多酚一般指多酚类化合物，包括复合多酚、黄酮类化合物、花青素等[1]。多酚多存在于谷物[2]、坚果类[3-4]、水果，如葡萄、茶叶、绿豆[5-7]中，并且含量丰富。研究表明，多酚在药理方面具有很强的抗氧化性、降低血脂、增强免疫力、抗肿瘤等功能活性[8-15]，有促进人体健康的作用。因多酚极强的抗氧化活性被称为“第七类营养素”[16]。目前常见的多酚提取工艺有溶剂提取法、微波辅助提取法、分光光度法和高效液相色谱法等[17]。
花生是我国的主要油料作物之一。花生副产物中存在大量的多酚类物质，目前，许多研究者从花生的壳和红衣中提取多酚[18-19]，以及从花生的根、茎、叶、红衣、壳中提取白藜芦醇、原花青素、木犀草素等[20-24]。花生中的多酚类物质除了白藜芦醇、原花青素等还存在许多其它的酚类物质，如茶多酚、p-香豆酸等，都具有相同的抑菌、防辐射等效果。但在花生根的多酚类物质提取方面研究较少，目前常见的是在花生根中提取白藜芦醇[22]，因此本研究以花生根为原料，探究花生根中的多酚含量，以及检测花生根中多酚类物质的主要成分。本研究给花生副产物中多酚的提取提供了更多理论依据。提取花生根中的多酚类物质不仅提高了花生根的综合利用价值和经济价值，也使花生的各个部位都更加有效地利用起来，而且为进行针对性的药物和保健食品的开发应用提供原材料。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
花生根：塔里木大学种植的花生试验田；甲醇（色谱纯）、甲酸（色谱纯）：赛默飞世尔科技有限公司；没食子酸标准品（纯度≥98%）、茶多酚标准品（纯度≥98%）、白藜芦醇标准品（纯度≥98%）、p-香豆酸标准品（纯度≥98%）、咖啡酸标准品（纯度≥98%）：上海源叶生物科技公司；福林酚试剂（2 mol/L）：美国米瑞达科技有限公司；无水乙醇：天津市北联精细化学品开发有限公司；无水碳酸钠（≥99.8%）：天津市致远化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
紫外分光光度计（UV-2450）、高效液相色谱仪（LC-20A）：岛津企业管理（中国）有限公司；高速冷冻离心机（TGL-20br）：上海安亭科学仪器厂；电热鼓风干燥箱（GZX9240MBE）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超声波清洗机（SB-5200DT）：宁波新芝生物科技股份有限公司；无筛粉碎机（SZNL-150）：广州市旭朗机械设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品的预处理
将从试验田收获的花生根洗净、烘干、用高速万能粉碎机粉碎后过60目筛。装瓶放置干燥处留存备用。
1.3.2 花生根中多酚提取的工艺流程
称取花生根粉末 1.0 g，按料液比 1∶30（g/mL）加入体积分数为70%的乙醇溶液，置于超声波清洗器中，超声频率40 kHz、功率为200 W、在一定温度下超声处理一段时间后，经离心机4 000 r/min离心10 min。取上清液用无水乙醇稀释5倍，即得多酚提取液。
1.3.3 花生根中多酚含量的测定
1.3.3.1 没食子酸标准曲线的绘制
精确称取没食子酸标准品10 mg，用水溶解并定容至100 mL，得到0.1 mg/mL的标准液。取15 mL具塞试管，先加入一定量水（标准品和80%水的总体积为10.2mL）分别准确移取该溶液 0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，再分别加入0.3 mL福林酚试剂，反应5 min后加入1mL 15% Na2CO3溶液，加盖摇匀，避光条件下反应2 h，以无水乙醇为空白对照，在745 nm处测定吸光度，得到回归方程y=0.956 1x+0.123 5，R2=0.999 1，没食子酸标准曲线见图1。
图1 没食子酸标准曲线
Fig.1 Gallic acid standard curve
1.3.3.2 多酚的测定
具塞试管中加入10 mL超纯水，再加入0.2 mL样液和0.3 mL福林酚试剂反应5 min后，加入1 mL 15% Na2CO3溶液，摇匀于室温24℃下避光反应2 h，在745 nm处测定吸光度值，算出多酚提取量，单位为mg/g。
1.4 单因素试验
分别考察乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比[1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）]、超声时间（10、20、30、40、50 min）、提取温度（30、35、40、45、50℃）4个因素对花生根中多酚提取量的影响。每组试验重复3次。
1.5 正交试验
在单因素基础上，分别考察A乙醇体积分数、B料液比、C提取温度、D超声时间因素，得到最佳工艺。设计L9（34）正交试验表。
