酿造酒由原料经发酵后获得的酒精饮料,原料转化为乙醇主要由酵母菌进行生物转化。根据酵母菌发酵特性将其分成酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,Sc)和非酿酒酵母(Non-Saccharomyces cerevisiae,NSc)两大类[1]。Sc主要进行酒精发酵,将原料中的糖转化为乙醇、二氧化碳和其它副产物[2]。利用Sc进行纯种发酵,操作简单、易于控制,但发酵酒中风味物质种类及含量均有限,酒质风味较为单一。近年来利用NSc与Sc进行混合发酵改善果酒的风味,已成为研究的一个热点。NSc可产生多种酯类、醇类、甘油以及多种酸类等风味物质,在很大程度上影响果酒的色泽、风味以及复杂度,对果酒的感官品评具有重要的影响[3-5]。
美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima,Mp)是一种常见的NSc,天然存在于各种水果、蜜腺、花朵等植物结构上[6]。在葡萄汁的酒精发酵前期,通常情况下可以检测到Mp的存在。Clemente-Jimenez等研究发现,在Mp与Sc共培养时,二者具有协同作用,有助于包括脂肪酸、酯和萜烯醇等多种芳香化合物的产生[7]。研究还发现,某些Mp菌株能够表达高水平的β-葡萄糖苷酶,并作用于多种含糖苷键的风味前体物质,有助于如萜烯类风味物质的释放,增强酒体风味特性[8]。此外,Mp与Sc混合发酵还能够降低发酵酒中的乙醇含量,同时增加酒体复杂度,可用于低度酒的发酵生产[9]。但Mp与Sc混合发酵对火龙果酒特性的影响还未见有相关报道。
火龙果是一种广泛分布于我国南方地区的水果品种,包括红皮白肉、红皮红肉和黄皮白肉3种,富含多种营养物质[10]。贵州省2001年开始引种试种,作为全省农村产业革命重点发展的水果之一,截至2018年,全省火龙果总产量为4.6万吨,产值达4.1亿元。罗甸火龙果和关岭火龙果也已成为国家地理标志产品,受到国家层次的保护。由火龙果发酵生产的火龙果酒,香气独特,口感较佳,且兼具保健功能,深受消费者的喜爱[11]。但目前火龙果酒发酵菌株通常采用葡萄酒活性干酵母,菌株品种有限,发酵酒体单一,同质化较为严重。采用非酿酒酵母与酿酒酵母混合发酵,可较好的解决这一问题。因此,本研究采用非酿酒酵母Mp与Sc共接种,进行混合发酵,分析其对火龙果酒品质特性的影响。
新鲜红心火龙果:贵州省安顺市关岭县;赖氨酸固体培养基、WL营养琼脂鉴定培养基(Wallerstein laboratory nutrient agar):贵州博奥瑞杰生物科技有限公司;其余试剂均为国产分析纯;Mp:中国工业微生物菌种保藏管理中心;Sc ZYMAFLORE X16(简称X16):法国LAFFORT公司。
UH5300紫外分光光度计:日本日立公司;雷磁PHSJ-3F pH仪:上海仪电科学仪器股份有限公司;SA408B电子舌味觉系统:日本Insent公司;TQ8040NX气相质谱联用仪(GC-MS):日本岛津仪器有限公司。
1.3.1 菌株培养
酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基(yeast extract peptone eextrose medium,YEPD)(酵母浸粉 10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L)活化-80℃保存的Mp、Sc菌株。挑取Mp、Sc单克隆分别接种于YEPD液体培养基中,28℃,180 r/min培养24 h,备用。
1.3.2 发酵条件
