苯并噻重氮浸泡处理对金冠苹果苯丙烷代谢的影响

韩旭,李灿婴,葛永红*,刘腾,王瑞瑶

(渤海大学食品科学与工程学院,辽宁 锦州 121013)

摘 要:以金冠苹果果实为材料,采后用苯并噻重氮(acibenzolar-S-methyl,ASM)溶液浸泡处理10 min,以蒸馏水处理果实为对照,研究常温贮藏期间果实苯丙烷代谢关键酶活性和产物含量的变化。结果表明,ASM溶液处理显著提高果实中苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、4-香豆酸辅酶A连接酶和肉桂酸-4-羟基化酶的活性,并促进总酚和类黄酮的积累。由此表明,ASM处理通过激发苯丙烷代谢关键酶的活性,从而提高果实总酚和类黄酮含量,促进细胞壁的强化。

关键词:苹果;苯并噻重氮;酚类;苯丙氨酸解氨酶

苹果(Malus domestica Borkh)属于仁果类,是我国产量第一的水果,其中渤海湾地区尤其盛产苹果,主要品种有富士、金冠、嘎啦等[1]。苹果果实营养丰富,富含多种维生素、多酚、花青素、膳食纤维、有机酸等[2]。苹果是典型的呼吸跃变型果实,在采后贮运和销售过程中极易衰老引起品质下降和腐烂,给生产商和经营商带来巨大的经济损失。因此,延缓采后果实的衰老并提高果实抗病能力是苹果贮藏保鲜亟待解决的问题。

诱导抗性是近年来发展的果蔬采后病害控制的新技术之一,主要是通过激发果蔬自身防御系统,来增强抗氧化能力和抗病性[3]。苯并噻重氮(acibenzolar-S-methyl,ASM),是一种水杨酸的结构类似物,在体外条件下对病原真菌没有抑制效果,但可诱导苹果[4-5]、梨[6-7]、甜瓜[8]等果实的抗性,并且能够保持果实的品质[4]。ASM能够激活果蔬苯丙烷代谢途径,促进次生代谢产物酚类和黄酮类的积累[9-11],还能够通过调控活性氧和能量代谢延缓果实衰老并提高抗病性[5,7,12-13]。酚类和类黄酮具有重要的抗菌和抗氧化性能,酚类物质还是木质素合成的前体,有助于强化细胞壁,阻止病原真菌的侵染[14]。然而,有关采后ASM浸泡处理对金冠苹果果实采后次生代谢的影响尚缺乏深入研究。

本研究以金冠苹果为材料,通过采后ASM浸泡处理,研究常温贮藏期间苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、肉桂酸-4-羟基化酶和4-香豆酸辅酶A连接酶活性的变化以及总酚和类黄酮含量的积累,为进一步丰富ASM诱导抗性机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

金冠苹果(商业成熟度):采自锦州市苹果园,人工采摘并挑选成熟度一致、大小一致、表皮无机械损伤和病虫害的果实。采后用纸箱包装(50个/箱)后立即运回实验室,在24℃,相对湿度50% ~60%条件下贮藏待用。苯并噻重氮(acibenzolar-S-methyl,ASM,纯度≥98%):北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

FE 28型pH计:梅特勒-托利多仪器有限公司;H1650R型小型冷冻离心机:湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;UV-1801型紫外分光光度计:北京北分瑞丽分析仪器集团;HH-9A型常温单列单控水浴锅:常州国字仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ASM浸泡处理

参照葛永红等[15]方法并修改。新鲜采摘的苹果果实先用10 mg/mL次氯酸钠溶液消毒1 min,蒸馏水冲洗晾干后用0.1 g/L的ASM溶液浸泡处理10 min,用等量蒸馏水处理为对照。所有处理果实室温(24℃)晾干后分别装入塑料托盘中(15个/盘),于24℃,相对湿度50% ~60%条件下贮藏待用。每组处理105个果实。

1.3.2 取样

参照葛永红等[15]方法,分别于处理后第0天、第2天、第4天、第6天、第8天、第10天、第12天取对照和ASM处理果实果肉样品,在-80℃的冰箱中贮藏待用。

1.3.3 苯丙氨酸解氨酶(phenylalamine ammonia lyase,PAL)活性测定

参照Liu等[11]的方法。PAL反应体系为3.0 mL硼酸缓冲液(pH8.8,100 mmol/L)、0.5 mL 0.02 mol/L 苯丙氨酸和0.2 mL粗酶液,混匀后于290 nm处测定初始吸光度,在30℃水浴锅中保温30 min后立即加入200 μL 6.0 mol/L盐酸溶液终止反应,再次测定290 nm处吸光度值。以每分钟吸光度变化0.01为1个活性单位(U),酶活性表示为U/mg蛋白。

1.3.4 多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性测定

参照Chen等[16]方法。PPO反应体系为3.0 mL 0.2 mol/L邻苯二酚和1.0 mL粗酶液,以灭活的酶液为空白对照,混合均匀后于290 nm处测定初始吸光度,在30℃水浴锅中保温10 min后立即加入200 μL 6.0 mol/L三氯乙酸终止反应,再次测定290 nm处吸光度值。以每分钟吸光度值变化0.01为1个活性单位(U),酶活性表示为U/mg蛋白。

