蓝靛果（Lonicera caerulea），忍冬科，忍冬属[1]。蓝靛果果实中维生素、有机酸、矿物质等营养成分含量丰富，并且含有多种抗氧化成分如黄酮、多酚、单宁及花色苷等[2-3]，对人体具有保健功能。因其口味酸涩，很少用来直接食用，此外由于蓝靛果果皮较薄易破碎，一般以冷藏为主，而冷藏会影响其风味，因此常加工成果汁、果酒等产品，是果汁、果酒酿造的一类新兴原料。
目前蓝靛果酒的酿造一般采用传统的清汁发酵，采用清汁发酵时，果皮中的芳香成分、花色苷等酚类物质浸提不充分，容易导致果酒色度低、风味差等问题[4]。
低温浸渍是在10℃以下的环境下浸渍，低温能够抑制果皮上野生酵母的繁殖，延缓发酵时长，从而有效促进蓝靛果中的酚类物质、花色苷等成分的浸出，提取出更多的香气成分和呈现较深的颜色，提升果酒品质，但却不容易控制时间，导致劣质单宁等成分的浸出[5-6]。CO2浸渍工艺是将果实处于无氧条件下进行细胞内发酵和浸渍作用，此过程中有少量酒精的产生、酚类等物质的浸出以及有机酸的转化与产生等一系列反应[7-8]。裴辰玉等[9]研究表明常温（28℃）下的CO2浸渍手段酿造的果酒总酸和单宁含量低，口味更柔和，但酒体较为单薄不宜长时间贮藏。对于低温浸渍和CO2浸渍工艺酿造果酒的研究很多，但是将低温和CO2浸渍结合在一起的研究却鲜有报道。张轶斌等[10]采用低温CO2浸渍新工艺酿造玫瑰香红葡萄醋，证明了低温CO2浸渍新工艺在保留了花色苷等多酚类物质的同时，能降低产品中单宁和总酸的含量。常温（28℃）下CO2浸渍要求果实的完整性，但由于蓝靛果皮较薄易破碎，温度过高容易导致其腐败变质，影响果酒品质[11]。而在低温条件下可以抑制野生酵母的繁殖以及杂菌的生长，解决了果皮破损的问题。因此本文采用低温CO2浸渍工艺酿造蓝靛果酒，解决蓝靛果总酸和单宁含量高、酚类物质浸出差以及原料破损等问题。以期提高蓝靛果酒的品质，从而丰富果酒市场的需求，为蓝靛果酒的酿造提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
蓝靛果：黑龙江省七台河市勃利县人工培育的“蓓蕾”品种。
1.1.2 主要试剂
RC212酵母：烟台帝伯仕自酿有限公司；CO2气体：吉林燃料乙醇有限公司；白砂糖：市售；氢氧化钠、盐酸、没食子酸、钨酸钠、钼酸钠、碳酸钠、无水乙醇、福林酚试剂（均为分析纯）：天津市恒兴化学制造有限公司。
1.2 主要仪器
5 L不锈钢压力桶：深圳市欧亚娜电子设备有限公司；TG16-WS型高速离心机：黑龙江嘉禾广博进出口有限公司；V-5200型紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；Sartorious PB 10 pH计：广州市深华生物科技有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 工艺流程
挑选蓝靛果→无菌操作台灭菌15 min→低温CO2浸渍→压榨、过滤→成分调整→添加偏重亚硫酸钾→主发酵9 d→后发酵25 d→陈酿→灭菌→成品[12]
1.3.2 操作要点
1.3.2.1 原料处理
选用成熟、无虫害的蓝靛果果实作为原料，保持原料完整，在无菌操作台进行灭菌后将蓝靛果放入不锈钢压力桶中。
1.3.2.2 浸渍处理
将蓝靛果缓慢送入发酵罐底，装罐密封后，充入CO2气体调整压力，并放在冰箱（0℃ ～10℃）进行浸渍。浸渍结束后，给发酵罐升温至26℃，进行后续发酵试验。
1.3.2.3 发酵液调配
将浸渍后的蓝靛果浆进行压榨、过滤，得到的果汁加入白砂糖调节糖浓度为200 g/L，加入柠檬酸调节pH值为3.5。再加入0.2 g/L的偏重亚硫酸钾，6 h后接种酵母。
1.3.2.4 果酒酵母活化
将活性干酵母RC212用接种针挑取少量的菌株接种到10 mL的麦芽浸汁液体培养基中，后于28℃的培养箱中培养24 h进行菌种活化。活化后的菌株在麦芽浸汁固体培养基上进行3次划线传代后接种到斜面培养基上，于4℃下低温保藏。取传代后的菌株接种于100 mL的麦芽浸汁液体培养基中于28℃的培养箱中，培养24 h制成酵母菌母液，4℃下保藏，以做后续试验使用。
1.3.2.5 发酵条件
浸渍处理后的发酵条件：发酵温度为26℃，接入2%（体积比）的酵母菌活化液，发酵10 d结束。
1.3.3 单因素试验条件的选取