1.6 花生根中多酚成分分析
1.6.1 色谱条件
色谱柱：ZORBAXSB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：280 nm；流动相：A为甲醇，B为0.5%甲酸；总时长：60 min；流速：0.7 mL/min。
1.6.2 洗脱条件（320 nm和280 nm）
流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.5%甲酸。洗脱程序：0～6 min，B 为 90%；6 min ～10 min，B为 90%～80%；10 min～11 min，B 为 80%；11 min～15 min，B 为 75%～70%；15 min～25 min，B 为 70%～60%；25 min～32 min，B 为60%～45%；32 min～40 min，B 为 45%～0%；40 min～50 min，B 为 0%；50 min～51 min，B 为 0%～90%；51 min～60 min，B为90%。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇体积分数对花生根中多酚提取量影响
称取1.0 g花生根粉末，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入乙醇后，置于超声波清洗器中，30℃下超声辅助提取30min，在乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%条件下分别进行多酚提取，提取量如图2所示。
图2 乙醇体积分数对多酚提取量的影响
Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on polyphenol extraction
如图2所示，当乙醇体积分数为50% ～70%时，花生根中多酚提取量与乙醇体积分数为正相关，在70%时，提取量达到最大值。乙醇体积分数达到70%后多酚提取量呈逐渐递减趋势。乙醇体积分数可能会影响多酚的溶解度[25]。乙醇的体积分数增加，花生根中脂溶性物质和醇溶性物质溶出量增加，使多酚与乙醇-水分子结合量降低，从而使多酚的提取量降低。
2.1.2 料液比对多酚提取量的影响
称取1.0 g花生根粉末，取体积分数为70%的乙醇，按照料液比分别为 1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）分别置于超声波清洗器中，30℃下超声辅助提取30 min。所得多酚的提取量如图3所示。
由图3可知，多酚的提取量随着溶剂体积的增加而逐渐增加，当料液比为1∶40（g/mL）时多酚的提取量达到最大值。这是由于乙醇的质量越大，多酚的溶出率则越高。出于经济效益，选取料液比为1∶30（g/mL）时为最佳。
2.1.3 提取温度对多酚提取量的影响
图3 料液比对多酚提取量的影响
Fig.3 Effect of the liquid ratio on polyphenol extraction
称取1.0 g花生根粉末，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入乙醇后，置于超声波清洗器中，超声辅助提取 30 min，分别在提取温度为 30、35、40、45、50 ℃的条件下，进行多酚的提取，多酚的提取量如图4所示。
图4 提取温度对多酚提取量的影响
Fig.4 Effect of the extraction temperature on polyphenol extraction
由图4可知，温度在30℃～40℃之间，多酚的提取量与温度呈正相关，40℃以后多酚的提取量逐渐下降。这一现象是由于温度升高分子运动加快，溶解速率增加，导致花生根中多酚的溶解量增大。随着温度的升高，溶剂挥发导致溶解度降低提取量下降。因此，提取多酚的最佳适应提取温度为40℃。
2.1.4 超声时间对多酚提取量的影响
称取1.0 g花生根粉末，按料液比1∶20（g/mL）的比例加入乙醇后，置于超声波清洗器中，提取温度30℃，考察超声时间分别在 10、20、30、40、50 min 的条件下对多酚提取量的影响，多酚的提取量如图5所示。
图5 超声时间对多酚提取量的影响
Fig.5 Effect of ultrasonic time on polyphenol extraction
如图5所示，在时间为10 min ～40 min时，提取量与超声时间呈正相关。提取量随着超声提取时间逐渐增加，当超声时间超过40 min后，超声波可能会对多酚物质造成损失，从而提取量下降。因此40 min时多酚的提取量最佳。
2.2 正交试验结果分析
花生根中多酚的提取正交表见表1。
表1 正交试验表
Table 1 Orthogonal table