1.3.5 4 -香豆酰辅酶A连接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)活性测定

参照Liu等[11]的方法。4CL反应体系包括0.15 mL 0.8 mmol/mL三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),0.15 mL 1.0 μmol/mL 辅酶 A(coenzyme A,CoA),0.45 mL 75 mmol/L氯化镁溶液,0.15 mL 2.0 mmol/mL p-香豆酸和0.5 mL上清液(对照不加p-香豆酸),混合均匀后于333 nm处测定其吸光度值,以每分钟吸光度值变化0.001为1个4 CL活力单位(U),酶活性表示为U/mg蛋白。

1.3.6 肉桂酸-4-羟基化酶(cinnamate 4-hydroxylase,C4H)活性测定

参照Liu等[11]的方法。C4H反应体系为2.2 mL缓冲液 [2.0 μmol/L反式肉桂酸,50 mmol/L pH8.9 Tris-HCl,2.0 μmol/L 氧化型辅酶Ⅱ二钠(triphosphopyridine nucleotide disodium salt,NADPNa2),5.0 μmol/L 葡萄糖-6-磷酸-钠(D-glucose 6-phosphate sodium salt,G-6-P Na)]和0.8 mL上清液,25℃振荡反应30 min后,加入100 μL 6.0 mol/L盐酸溶液终止反应,在12 000 r/min、4℃条件下低温离心10 min,混合均匀后于340 nm处测定其吸光度值,每小时340 nm处OD值变化0.01为1个活性单位(U),酶活性表示为U/mg蛋白。

1.3.7 总酚和类黄酮含量测定

取1 g(鲜重)苹果,参照Liu等[11]的方法,测定其总酚和类黄酮含量分别以OD280和OD325表示。

1.3.8 蛋白含量测定

参照曹建康等[17]方法,采用考马斯亮蓝染色法测定粗酶液中的蛋白质含量。

1.4 数据处理

所有3次重复的试验数据采用Microsoft Excel 2007计算平均值和标准误差并作图,采用SPSS 16.0统计软件进行最小显著性差异分析(least significant difference,LSD)。

2 结果与分析

2.1 ASM处理对果实PAL活性的影响

ASM处理对果实PAL活性的影响见图1。

PAL是苯丙烷代谢途径的限速酶,调控果实体内酚类、黄酮类、木质素、水杨酸、生物碱等的生物合成及细胞壁木质化的过程,其活性高低与果蔬的抗病性直接相关[18]。由图1可知,对照和ASM处理苹果果实中PAL活性整体呈先上升后下降的趋势,但对照果实PAL活性整体变化不大,而在贮藏第4天到第12天,ASM处理显著提高了苹果果实中PAL活性,并在第8天出现峰值。Cao等[19]研究发现,采前ASM处理诱导了幼果和贮藏期间鸭梨果实PAL活性。采后ASM处理也能够提高甜瓜[11]和蓝莓[20]果实PAL活性,提高其抗病性和抗氧化能力。也有研究表明,采后多聚赖氨酸处理能够诱导苹果果实PAL活性的升高[21]。由此说明,诱导PAL活性的升高是ASM诱导果实产生抗病性的主要反应之一。

图1 采后ASM浸泡处理对苹果果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响
Fig.1 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the activity of PAL of apple fruit

*表示显著性差异(p<0.05)。

2.2 ASM处理对果实PPO活性的影响

ASM处理对果实PPO活性的影响见图2。

图2 采后ASM浸泡处理对苹果果实多酚氧化酶(PPO)活性的影响
Fig.2 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the activity of PPO of apple fruit

*表示显著性差异(p<0.05)。

PPO能够催化酚类物质转变成醌,能够直接抑制或者杀死病原物的生长[22]。随着贮藏时间的延长,对照和ASM处理苹果果实PPO活性均表现出上升趋势,且ASM处理果实中PPO活性始终高于对照组,并且在贮藏第6天到第12天差异显著(P<0.05)。已有研究表明,采后ASM处理显著提高了低温贮藏蓝莓果实中的PPO活性,并且提高了果实的抗氧化能力[20]。由此说明,ASM处理通过诱导PPO活性的升高来提高果实的抗氧化能力。

2.3 ASM处理对果实4CL活性的影响

ASM处理对果实4CL活性的影响见图3。

图3 采后ASM浸泡处理对苹果果实4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)活性的影响
Fig.3 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the activity of 4CL of apple fruit

*表示显著性差异(p<0.05)。

在苯丙烷代谢途径中,4 CL处于总途径向分支途径进行生物合成的转折点,可催化各种羟基肉桂酸生成相应的硫酯,从而进入木质素合成途径形成香豆酸、阿魏酸和咖啡酸,也可进入酚类和类黄酮、花色苷物质的合成途径[23]。由图3可知,在整个贮藏期间,对照和ASM处理果实4CL活性整体呈先上升再下降的趋势。ASM处理使果实4CL活性高峰的出现提前,而对照果实的4CL活性高峰不明显,并且ASM处理果实4 CL活性在整个贮藏期间均高于对照果实。蓝莓[20]、甜瓜[11]等果实中的研究也得到了类似的结果。