浸渍发酵后测量果酒中总酸、单宁和花色苷的含量，以感官评分为主要评价指标，综合考虑选取较优单因素条件[13]。控制浸渍温度为6℃，浸渍压力为0.1MPa，浸渍时间设置为 1、3、5、7、9 d。控制浸渍时间为 5 d，浸渍压力为 0.1 MPa，浸渍温度设置为 2、4、6、8、10 ℃。控制浸渍时间为5 d，控制浸渍温度为6℃，浸渍压力设置为 0、0.05、0.1、0.15、0.2 MPa。
1.3.4 响应曲面优化设计
在单因素试验的基础上，选取较优的参数范围进行响应面分析，以蓝靛果酒的感官评分为响应值，筛选出低温CO2浸渍工艺的最优条件。各因素的处理水平如表1所示。
表1 响应曲面设计因素及水平
Table 1 Response surface design factors and levels
水平 因素A时间/d B温度/℃ C压力/MPa-1 3 4 0.05 0 5 6 0.1 1 7 8 0.15
1.3.5 不同工艺发酵对比试验
经响应面优化验证后，与传统工艺和常温二氧化碳浸渍作对比。控制常温CO2浸渍与低温CO2浸渍工艺压力相同，CO2浸渍温度为28℃，传统工艺采取清汁发酵。将几种不同前处理得到的果汁进行发酵试验，发酵条件与1.3.2.5相同，发酵结束后测定相关理化指标，并进行感官评价。
1.3.6 相关指标测定方法
1.3.6.1 基本理化指标的测定
总酸（柠檬酸计）：pH电位法；总糖：直接滴定法；酒精度：蒸馏-比重法，参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
1.3.6.2 单宁、总酚、花色苷含量的测定
单宁：分光光度法，参照NY/T 1600—2008《水果、蔬菜及其制品中单宁含量的测定》；总酚：福林-酚法[14]；花色苷：pH 示差法[15]；色度的测定：分光光度法[16]。
1.3.6.3 感官评价
选取28名优质品评员通过对果酒的色泽、滋味、香气及典型性进行评定，感官质量评分标准见表2。参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官分析方法进行评价。
表2 感官评分表
Table 2 Sensory score form
项目 描述 评分色泽（10分）鲜红色，色泽明亮 8 ～10浅红色，光泽暗淡 5 ～7暗红色，无光泽 <5澄清度（10分）澄清透明，无沉淀及悬浮物 8 ～10澄清不透明，有较少沉淀及悬浮物 5 ～7不澄清，不透明，酒体较浑浊 <5香气（30分）蓝靛果香浓郁，酒香纯正，无异香 26 ～30蓝靛果香较浓郁，酒香一般，无异香 20 ～25果香及酒香不明显，无异香 11 ～19果香及酒香不明显，有异香 <10滋味（30分）酒体饱满纯正，酸甜适中，回味绵长 26 ～30酒体饱满纯正，酸甜适中，回味时间短 20 ～25酒体较协调，口味偏酸或偏甜，回味时间短 11 ～19酒体寡淡，口味酸涩，无回味 <10典型性（20分）有蓝靛果风味，酒体优雅，具有典型性 16 ～20酒体较协调，蓝靛果风味不明显，缺少典型性 10 ～15酒体不协调，无蓝靛果风味 <10
1.4 数据处理
所得数据均为3次试验的平均值，采用Origin8.0软件作图、Design-Expert8.0.6软件进行响应面分析以及SPSS 23.0进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 浸渍条件单因素试验结果分析
单宁是果酒的灵魂，为果酒建立“骨架”，保证酒体结构稳定丰满。但过多的单宁会增加果酒的涩度，影响口感[17]。花色苷在果酒中起呈色作用，会与单宁等物质相互作用形成聚合物来增强颜色[18]。总酸含量的高低影响果酒的酸度。因此单宁、总酸和花色苷的含量对果酒的感官品质具有一定影响。
2.1.1 不同浸渍时间对蓝靛果酒的影响
浸渍时间对蓝靛果酒理化指标及感官的影响见图 1、图 2。
图1 不同浸渍时间对蓝靛果酒理化指标的影响
Fig.1 The influence of different impregnation time on the physical and chemical index of Lonicera caerulea wine
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
图2 不同浸渍时间对蓝靛果酒感官品质的影响
Fig.2 The effect of different impregnation time on the sensory quality of Lonicera caerulea wine