取新鲜火龙果,去皮,打浆,调整糖度为24°Brix,pH值为3.5,加入40 mg/L二氧化硫、200 mg/L果胶酶,过夜处理。分装处理后的火龙果浆至2 L无菌三角瓶中,装量为70%。将培养好的Mp、Sc接种至火龙果浆中,使其Mp终浓度为107cfu/mL,Sc终浓度为106cfu/mL。接种方式为Mp+Sc组共同接种Mp和Sc菌株,Sc组单独接种Sc菌株。接种后,插上呼吸器,密封,室温(24℃)放置12 h。待发酵启动后,转移至18℃冷库中,静置发酵 16 d。分别在发酵的第 0、2、4、8、12、16 天取样,(1)称重,计算 CO2释放率;(2)测定 pH 值;(3)经适当浓度梯度稀释后,分别涂布在赖氨酸培养基和上,培养48 h计数,从而分析Mp、Sc菌株细胞个数。发酵结束后,离心,取上清液,分别用于常规理化指标、电子舌和气相质谱联用仪(gas phase mass spectrometer,GC-MS)检测。
1.3.3 测定条件
1.3.3.1 火龙果酒常规理化指标测定
参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定火龙果酒中乙醇体积分数、pH值、总酸、总糖。
1.3.3.2 火龙果酒感官特性测定
取80 mL火龙果酒样品至电子舌检测烧杯中。按照仪器说明书步骤,进行火龙果酒感官特性的检测。采样时间120 s,采样速度为1次/s,每个样品平行测定3次。
1.3.3.3 火龙果酒挥发性香气特性测定
采用顶空固相微萃取(solidphase microextraction,SPME)技术提取火龙果酒香气成分,参考李凯等方法对火龙果酒挥发性香气物质进行分析[11]。以环己酮为内标,采用内标法进行物质的定量分析。
1.3.4 数据整理与统计分析
采用Microsoft Excel 2010整理试验数据,并以平均值±标准差形式表示。采用SPSS 21.0软件进行数据显著性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。
酿造原料红心火龙果采摘于2018年9月贵州省安顺市关岭县,颜色粉红色,糖度为(9.1±0.01)°Brix,pH 值为 3.41±0.01(图 1)。
图1 本研究所用红心火龙果
Fig.1 Red pitaya used in this study
Mp和Sc以共接种的形式进行混合发酵火龙果酒,各菌群变化趋势如图2所示。
在发酵前4 d,非酿酒酵母Mp在总的酵母菌群中占较大的百分比,但其比例在不断降低,在发酵第8天基本上检测不到Mp菌群,发酵液中主要为Sc,一直维持到发酵结束。而酿酒酵母Sc随着发酵的不断进行,其菌群数量在不断增多,在发酵的第4天,在发酵液中所占比例超过Mp,并继续增加,在发酵第8天基本上很难检测到Mp菌群。
图2 共接种发酵火龙果酒酵母菌群动态变化
Fig.2 Dynamic changes of yeast population in pitaya wine fermentation with co-inoculation
龙果酒发酵过程中pH值和CO2释放率动态变化见图3。
图3 火龙果酒发酵过程中pH值和CO2释放率动态变化
Fig.3 Dynamic changes of pH and CO2emission rate using Sc or Mp+Sc
在火龙果酒发酵过程中,CO2释放率逐渐增大,且混菌发酵组(Mp+Sc)CO2释放率要高于Sc组,在发酵的第4天达到最大值。接着逐渐降低,在第8、12、16天,两组CO2释放率基本一致(图3A)。
随着火龙果酒的发酵,发酵液pH值在发酵前期(前 4 d)逐渐降低,发酵中后期(4 d~16 d)又增加,表现出先降低后增加的趋势。但变化幅度不大。发酵初始pH值为5.0,在第4天,Sc发酵液pH值为3.3,Mp+Sc发酵液pH值为3.4。发酵结束的第16天,两组发酵液pH值均又增大到3.5(图3B)。