2.4 ASM处理对果实C4H活性的影响

ASM处理对果实C4H活性的影响见图4。

图4 采后ASM浸泡处理对苹果果实肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)活性的影响
Fig.4 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the activity of C4H of apple fruit

*表示显著性差异(p<0.05)。

C4H是苯丙烷代谢的第二关键酶,与果实体内咖啡酸和阿魏酸等物质的合成前体p-香豆酸的合成密切相关,这些酚酸可以直接毒杀病原物[18]。由图4可知,随着贮藏时间的延长,对照苹果果实C4H活性整体呈先升高后降低的趋势,但ASM处理显著提高了果实C4H活性,并且出现了双峰变化趋势。

2.5 ASM处理对果实总酚和类黄酮含量的影响

ASM处理对果实总酚和类黄酮含量的影响见图5和图6。

图5 采后ASM浸泡处理对苹果果实总酚含量的影响
Fig.5 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the content of total phenolic compounds of apple fruit

图6 采后ASM浸泡处理对苹果果实类黄酮含量的影响
Fig.6 Effects of ASM dipping treatment after harvest on the content of flavonoids of apple fruit

*表示显著性差异(p<0.05)。

酚类和类黄酮是苯丙烷类代谢途径的最终产物,本身具有直接的抑菌作用,同时酚类物质又是合成木质素的前体,促进细胞壁结构的强化[24]。类黄酮能够直接抑制真菌孢子萌发、菌丝生长和芽管伸长[25]。由图5可知,随着贮藏时间的延长,对照和ASM处理果实总酚含量逐渐升高,但二者没有显著的差异。对照和ASM处理果实类黄酮含量在贮藏第0天到第6天差异不大,但在后期ASM处理显著提高了果实类黄酮含量,并且在第10天出现高峰。已有研究表明,采前或采后 ASM 处理能够促进蓝莓[20]、甜瓜[11]、鸭梨[19]、芒果[26]等果实体内总酚和类黄酮等抗性物质的积累,从而提高果实的抗病性。此外,采后多聚赖氨酸处理也诱导了苹果果实PAL活性的升高[21]。由此说明,采后ASM处理通过激活苯丙烷代谢关键酶活性促进次生代谢产物的积累,从而提高果实的抗病性。

3 结论

采后ASM能够通过提高苹果果实苯丙烷代谢关键酶PAL、4CL、C4H的活性,促进抗性物质总酚和类黄酮的积累,还能够提高PPO活性从而提高醌类物质的生成,由此强化细胞壁结构,增强果实的抗氧化和抗病能力,最终达到延长果实贮藏期的作用。

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Effect of Postharvest Acibenzolar-S-methyl Dipping Treatment on Phenylpropanoid Pathway of Apple(cv.Golden Delicious)Fruit

HAN Xu,LI Can-ying,GE Yong-hong*,LIU Teng,WANG Rui-yao
(College of Food Science and Engineering,Bohai University,Jinzhou 121013,Liaoning,China)

Abstract:Apple fruit (cv.Golden Delicious)was used as the materials to study the effect of acibenzolar-S-methyl(ASM)dipping treatment for 10 min on the key enzymes activities and antifungal compounds in phenylpropanoid pathway during room temperature storage.The fruit treated with distilled water was used as the control.The results demonstrated that ASM treatment significantly enhanced the activity of phenylalamine ammonia lyase,polyphenol oxidase,4-coumarate coenzyme A ligase and cinnamate 4-hydroxylase in apple fruit.The accumulation of total phenolic compounds and flavonoids were also increased in the ASM-treated apple fruit.These results suggested that postharvest ASM treatment enhanced the accumulation of phenolic compounds and flavonoids by triggering phenylpropanoid pathway,therefore reinforcement the cell wall in apple fruit.

Key words:apple;acibenzolar-S-methyl;phenolic compounds;phenylalamine ammonia lyase

DOI:10.12161/j.issn.1005-6521.2021.01.022

基金项目:渤海大学2018年大学生创新创业训练计划项目(201810167178)

作者简介:韩旭(1996—),女(汉),本科生,研究方向:采后生物学与技术。

*通信作者:葛永红(1979—),男,副教授,博士,研究方向:采后生物学与技术。

引文格式:

韩旭,李灿婴,葛永红,等.苯并噻重氮浸泡处理对金冠苹果苯丙烷代谢的影响[J].食品研究与开发,2021,42(1):129-133.

HAN Xu,LI Canying,GE Yonghong,et al.Effect of Postharvest Acibenzolar-S-methyl Dipping Treatment on Phenylpropanoid Pathway of Apple(cv.Golden Delicious)Fruit[J].Food Research and Development,2021,42(1):129-133.

加工编辑:冯娜

收稿日期:2020-02-07