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图1可知，总酸含量随时间的增长，呈先降低后升高的趋势，在第5天总酸含量最低为13.1 g/L，与1 d ～3 d及第9天具有显著性差异（P<0.05）。这是由于浸渍前期，发生细胞内发酵，CO2促进了苹果酸的转化，导致总酸含量降低，而随着时间的增长，乳酸和CO2生成，部分CO2溶于蓝靛果汁中，从而提高了果酒中的总酸含量。随着浸渍时间的增长，单宁含量总体呈先增加后减少的趋势，在第3天含量最高，在1 d ～5 d时，单宁呈显著增长的趋势（P<0.05），在5 d ～9 d下降趋势平缓，无显著性差异（P>0.05）。这可能是由于浸渍前期，CO2进入果实中较少，并且低温抑制细胞内发酵，导致细胞内发酵不显著，随着时间的延长，无氧呼吸产生酒精，与果皮能够充分接触，导致单宁浸出，后期降低可能是由于发生酶解或者是与花色苷等成分发生聚合，导致单宁含量降低。花色苷整体呈先升高后降低的趋势，在第5天的含量最高为435 mg/L，与其它几天具有显著性差异（P<0.05）。这是由于浸渍前期，发生细胞内发酵，花色苷逐渐溶出。随着时间的延长，部分花色苷发生降解，导致其溶解性降低而沉降下来，从而含量降低。
由图2可知，浸渍5 d得到的蓝靛果酒感官评分最高，与其它几天具有显著性差异（P<0.05），所得到的果酒酸甜适中，口感柔和，酒体饱满，色泽稳定。这是由于在浸渍第5天总酸含量最低，花色苷含量最高，适量的单宁保证了酒体饱满且不苦涩。综合分析，确定第5天为最佳浸渍时间。
2.1.2 不同浸渍温度对蓝靛果酒的影响
浸渍温度对蓝靛果酒理化指标及感官的影响见图 3、图 4。
图3 不同浸渍温度对蓝靛果酒理化指标的影响
Fig.3 The influence of different impregnation temperature on the physical and chemical index of Lonicera caerulea wine
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图3可知，随着温度的升高，总酸呈逐渐降低的趋势（P<0.05）。这可能是由于低温抑制了细胞内发酵，随着温度的升高，促进了苹果酸等有机酸的转化，导致总酸含量的降低。单宁含量逐渐增加，这是由于随着浸渍温度的升高促进了细胞内发酵以及果胶酶解，单宁溶出增多。花色苷整体呈先升高再降低的趋势，在温度为6℃时含量最高，与其它温度具有显著性差异（P<0.05）。这可能是由于温度升高，促进了酶解以及细胞内发酵，花色苷更好地溶出，但花色苷不稳定，高温下容易发生降解或聚合，从而含量降低。
图4 不同浸渍温度对蓝靛果酒感官品质的影响
Fig.4 The effect of different impregnation temperature on the sensory quality of Lonicera caerulea wine
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图4可知，6℃时感官评分最高，与其它温度具有显著性差异（P<0.05）。所得到的果酒酸甜适中，果香浓郁，颜色呈亮红色。这是由于适宜的温度能降低总酸含量，保证花色苷溶出较多，温度较低时，单宁、花色苷等酚类物质浸出不足，酒体单薄，过高的温度容易使劣质单宁浸出导致口感苦涩，影响感官品质。综合分析，选择6℃为最佳浸渍温度。
2.1.3 不同浸渍压力对蓝靛果酒的影响
浸渍压力对蓝靛果酒理化指标及感官的影响见图 5、图 6。
图5 不同浸渍压力对蓝靛果酒理化指标的影响
Fig.5 The influence of different impregnation pressure on the physical and chemical index of Lonicera caerulea wine
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
图6 不同浸渍压力蓝靛果酒感官评分的影响
Fig.6 The effect of different impregnation pressure on the sensory quality of Lonicera caerulea wine
不同小写字母表示差异显著，P<0.05。