Mp与Sc混合发酵火龙果酒基本理化指标如表1所示。
表1 火龙果酒理化指标
Table 1 Physical and chemical indicators of pitaya wine
注:* 表示差异显著,P<0.05。
挥发酸/(g/L)Mp+Sc 12.43±0.12 3.74±0.00 3.39±0.16 6.19±0.41 0.63±0.05*Sc 12.55±0.78 3.73±0.00 3.23±0.06 6.63±0.66 0.74±0.04菌种编号乙醇体积分数/% pH值 总酸/(g/L)总糖/(g/L)
与商业化酿酒酵母Sc组相比,混合发酵火龙果酒的乙醇体积分数、pH值、总糖3个指标与Sc组发酵火龙果酒没有区别。但混合发酵火龙果酒挥发酸显著低于纯种Sc发酵火龙果酒。
采用电子舌传感器,从酸味、苦味、涩味、后味、鲜味、咸味等方面分析Mp与Sc混合发酵对火龙果感官特性的影响。火龙果酒滋味属性雷达图见图4。
图4 火龙果酒滋味属性雷达图
Fig.4 Pitaya wine taste attribute radar chart
结果如图4所示,混合发酵火龙果酒酸味测定值显著小于Sc纯种发酵火龙果酒(P<0.05)。其它感官数值Mp+Sc组与Sc组之间无显著区别。
采用顶空固相微萃取-气质联用方法分析Mp与Sc混合发酵对火龙果香气特性的影响。火龙果酒中挥发性物质种类及含量见表2。
结果如表2所示,Mp+Sc混合发酵火龙果酒中共检测出46种挥发性物质成份,包括酸类物质3种、醇类物质16种、酯类物质18种、醛酮类物质3种、烃类物质2种、其它类物质4种;Sc纯种发酵火龙果酒中仅检测到39种挥发性物质,包括酸类物质3种、醇类物质13种、酯类物质16种、醛酮类物质2种、烃类物质2种、其它类物质3种。其中在醇类物质、酯类物质、醛酮类物质、其它类物质方面Mp+Sc混合发酵均增加了物质的种类。
表2 火龙果酒中挥发性物质种类及含量
Table 2 The aroma substances and their contents in pitaya wine
序号 挥发性化合物 分子式 M p+S c/(m g/L)S c/(m g/L)香气特征描述1 3-甲基戊酸 C 6 H 12 O 2 0.3 1±0.0 2 / 药草味,青香味2 己酸 C 6 H 12 O 2 / 0.3 7±0.0 2 杏仁味、干酪味、面包味3 2-甲基己酸 C 7 H 14 O 2 0.0 8±0.0 1 0.1 0±0.0 1 4 辛酸 C 8 H 16 O 2 2.8 4±0.1 4 2.4 2±0.2 3 酸腐、奶酪味、脂肪味∑酸类 3.2 3±0.1 7* 3.8 9±0.2 7 5 异戊烯醇 C 5 H 10O 0.1 0±0.0 1 /6 2,3-丁二醇 C 4 H 10 O 2 2.3 5±0.1 3 1.1 0±0.0 7 7 己醇 C 6 H 14 O 0.1 8±0.0 1 0.1 5±0.0 1 青草味、生青味8 2-庚醇 C 7 H 16 O 0.7 8±0.0 6 0.5 1±0.0 3 不愉快的特殊气味9 二异丁基甲醇 C 9 H 20 O 0.0 6±0.0 0 /1 0 正辛醇 C 8 H 18 O 0.3 4±0.0 2 0.7 3±0.0 4 茉莉、柠檬味1 1 芳樟醇 C 10 H 18 O 4.3 6±0.1 6 5.6 6±0.2 9 花香、麝香1 2 2-壬醇 C 9 H 20 O 0.3 9±0.0 2 0.5 1±0.0 2 蜡香、青香、奶油香、橙子香、柑橘香1 3 苯乙醇 C 8 H 10 O 1 4.5 6±0.5 7 1 6.6 1±0.9 2 玫瑰味、蜂蜜味1 4 熏衣草醇 C 10 H 18 O 0.1 5±0.0 1 0.2 