密度、胫骨厚度、Ca2+转运基因在十二指肠和肾脏中的表达等指标进行研究，结果表明通过紫外照射提高VD2含量的食用菌具有较好的生物利用度[19-24]，但有关其对骨质疏松症的预防和治疗效果尚未见研究报道。

为了进一步明确高含量VD2食用菌对骨质疏松症的预防和治疗效果，本文以去双侧卵巢骨质疏松大鼠为模型，以所研制的金针菇源VD2复合片剂为材料，比较大鼠血清钙、磷、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，StrACP）等生化指标及脏器指数、子宫和骨组织等形态病理学指标变化，旨在为食用菌源VD2产品的研发及高值化应用，以及绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供理论依据和重要参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Nikon Ti倒置荧光显微镜：尼康光学仪器有限公司；BIOTEK EPOCH酶标仪：美国博腾仪器有限公司；1200紫外分光光度计：岛津仪器有限公司；RM2235石蜡组织切片机：莱卡显微系统有限公司；YT-7C摊烤片机：孝感市亚光医用电子技术公司；5424型低速离心机：德国Eppendorf有限公司；ZNCL-BS磁力搅拌器：常州梅香仪器有限公司；BSA224S-CW电子天平：赛多利斯仪器有限公司；DHP-200电热恒温培养箱：河北大宏实验仪器有限公司。

VD2滴丸：国药控股星鲨制药有限公司；金针菇源VD2复合片剂：陕西理工大学维生素D生理与应用研究所自制；微板法钙试剂盒、磷钼酸法磷测试盒、碱性磷酸酶试剂盒、抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物

健康雌性3月龄未孕SD大鼠24只，由西安交通大学实验动物中心提供，体重210 g～258 g，分笼饲养，自由饮水，适应性饲养1周后进行实验。

1.3 双侧卵巢去除手术

将24只SD大鼠分为假手术组（Sham组）和去卵巢组（OVX组），其中Sham组6只，OVX组18只。OVX组大鼠参考文献方法实施卵巢去除手术[25-26]。Sham组大鼠实施假手术，术后1周对OVX组大鼠进行阴道涂片，连续5 d，观察去卵巢组不出现动情周期，表明卵巢去除成功。

1.4 动物分组及给药

手术后1周，对OVX组进行分组，分别是OVX+市售 VD2组（OVX+VD2组）、OVX+金针菇源 VD2复合片剂组（OVX+MVHP组）和OVX组，每组6只。其中Sham组每只大鼠每次灌胃1 mL纯花生油；OVX组每只大鼠每次灌胃1 mL纯花生油；OVX+VD2组每只大鼠每次灌胃含市售VD2滴剂的花生油（15 IU/mL）1 mL；OVX+MVHP组每只大鼠每次灌胃含金针菇源VD2复合片剂的花生油（15 IU/mL）1 mL。隔天灌胃，持续给药16周。

1.5 脏器指数测定

连续给药16周后将大鼠处死并称重，打开大鼠腹腔，取出大鼠心脏、肝、脾、肾和子宫等脏器分别进行称重，计算各脏器指数。脏器指数=脏器湿重/大鼠体重。

1.6 血清生化指标测定

连续给药16周后采集大鼠眼眶静脉血，4000r/min离心10 min，分离血清，-20℃冰箱保存备用。血清钙含量、血清磷含量、血清碱性磷酸酶活性、抗酒石酸酸性磷酸酶活性测定参考试剂盒方法进行。

1.7 骨组织样品采集及病理学分析

连续给药16周后处死动物，取其左侧胫骨和股骨，3.7%多聚甲醛4℃固定24 h，磷酸盐缓冲液漂洗，10%乙二胺四乙酸（pH 8.0）4℃，脱钙21 d。将脱钙标本以磷酸盐缓冲液充分漂洗，依次脱水、透明、浸蜡、包埋、石蜡切片（5 μm），苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）。显微镜观察各组大鼠骨组织形态[26]。