多酚提取量/（m g/g）1 1（6 0） 1（1 ∶2 5） 1（3 5） 1（3 0） 0.7 3 2 1 2（1 ∶3 0） 2（4 0） 2（4 0） 1.2 6 2 3 1 3（1 ∶3 5） 3（4 5） 3（5 0） 1.4 0 5 4 2（7 0） 1 2 3 1.2 6 7 5 2 2 3 1 1.5 6 1 6 2 3 1 2 1.0 9 1 7 3（8 0） 1 3 2 0.9 3 8 3 2 1 3 1.0 0 4 9 3 3 2 1 0.5 4 8 k 1 3.3 9 6 2.2 9 8 2.8 2 3 2.8 3 8 k 2 3.9 1 8 3.8 2 8 3.0 7 8 3.2 8 2 k 3 2.4 8 1 3.0 4 5 3.8 9 7 3.6 7 5 K 1j 1.1 3 2 0.9 7 6 0.9 4 1 0.9 4 6 K 2j 1.3 0 6 1.2 7 6 1.0 2 6 1.0 9 4 K 3j 0.8 2 7 1.0 1 5 1.2 9 9 1.2 2 5优水平 A 2 B 2 C 3 D 3极差R 0.4 9 7 0.3 0.3 5 8 0.2 7 9主次顺序 A 2＞B 2＞C 3＞D 3试验号 A乙醇体积分数/%B料液比/（g/m L）C提取温度/℃D超声时间/m i n
由表1可知，各因素对提取量的影响大小顺序为：A＞C＞B＞D，即当乙醇体积分数为70%、料液比为1∶30（g/mL）时，在超声波清洗器中45℃条件下提取50 min得到最优组合为A2B2C3D3。由于在正交试验过程中的最佳组合与正交试验所得的最佳组合不同，故需验证试验。
按照正交表中最佳组合A2B2C3D1和正交试验各因素最佳水平组A2B2C3D3进行验证试验，得到花生根中多酚的平均得量分别为1.497 mg/g和1.629 mg/g，相对标准偏差分别为2.6%和1.9%，均小于5%，表明精密度较好，因此试验最佳组合为A2B2C3D3，即乙醇体积分数为70%、料液比1∶30（g/mL）、提取温度45℃、超声时间50 min，且最佳提取量为1.629 mg/g。
2.3 花生根多酚提取物的高效液相（high performance liquid chromatography，HPLC）分析结果
超声波辅助提取法测得的最佳组合为供试样液，即乙醇体积分数为70%、料液比1∶30（g/mL）、提取温度45℃、超声时间50min时所提取的样液，用0.22μm微孔滤膜过滤，所得样液即为待测液，放入进行自动进样，并记录色谱图。花生根多酚提取物的液相（HPLC）分析见表2。高效液相色谱法对花生根提取物的成分分析见图6。
表2 花生根多酚提取物的高效液相分析
Table 2 High performance liquid chromatography（HPLC）analysis of peanut root polyphenol extract
序号 化合物名称 最大吸收波长/n m ?浓度/（μ g/m L）1 儿茶素 2 7 8 2 1.2 3 7 1 6 3.9 1±6.8 4 2 咖啡酸 3 2 4 2 5.4 8 3 2.6 3±0.1 3 3 p-香豆酸 3 1 0 3 1.3 7 7 5.8 4±0.2 2 4 白藜芦醇 3 1 7 3 7.6 1 9 5 8.4 5±1.4 6保留时间/m i n
图6 花生根多酚提取物分析色谱图
Fig.6 Peanut root polyphenol extract analysis chromatography
1 ～5分别表示儿茶素、咖啡酸、P-香豆酸、白藜芦醇、其他物质。A为317 nm波长下检测结果；B为278 nm波长下检测结果。
从表2、图6中可以看出，花生根中多酚提取物在波长为278 nm下检测到了儿茶素（1号峰），在波长为310 nm～317 nm之间检测出了白藜芦醇（4号峰）、p-香豆酸（3号峰）、咖啡酸（2号峰），在花生根中检测出的多酚类物质中p-香豆酸和咖啡酸含量相对较少。提取物中还有许多多酚类物质（5号峰），他们的最大吸收波长都在310 nm～317 nm之间。
3 结论
使用超声辅助提取法来提取花生根中的多酚，得到的优化工艺为乙醇体积分数70%、料液比1∶30（g/mL）、提取温度 45℃、超声时间 50 min，此条件下得到的花生根中多酚含量为1.629 mg/g。用高效液相色谱法测定花生根提取物可以得出儿茶素、白藜芦醇、咖啡酸、p-香豆酸4种单体酚，提取物中还有许多多酚类物质，其最大吸收波长都在310 nm～317 nm之间。通过提取花生根中的多酚不仅提高了花生副产物的综合利用量，为化妆品、药品行业提供原材料，而且使花生的各个部位更加有效的利用起来，物尽其用。
[1]夏婷,赵超亚,杜鹏,等.食品中多酚类化合物种类、提取方法和检测技术研究进展[J].食品与发酵工业,2019,45(5):231-238.