7±0.0 1 薰衣花香1 5反式-菊酰基乙醇C 10 H 18 O 0.1 5±0.0 2 0.2 2±0.0 2 1 6 α-松油醇 C 10 H 18 O 0.3 7±0.0 1 0.3 3±0.0 1 樟脑味、辛辣味1 7 橙花醇 C 10 H 18 O 0.7 3±0.0 4 0.9 4±0.0 7 蔷薇花香1 8 香茅醇 C 10 H 20 O 1.3 3±0.0 7 2.0 2±0.1 3 玫瑰香气1 9 香叶醇 C 10 H 18 O / 1.4 2±0.1 0 花香、水果香2 0 1-十七烷醇 C 17 H 36 O 0.2 3±0.0 1 /2 1 (E)-2,7-二甲基-2,6-二烯-1-辛醇C 9 H 15 O 1.5 2±0.1 7 /∑醇类 2 7.6 1±1.3 1*3 0.4 6±1.7 2 2 2 乙酸异丁酯 C 6 H 12 O 2 0.1 7±0.0 1 0.0 8±0.0 1 水果香、花香2 3 丁酸乙酯 C 6 H 12 O 2 0.9 1±0.0 7 0.4 6±0.0 2 菠萝、香蕉、苹果香2 4 乳酸乙酯 C 5 H 10 O 3 1.7 0±0.1 2 1.0 5±0.1 0 水果香、奶油味2 5 乙酸异戊酯 C 7 H 14 O 2 1.9 5±0.1 3 2.0 1±0.1 5 香蕉味2 6 2-甲基丁基乙酸酯C 7 H 14 O 2 0.4 1±0.0 3 0.2 8±0.0 1 香蕉、苹果味2 7 己酸乙酯 C 8 H 16 O 2 2 1.3 0±1.9 6 2 3.3 8±1.1 4 甜香、水果香、窖香2 8 异戊乳酸酯 C 8 H 16 O 3 0.1 8±0.0 1 0.2 1±0.0 2 2 9 丁二酸二乙酯 C 8 H 14 O 4 1.4 9±0.0 9 1.2 4±0.1 1 果香、瓜香3 0 辛酸乙酯 C 10 H 20 O 2 5 2.5 2±1.4 5 5 2.0 4±1.3 4 香蕉、梨、花香
续表2 火龙果酒中挥发性物质种类及含量
Continue table 2 The aroma substances and their contents in pitaya wine
注:* 表示差异显著,P<0.05;/表示未检测到。
序号Sc/(mg/L)香气特征描述31 苯乙酸乙酯 C10H12O20.38±0.04 0.31±0.02 蜂蜜香、玫瑰香、水果香32 壬酸乙酯 C11H22O20.24±0.01 0.20±0.01 玫瑰香,果香、酒香33 4-甲基水杨酸甲酯挥发性化合物 分子式 Mp+Sc/(mg/L)C9H10O3 0.66±0.05 0.52±0.04 34 癸酸乙酯 C12H24O220.59±0.89 16.80±0.62 葡萄、果香、脂肪香35 辛酸异戊酯 C13H26O20.26±0.03 / 水果香36 月桂酸乙酯 C14H28O22.92±0.30 2.07±0.18 脂肪味、果香37 δ-己醇内酯 C6H10O2 0.05±0.00 /38N-甲氧羰基-L-脯氨酸十八烷基酯C25H47O4 0.21±0.01 /39 2,4-二叔丁基苯基-5-羟基戊酸酯C19H30O3 0.46±0.02 0.46±0.03 40 3-甲基-2-丁烯-1-基-丁酸酯C9H16O2 / 0.16±0.01∑酯类 106.4±3.78 101.25±3.81 41 2,4-二甲基苯甲醛C9H10O 1.43±0.11 1.10±0.08 42(E)-1-(1,2,2三甲基环戊烷基)戊-2-烯-1,4-二酮C13H20O2 0.02±0.00 /43 2-庚酮 C7H14O 0.18±0.01 0.16±0.01 香蕉香、药香∑醛酮类 1.63±0.12* 1.26±0.09 