1.8 子宫病理组织形态学观察和形态计量学检测

取各组大鼠右侧子宫角组织，依次脱水、透明、浸蜡、包埋、石蜡切片（5 μm），HE 染色。光学显微镜 4×10倍镜下观察子宫管径厚度，10×10倍镜下观察子宫固有层腺体数量，40×10倍镜下观察子宫黏膜上皮厚度，并分别随机选择5个视野拍照保存，应用Image Pro Plus软件对子宫管径厚度、子宫黏膜上皮厚度进行形态计量学测定[26]。

1.9 数据处理与分析

试验结果均以“平均数±标准差”表示，试验数据采用SPSS 22.0软件进行统计分析，采用Tukey’s HSD进行方差分析（p<0.05）。

2 结果与分析

2.1 血清钙和磷含量测定结果

各实验组大鼠血清钙和磷含量测定结果见图1。

图1 不同处理组大鼠血清钙和磷浓度（n=6）
Fig.1 Serum calcium and phosphorus concentrations in rats in different treatment groups（n=6）

不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

图1结果表明，与OVX组相比，OVX+MVHP组血清钙浓度显著升高（p<0.05）。Sham 组、OVX+VD2组血清钙浓度与OVX组、OVX+MVHP组均无显著差异（p>0.05）；与OVX组相比，Sham组、OVX+MVHP组血清磷浓度均无显著差异（p>0.05），而OVX+VD2组血清磷浓度显著下降（p<0.05）。

2.2 血清AKP与StrACP活性测定结果

各实验组血清AKP与StrACP活性测定结果见表1。

表1 各组大鼠血清中AKP、StrACP测量结果（n=6）
Table 1 The AKP and StrACP in rats seurm of different groups（n=6）

注：同列数据不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

组别AKP/（U/L）StrACP/（U/L）Sham组 35.41±2.21c 35.47±2.65a OVX组 60.90±2.64a 30.80±2.56ab OVX+VD2组 38.06±0.86c 26.80±5.77b OVX+MVHP组 44.77±1.29b 28.24±2.48b

表1结果表明，Sham组、OVX+VD2组和OVX+MVHP组血清中AKP活性与OVX组相比均显著降低（p<0.05），但各组血清StrACP活性与OVX组相比均无显著差异（p>0.05）。OVX+VD2组和OVX+MVHP组血清StrACP活性与Sham组相比均显著降低（p<0.05），但二者之间无显著差异（p>0.05）。

2.3 脏器指数测定结果

各组大鼠主要脏器指数测定结果如表2所示。

表2 各组大鼠脏器指数结果比较（n=6）
Table 2 The major organ index of rats in different groups after operation（n=6）

注：同列数据不同小写字母表示差异显著（p<0.05）。

组别 心脏指数 肝脏指数 脾脏指数 肾脏指数 子宫指数Sham组 0.004 1±0.000 1b 0.036 2±0.000 9b 0.002 4±0.000 2b 0.008 6±0.000 2ab 0.005 1±0.001 7a OVX组 0.005 4±0.000 2a 0.032 7±0.002 0c 0.002 1±0.000 1c 0.007 9±0.000 2c 0.001 5±0.000 1c OVX+VD2 0.004 2±0.000 1b 0.041 4±0.001 5a 0.002 9±0.000 1a 0.008 1±0.000 3bc 0.005 0±0.000 2a OVX+MVHP 0.004 2±0.000 2b 0.035 5±0.000 9b 0.002 3±0.000 0bc 0.008 6±0.000 3a 0.003 5±0.000 1b

与OVX组相比，OVX+MVHP组肝脏指数、肾脏指数、子宫指数显著升高（p<0.05），心脏指数显著降低（p<0.05），而脾脏指数无显著差异（p>0.05）。与OVX+VD2组相比，OVX+MVHP组肝脏指数、脾脏指数、子宫指数显著降低（p<0.05），肾脏指数显著升高（p<0.05），而心脏指数无显著差异（p>0.05）。