[2]赵广河,张瑞芬,苏东晓,等.全谷物酚类物质及其抗氧化活性研究进展[J].中国食品学报,2017,17(8):183-196.
[3]齐路路.坚果的主要生物活性成分及其保健作用[J].现代食品,2019(1):62-63,67.
[4]李夕勃.核桃坚果硬壳发育与木质素代谢关系的研究[D].秦皇岛:河北农业大学,2012.
[5]Zheng Li,Huixia Zhang,Yan Li,et al,.Phytotherapy using blueberry leaf polyphenols to alleviate non-alcoholic fatty liver disease through improving mitochondrial function and oxidative defense[J].Phytomedicine,2020,69(12):64-72.
[6]彭雪萍,马庆一,王花俊,等.苹果多酚在卤肉保鲜中的应用研究[J].肉类研究,2006(12):9-11.
[7]Arno Greyling,Rosa M.Bruno,Richard Draijer,et al.Effects of wine and grape polyphenols on blood pressure,endothelial function and sympathetic nervous system activity in treated hypertensive subjects[J].Journal of Functional Foods,2016,27:241-249.
[8]蓝梧涛,吴雪辉,章文.油茶叶多酚纯化工艺优化及其对油脂的抗氧化作用[J].南方农业学报,2019,50(9):2058-2064.
[9]张秀芬,陈荣锋,刘连军,等.茶多酚在食品中的应用[J].生物加工过程,2019,17(4):424-429.
[10]Jokura H,Watanabe I,Umeda M,et al.Coffee polyphenol consumption improves postprandial hyperglycemia associated with impaired vascular endothelial function in healthy male adults[J].Nutrition Research,2015,35(10):873-881.
[11]汪洋.小米米糠多酚的提取及其降血脂的研究[D].长春:吉林农业大学,2018.
[12]Joydeb Kumar Kundu,Young-Joon Surh.Cancer chemo preventive and therapeutic potential of resveratrol:Mechanistic perspectives[J].Cancer Letters,2008,269(2):243-261.
[13]连冠,鱼毛毛,徐璐,等.葡萄籽多酚降血脂及抗动脉粥样硬化的作用及机制[J].中国动脉硬化杂志,2015,23(2):121-126.
[14]涂杜,张军丽,彭新宇,等.荔枝多酚对营养性肥胖小鼠减肥和增强免疫力作用研究[J].食品研究与开发,2019,40(15):14-18.
[15]Awika Joseph M,Duodu Kwaku G.Bioactive polyphenols and peptides in cowpea(Vigna unguiculata)and their health promoting properties:A review[J].Journal of Functional Foods,2017,38(Part B):686-697.
[16]符莎露,吴甜甜,吴春华,等.植物多酚的抗氧化和抗菌机理及其在食品中的应用[J].食品工业,2016,37(6):242-246.
[17]夏婷,赵超亚,杜鹏,等.食品中多酚类化合物种类、提取方法和检测技术研究进展[J].食品与发酵工业,2019,45(5):231-238.
[18]伍阳阳,胡剑勇,邓仕英.花生壳中多酚的提取及其含量测定[J].化学工程与装备,2018(10):9-10.
[19]赵萍,林樱姬,金征宇,等.超声辅助提取花生红衣中多酚物质及其抗氧化活性的研究[J].食品科学,2010,31(12):53-57.
[20]王菲,张聪聪,山显彤,等.花生红衣中原花青素的提取[J].辽宁石油化工大学学报,2016,36(6):14-19.
[21]崔建强,刘荣.响应面优化花生壳中木犀草素超声提取工艺[J].陕西农业科学，2019,65(2):11-14,64.
[22]宋健,林瑾,李星,等.花生种子及花生植株各部位白藜芦醇含量的测定[J].食品科技,2019,44(6):331-335.
[23]徐杰,谢鑫,郑祥清,等.花生芽中白藜芦醇的提取和含量分析[J].广东化工,2018,45(12):62-63.
[24]Constanza Karen E,White Brittany L,Davis Jack P,et al.Valueadded processing of peanut skins:antioxidant capacity,total phenolics,and procyanidin content of spray-dried extracts[J].Journal of agricultural and food chemistry,2012,60(43):19-25.
[25]周海旭,李忠海,钟海雁,等.樟树叶多酚超声波法提取工艺的响应面优化[J].经济林研究,2013,31（4）:152-156.