由图5可知，随着压力的增大，总酸含量呈先降低后升高的趋势，在压力为0.15 MPa时总酸含量最低为12.7 g/L，在0 ～0.1 MPa显著下降（P<0.05）。这是由于CO2含量的增加促进了部分有机酸的分解和苹果酸的转化，但随着CO2的增加，细胞内发酵增强，乳酸等有机酸含量增加，以及过多的CO2溶解在蓝靛果汁中生成碳酸导致总酸含量增加。随着压力的增长，单宁含量呈逐渐上升的趋势，在0 ～0.1MPa显著上升（P<0.05），0.1 MPa ～0.2 MPa上升较为缓慢（P>0.05）。这是由于细胞内发酵增强，细胞内发酵产生酒精，过高的压力导致果实容易发生破裂，产生的酒精和浸渍出的果汁与果皮充分接触，果实内部的单宁逐渐浸出。花色苷含量呈先升高后降低的趋势，浸渍压力为0.1 MPa时花色苷含量最高。
由图6可知，0.1 MPa时感官评分最高，所得到的果酒色泽明亮、酸甜适中、果香浓郁。这是由于适当的压力在保证花色苷溶出较多的同时，降低了总酸和单宁含量，提升了果酒品质。综合分析，选择0.1 MPa为最佳浸渍压力。
2.2 响应面优化
2.2.1 响应面设计及结果
响应面试验结果如表3所示。
表3 响应面设计及结果
Table 3 Responsive design and results
试验号 A时间 B温度 C压力 感官评分1 1 0 0 87.23 2 1 0-1 84.02 3-1 0 1 82.34 4-1 0 -1 80.23 5 0 1-1 83.81 6-1 -1 0 78.91 7 0 0 0 91.20 8 0 89.99 9 1 1 0 82.41 0 0 10 0 0 0 90.10 11 0 0 0 90.01 12 -1 1 0 79.02 13 0 0 0 90.87 14 0 0 1 86.91 15 0 -1 -1 81.77 16 0 1 1 83.43 17 1 0 1 86.90
2.2.2 回归模型及方差分析
依据试验数据进行多元回归分析，可得到3个因素对蓝靛果酒感官品质影响的二次回归模型：R=-6.86231+14.34A+14.47B+296.685C-0.31AB+1.925AC-13.825BC-1.43A2-0.99B2-995.3C2。对所得回归模型进行方差分析，如表4所示。
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Analysis of variance in regression model
注：*差异显著（P<0.05）；**差异极显著（P<0.01）。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性模型 281.39 9 31.25 54.28 <0.000 1 **A 50.40 1 50.40 87.54 <0.000 1 **B 4.8 1 4.80 8.35 0.023 4 *C 11.81 1 11.81 20.51 0.002 7 **AB 6.08 1 6.08 10.55 0.014 1 *AC 0.15 1 0.15 0.26 0.062 5 BC 7.65 1 7.65 13.28 0.008 2 **A2 88.06 1 88.06 152.95 <0.000 1 **B2 66.64 1 66.64 115.74 <0.000 1 **C2 26.07 1 26.07 45.28 0.000 3 **残差 4.03 7 0.58失拟 2.76 3 0.92 2.91 0.164 2误差 1.27 4 0.32总和 285.32 16
由表4回归模型分析可知，P<0.000 1，该响应曲面的二次多元回归模型极显著，失拟项P=0.164 2>0.05，不显著，由此可得该回归模型具有好的拟合程度。模型的复相关系数为0.985 9>95%，可知因变量对自变量的影响显著。校正决定系数为0.995 6，说明该模型拟合度较好，可以进一步分析。
一次项 A、C 和二次项 A2、B2、C2极显著（P<0.01），一次项B显著（P<0.05）。考察各因素交互作用，AB、AC、BC存在交互作用，其中BC差异极显著（P<0.01），AB差异显著（P<0.05），AC差异不显著（P>0.05）。根据F值可知，在试验范围内各因素对蓝靛果酒感官评分的影响依次为：A（浸渍时间）>C（浸渍压力）>B（浸渍温度）。
2.2.3 响应曲面分析与讨论
各因素及其交互作用对感官品质影响的响应面见图7。