2.4 子宫组织病理学观察

子宫组织病理形态学观察结果见图2。

如图2所示，Sham组大鼠子宫断面结构在光镜下主要呈现壁厚腔窄的形态，单层柱状上皮规则排列，子宫肌层较厚，各层肌纤维相互交织，固有层分布有腺体和血管。与Sham组相比，OVX组子宫管径厚度明显变薄，子宫腔径厚度也明显增加，子宫黏膜上皮厚度明显变小，固有层子宫腺体减少；与OVX组相比，OVX+VD2组和OVX+MVHP组子宫管径厚度和子宫黏膜上皮厚度明显增加，子宫腔径厚度明显减小，肌层和子宫内膜显著增厚，固有层子宫腺体增多。

图2 子宫组织病理形态学观察
Fig.2 Histopathological observation of uterus of rats in different groups

A.Sham组子宫HE 4倍；B.OVX组子宫HE 4倍；C.OVX+VD2组子宫HE 4倍；D.OVX+MVHP组子宫HE 4倍；E.Sham组子宫HE 10倍；F.OVX组子宫HE 10倍；G.OVX+VD2组子宫HE 10倍；H.OVX+MVHP组子宫HE 10倍。

2.5 子宫形态计量学结果

子宫组织形态计量学结果如表3所示。

表3 各组大鼠子宫形态计量学指标测量结果比较（n=6）
Table 3 The measurements of uterine morphometric indicators in rats of different groups（n=6）

注：同列数据不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

组别 子宫管径厚度/μm子宫腔径厚度/μm子宫黏膜上皮厚度/μm Sham组 1 366.96±105.89a 248.93±99.06b 21.36±2.71a OVX组 503.03±100.65c 806.33±67.39a 13.42±0.71c OVX+VD2 909.81±59.29b 178.76±12.49b 18.99±0.91ab OVX+MVHP 1 069.05±160.38b 184.68±21.44b 17.43±1.69b

与Sham组相比，OVX组子宫管径厚度和子宫黏膜上皮厚度显著降低（p<0.05），子宫腔径厚度显著升高（p<0.05）；与OVX组相比，OVX+MVHP组子宫管径厚度和子宫黏膜上皮厚度显著升高（p<0.05），而子宫腔径厚度显著降低（p<0.05）；OVX+MVHP组与OVX+VD2组子宫管径厚度、子宫黏膜上皮厚度及子宫腔径厚度均无显著差异（p>0.05）。

2.6 骨组织病理学观察

骨组织病理形态学观察结果如图3所示。

图3 各组大鼠胫骨和股骨病理学观察
Fig.3 Pathological observation of femora and tibia of rats in different groups

A.Sham组胫骨HE 10倍；B.OVX组胫骨HE 10倍；C.OVX+VD2组胫骨HE 10倍；D.OVX+MVHP组胫骨HE 10倍；E.Sham组股骨HE 10倍；F.OVX组股骨HE 10倍；G.OVX+VD2组股骨HE 10倍；H.OVX+MVHP组股骨HE 10倍。

Sham组股骨的骨小梁致密且较宽、排列整齐并连接成网；与Sham组相比，OVX组股骨的骨小梁出现断裂，结构扭曲不完整，大部分不能连接成网状；与OVX组相比，OVX+MVHP组骨小梁有所恢复，骨小梁间隙变小，排列尚整齐并相互连接。Sham组胫骨骨髓腔较小，骨小梁致密且相互连接；与Sham组相比，OVX组胫骨骨髓腔变大，骨小梁松散；与OVX组相比，OVX+MVHP组骨髓腔变小，骨小梁断裂情况改善。