44 1-(1-乙氧基)戊烷C9H20O2 0.18±0.01 0.12±0.01 45 2,3,5-三甲基癸烷C13H28 0.33±0.03 /46 环十六烷 C16H32 / 0.22±0.02∑烃类 0.51±0.04* 0.34±0.03 47 甲氧基苯肟 C8H9NO20.17±0.01 0.16±0.01 48 3,6-二氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃C10H16O 0.21±0.01 0.23±0.02 49二叔丁基对甲酚C15H24O 1.20±0.10 0.73±0.04 50 3-乙氧基-3-甲基-1-丁烯C7H14O 0.09±0.01 /∑其它类 1.66±0.13* 1.11±0.07
尽管Mp+Sc混合发酵火龙果酒中酸类物质和烃类物质的种类均比Sc组增加,但这些类物质总量却未增加。Mp+Sc组、Sc组酸类物质总量分别为(2.84±0.14)、(2.42±0.23)mg/L,烃类物质总量分别为(0.51±0.04)、(0.34±0.03)mg/L。另外,Mp+Sc混合发酵火龙果酒中既增加了酯类物质、醛酮类物质、其它类物质的种类和含量。
醇类是酒类中含量较高的一类化合物,主要呈现出清香和清鲜香气。混合发酵增加了醇类物质种类,Mp+Sc发酵火龙果酒中检测到16种醇类物质,比Sc单独发酵多3种。但混合发酵并未增加醇类物质总量,相反醇类物质总量低于Sc纯种发酵火龙果酒,两种发酵火龙果酒中醇类物质总量分别为(27.61±1.31)mg/L和(30.46±1.72)mg/L(图 5)。
图5 火龙果酒中挥发性物质含量
Fig.5 Contents of aroma substances in pitaya wine
高级醇,又称杂醇油,是碳原子数大于2的脂肪族醇类的统称。分析发现,Mp+Sc混合发酵火龙果酒中高级醇的含量也较Sc发酵火龙果酒中低。
酯类物质是各种酒中主要呈香物质之一,阈值一般较低,常具有各种花香和水果香。在2种火龙果发酵果酒中主要的酯类物质均为辛酸乙酯、己酸乙酯和葵酸乙酯,在Mp+Sc混合发酵火龙果酒中其占酯类物质比例分别为49.36%、20.02%、19.35%,在Sc纯种发酵火龙果酒中其占酯类物质比例分别为51.40%、23.09%、16.59%。辛酸异戊酯、δ-己醇内酯和N-甲氧羰基-L-脯氨酸十八烷基酯是Mp+Sc混合发酵火龙果酒中特有酯类物质;3-甲基-2-丁烯-1-基-丁酸酯是Sc纯种发酵火龙果酒中特有酯类物质。混合发酵火龙果酒中酯类物质总量高于Sc纯种发酵火龙果酒中含量。
风味活性值(odour activity value,OAV)为香气物质浓度与该物质阈值的比值,用来评价食品中香气物质的贡献度。一般OAV>1,认为该物质对香气成分有着突出的贡献度。反之,OAV<1,认为该物质对香气成分贡献度不大。分析了2种发酵火龙果酒中19种主要的挥发性香气物质OAV值,见表4。
表4 火龙果酒中主要香气物质OAV
Table 4 The OAV of main aroma substances in pitaya wine
注:/表示未检测到。
序号挥发性化合物阈值/(μg/L)OAV Mp+Sc Sc 1 丁酸乙酯 81.5 11.16 5.64 2 乙酸异戊酯 93.93 20.76 21.40 3 己酸乙酯 55.33 384.96 422.56 4 辛酸乙酯 12.87 4 080.81 4 043.51 5 壬酸乙酯 3 150.61 0.08 0.06 6 苯乙酸乙酯 1000 0.38 0.31 7 癸酸乙酯 1 122.3 18.35 14.97 8 丁二酸二乙酯 100 000 0.01 0.01 9 月桂酸乙酯 640 4.56 3.23 10 正辛醇 1 100 0.31 0.66 11 己醇 1 100 0.16 0.14 12 辛醇 40 8.5 18.25 13 苯乙醇 10 000 1.46 1.66 14 芳樟醇 15 290.67 377.33 15 香叶醇 130 / 10.92 16 香茅醇 180 7.39 11.22 17 α-松油醇 250 1.48 1.32 18 辛酸 500 5.68 4.84 19 己酸 420 / 0.88 19 己酸 420 / 0.88