根据响应曲面趋势及等高线的密集程度，判断各因素之间的交互作用。响应曲面的趋势越陡，等高线越密集，说明两两交互越显著。由图7可知，3D响应曲面陡峭，并且等高线均呈椭圆形，说明各因素之间交互作用显著，其中图7a和图7c的曲面趋势较陡，图7b的趋势略微平缓，这说明时间和温度以及温度和压力交互作用较为显著，这与方差分析结果一致。
图7 两因素交互作用的响应曲面图
Fig.7 Response surface plot of the interaction of each two factors
2.2.4 验证试验
通过Design-Expert 8.0软件计算最优点，获蓝靛果酒的最优浸渍工艺为：浸渍时间5.62 d，浸渍温度5.60℃，浸渍压力0.12 MPa，在此条件下预测其感官评分为91.086 7分，按照实际情况调整浸渍条件为：浸渍时间5.6 d，浸渍温度6℃，浸渍压力0.1 MPa。为验证响应面优化工艺结果可靠性，进行3组平行试验验证，得出在此条件下其感官评分分别为91.10、90.98、91.07分，说明优化效果显著，进一步证明该回归模型是有效可靠的。
2.3 不同工艺对比试验
不同工艺蓝靛果酒的理化指标及感官评分见表5。
由表5可知，3种工艺对蓝靛果酒的残糖量和酒精度影响不大，无显著性差异（P>0.05），说明3种工艺生产的果汁对果酒的发酵程度影响较小。传统工艺总酸含量较高，常温CO2浸渍和低温CO2浸渍工艺总酸含量相对较低，这可能是由于通入CO2促进了苹果酸的转化，降低了总酸含量，使得口感更柔和，这与Lucía González Arenzana等[19]的研究一致。低温二氧化碳浸渍产生的总酚含量最高，传统工艺总酚含量最低。这是由于传统工艺采取清汁发酵，浸提不充分，酚类物质浸出差，而低温抑制野生酵母的繁殖，延长了浸渍时间，使得酚类物质更多地浸出[20]。传统工艺单宁含量较高，CO2浸渍工艺单宁含量较低，这是由于蓝靛果直接破碎榨汁，果皮中的劣质单宁直接浸出，这与刘晶等[21]的研究结果一致。单宁是酒体的灵魂，单宁过少会导致酒体单薄无力，过多的单宁则导致口感苦涩，因此利用低温与CO2的协同作用，保证单宁的适量浸出。低温CO2浸渍工艺产生的花色苷含量及色度较高，这是由于低温延长浸渍时间，使得花色苷更好地溶出，并且低温可以抑制花色苷的分解，从而提升果酒色度。
表5 不同工艺蓝靛果酒的理化指标及感官评分
Table 5 The physical and chemical indexes and sensory scores of Lonicera caerulea wine with different processes
注：同一列不同小写字母表示不同组之间差异显著，P<0.05；CM代表常温CO2浸渍；LTCM代表低温CO2浸渍。
工艺总糖/（g/L）酒精度/(%vol)总酸/(g/L)总酚/(g/L)单宁/(mg/L)花色苷/(mg/L)色度感官评分传统 6.06±0.02a 11.6±0.07a 14.9±0.12a 1.23±0.13c 705±4.62a 310±3.11bc 6.12±0.04c 79.9±0.02c CM 5.92±0.07a 10.7±0.02b 13.3±0.03b 1.32±0.14b 640±6.53c 345±2.94b 7.85±0.32b 84.7±0.04b LTCM 5.83±0.05a 11.1±0.06a 12.9±0.05b 1.41±0.11a 675±3.82b 385±2.73a 8.73±0.11a 91.1±0.03a
综上所述，采用低温CO2浸渍工艺在保留了花色苷等酚类物质的同时，适量降低了单宁和总酸的含量，解决了传统工艺与常温CO2浸渍工艺存在的问题，提升了蓝靛果酒品质。
3 结论
以蓝靛果为原料，研究浸渍时间、浸渍温度和浸渍压力对蓝靛果酒理化性质及感官品质的影响，经单因素试验和响应面的优化，得到低温CO2浸渍的最佳工艺为：浸渍时间5.6 d、浸渍温度6℃、浸渍压力0.1 MPa，此浸渍工艺条件下的蓝靛果酒感官评分为91分，口感柔和，香气宜人，色泽稳定。对比试验表明，采取低温CO2浸渍工艺能有效降低单宁和总酸的含量，并能使花色苷等酚类物质充分溶出，提升果酒品质，解决了蓝靛果酒口感酸涩，香气不明显等问题，具有不同于其它工艺的特殊风味，为蓝靛果酒的工业生产提供了理论依据。
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