3 结论与讨论

切除雌性大鼠双侧卵巢所致的骨质疏松，能够正确模拟女性由于雌激素缺乏而引起骨质疏松的临床特征，是学术界目前公认的研究绝经后骨质疏松症的动物模型，亦是绝经后骨质疏松症研究的“金标准”。本文以去双侧卵巢骨质疏松大鼠为模型，以所研制的金针菇源VD2复合片剂为材料，比较了不同处理组大鼠血清钙、磷、AKP、StrACP等生化指标及脏器指数、子宫和骨组织形态病理学等指标变化，结果表明，与Sham组比较，OVX组大鼠子宫系数、组织病理学、形态计量学及骨组织病理学均有显著差异，说明去卵巢大鼠骨质疏松模型建立成功。与OVX组相比，OVX+MVHP组血清钙浓度显著升高（p<0.05），AKP浓度显著降低（p<0.05），而血清磷和StrACP浓度无显著差异（p>0.05），心、肝、肾、子宫等脏器指数差异显著（p<0.05），而脾脏无显著差异（p>0.05）；子宫管径厚度和子宫黏膜上皮厚度显著升高（p<0.05），子宫腔径厚度显著降低（p<0.05），股骨和胫骨骨小梁致密，小梁间距和骨髓腔变小。初步表明金针菇源VD2复合片剂对绝经后骨质疏松症具有一定的预防和治疗作用，研究结果为紫外照射提高VD2含量的食用菌的生物利用度，以及绝经后骨质疏松症的预防和治疗提供理论依据和重要参考。

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Effect of Flammulina velutiper Source Vitamin D2Compound Tablets on Serum Biochemical Indexes，Bone and Organs in Ovariectomized Rats

HU Dai-hua1，2，YANG Xu1，CHEN Wang1，FENG Zi-li1，ZHANG Jia-xin1，LI Cui-li1，SUI Xiang-ju1，QI Shan-shan1*，LUO Zhi-heng1
（1.Vitamin D Research Institute，Shaanxi Key Laboratory of Bioresource，School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，Shaanxi，China；2.College of Food Science and Engineering，Northwest A & F University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

Abstract：The effect of Flammulina velutiper-derived vitamincompound tablets on the serum biochemical indexes，bones，and organs of ovariectomized rats was investigated.The rat osteoporosis model was established by removing the ovaries.Healthy female sprague-dawley rats were divided into the sham-operated（Sham），ovariectomized（OVX），OVX+commercial，and OVX+F.velutipercompound tablet（OVX+MVHP）groups.The rats were treated every other day for 16 weeks.Afterward，their sera，tibias，femurs，and organs were collected.The serum calcium，phosphorus，alkaline phosphatase（AKP），and tartrate resistant acid phosphatase（StrACP）levels were determined.The organs were weighed，and the organ indexes were calculated.Additionally，bone and uterine tissue sections were prepared and stained with hematoxylin and eosin，and tissue structures were observed using a pathological image analysis system.Compared with that in the OVX group，the serum calcium concentration in the OVX+MVHP group was significantly higher（p<0.05），while the AKP concentration was significantly lower（p<0.05）.In contrast，there was no significant difference in the serum phosphorus and StrACP concentrations（p>0.05）.The heart，liver，kidney and uterus serum biochemical indexes were significantly different（p<0.05），while the spleen serum biochemical index was no（tp>0.05）.Additionally，the uterus tube and the lining of the uterus were significantly thicker（p<0.05），and there was a significant reduction in the thickness of the uterus （p<0.05）.The femur and tibia were dense，and the beam spacing as well as the bone marrow cavity were smaller.Altogether，these results indicated that F.velutiperderived compound tablets might prevent the occurrence of postmenopausal osteoporosis.

Key words：postmenopausal osteoporosi；ergocalciferol；edible mushrooms；bone tissue；morphometric；histopathological

DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2021.10.004

基金项目：陕西省教育厅重点实验室项目（20JS023）；陕西省科技厅项目（2021NY-154）；陕西理工大学博士后项目（SLGBH16-04）

作者简介：胡代花（1983-），女（汉），副教授，博士，研究方向：维生素D类功能食品研发。

*通信作者：祁珊珊（1984—），女（汉），副教授，博士，研究方向：维生素D类功能食品研发。

引文格式：

胡代花，杨旭，陈旺，等.金针菇源维生素D2复合片剂对去卵巢骨质疏松大鼠血清生化指标、骨及脏器影响[J].食品研究与开发，2021，42（10）：24-30.

HU Daihua，YANG Xu，CHEN Wang，et al.Effect of Flammulina velutiper Source Vitamin D2Compound Tablets on Serum Biochemical Indexes，Bone and Organs in Ovariectomized Rats[J].Food Research and Development，2021，42（10）：24-30.

加工编辑：王艳

收稿日期：2020-07-01