发现OAV>1的物质有13种,OAV<1的有6种。在Mp+Sc混合发酵火龙果酒中OAV>1的有12种,OAV值最大的是辛酸乙酯,为4 080.81,OAV<1有7种,OAV值最小的为丁二酸二乙酯,为0.01。
由于NSc最初是在变质的葡萄酒中分离出来的,因此,传统观点认为其为葡萄酒酿造中的腐败菌群,一直未受到重视。但越来越多的研究表明,NSc在葡萄酒、多种果酒的酒体形成过程中发挥积极作用,有助于增加酒体的丰富性和感官特性[12]。因此,近年来对NSc生物多样性、酿酒特性及相关应用研究成为国内外的研究热点之一。其研究领域也由葡萄酒领域拓展到多种果酒领域,如刺梨果酒[13]、野樱莓果酒[14]、柿子果酒[15]、蜜桔果酒[16]等。但NSc对火龙果酒品质的影响还未知。本研究以Mp与Sc共接种的方式进行了火龙果酒的发酵,以Sc纯种发酵为对照,结果表明,Mp与Sc混合发酵降低了火龙果酒中挥发酸的含量,增加了挥发性物质的种类和含量,如酯类、醛酮类、烃类等,使得酒体丰富度更加复杂。
研究表明,Mp中的某些菌株可分泌多种酶类,如果胶酶、蛋白酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、亚硫酸盐还原酶、木聚糖酶、脂肪酶等,其中一些酶作用于相关底物,有助于风味物质的释放[6,17-18]。本研究发现,采用Mp与Sc混合发酵增加了多种酯类物质的种类和含量,以及多种醇类物质的种类。这可能与Mp分泌的一些酶类相关,因此,在后续的研究中,将深入分析所用Mp菌株酶学特性,剖析挥发性香气物质产生机理。
本研究还进一步分析了混合发酵过程中Mp菌群动态变化,发现随着发酵的不断进行,Mp在发酵菌群中所占比例逐渐降低,在发酵第4天所占比例低于50%,在发酵的第8天开始,发酵液中很难检测到Mp菌群了。通常情况下,Mp对酒精较为敏感,对酒精的耐受性较差,随着酒精发酵的不断进行,逐渐死亡,故Mp主要在酒精发酵的前期发挥作用,产生多种挥发性物质,丰富酒体。因此,研究报道,采用Mp与Sc混合发酵有助于降低发酵酒的乙醇含量,可用于低度果酒的生产[19]。但本研究中,混合发酵火龙果酒乙醇含量与Sc纯种发酵火龙果酒相比,未见有显著区别,可能与菌株本身特性,或者接种方式有关。
此外,Mp还可产生抗菌物质普切明(pulcherrimin),通过竞争性吸收环境中的铁离子,抑制其它微生物对铁离子的需求,可作为一种光谱性抗菌剂[20-22]。因此,在果酒生产中,采用Mp作为生产菌种,通过生物防控,可有效抑制野生杂菌,减少二氧化硫的使用量。
综上,本研究首次分析了Mp与Sc混合发酵对火龙果酒特性的影响。结果表明,Mp与Sc混合发酵可有效降低火龙果酒中挥发酸含量,增加酒体中酯类、醇类、醛酮类、烃类等挥发性物质的种类,降低了酸类、醇类物质的含量。此外,Mp与Sc混合发酵还降低了酸味感官特性。因此,Mp与Sc混合发酵是一种可以推荐的火龙果酒的生产方式,既增加了酒体的复杂度,又降低了同质化现象。但本研究仅分析了Mp与Sc混合发酵的一种接种方式,一种接种比例,更多的发酵方式还需要分析比较,从而确定较优的生产方式。
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