葛根为豆科植物葛根Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根[1]，是我国最常见的中药之一，始载于《神农本草经》[2]。现代医学研究表明，葛根中含有的黄酮类成分葛根素对糖尿病、高血压、高血脂和心脑血管等疾病有一定疗效，葛根中总黄酮对中年妇女和绝经妇女养生保健作用明显。药用价值极高的葛根，素有“亚洲人参”之美誉，2002年被国家原卫生部正式批准为“药食同源”植物，近年来，含葛根的食品及保健食品层出不穷，主要有葛根黄酮类功能食品、葛根低聚糖食品、葛根奶粉、葛根挂面、葛根软糖等营养食品。
研究表明葛根除含有黄酮等功效成分外，还含有丰富的氨基酸，尤其是人体不能合成的必需氨基酸含量更高。氨基酸是蛋白质的基本组成单位，所以对于葛根蛋白的研究十分有意义，但受蛋白提取率低的影响，目前关于葛根蛋白的研究很少。仅有文献报道[3]利用Tris-HCl法提取粉葛蛋白，并没对其功效进行研究。
随着近年来对于植物蛋白研究开发的重视，本研究在前期预试验基础上，以葛根为原料，通过碱提酸沉法提取葛根蛋白，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken响应面分析法对葛根蛋白提取工艺进行优选，并对最优条件下提取的葛根蛋白的抗氧化活性进行表征。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
葛根：吉林省长春市同仁堂大药房，产地河北省保定市，批号20190704，经长春中医药大学药学院姜大成教授鉴定为豆科植物葛根Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根；Bradford蛋白浓度测定试剂盒、牛血清蛋白标准溶液：天根生化科技有限公司；硫酸铵、氢氧化钠、98%浓盐酸（均为分析纯）：北京化工厂。
SKD-200型凯氏定氮仪：上海沛欧分析仪器有限公司；DT5-2B型低速台式离心机：北京时代北利离心机有限公司；KQ3200B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；UV-1700型紫外分光光度计：岛津（上海）仪器有限公司；FDU-1200型冷冻干燥机：EYELA东京理化器械株式会社。
1.2 方法
1.2.1 葛根提取物中蛋白含量测定
采用考马斯亮蓝Bradfrod法测定葛根提取物中蛋白质含量。标准曲线绘制：分别取 0、10、20、30、40、50、60 μL牛血清蛋白标准溶液（1 mg/mL）加入磷酸盐缓冲溶液（phosphatebufferedsaline，PBS）补足到150μL。向各试管中加入2.85 mL考马斯亮蓝染液，混匀，室温（25℃）放置5 min，采用紫外分光光度计在595 nm处测定吸光度值。以牛血清蛋白质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，通过标准曲线得到线性回归方程：y=0.013 3x+0.027 9，R2=0.999 7。葛根提取物中蛋白质含量根据上述回归方程求得。
1.2.2 提取率计算公式
1.2.3 葛根蛋白等电点测定
根据预试验结果，称取适量葛根药材，按料液比1∶25（g/mL）加入蒸馏水，调节pH值至10，在水浴温度45℃下浸提2.5 h，4 000 r/min离心，得上清液。上清液分别用1 mol/L HCl调pH值至1 ～7，静置离心，收集沉淀，冷冻干燥后称重，以pH值为横坐标，沉淀质量为纵坐标，绘制标准曲线，沉淀量最大处的pH值[4]即为葛根蛋白的等电点。
1.2.4 不同提取方法比较
通过文献查阅结合预试验结果制定出4种葛根蛋白提取方法，如下：
方法1[5]：葛根药材→蒸馏水40℃浸提→离心（4 000 r/min，20 min）→上清液→硫酸铵分级沉淀→静置→离心取沉淀（4 000 r/min，20 min）→沉淀用蒸馏水透析、浓缩→冷冻干燥→葛根蛋白样品。
方法2：葛根药材→碱液浸提（加入NaOH→调pH值→置于恒温水浴）→离心（4 000 r/min，20 min）→上清液→加HCl调pH值至等电点→离心（4 000 r/min，20 min）→沉淀用蒸馏水透析、浓缩→冷冻干燥→葛根蛋白样品。
方法3[6]：葛根药材→70%乙醇浸提→振荡1 h→离心（4 000 r/min，20 min）→上清液→盐析→静置→离心取沉淀（4 000 r/min，20 min）→沉淀用蒸馏水透析、浓缩→冷冻干燥→葛根蛋白样品。
方法4[7]：葛根药材→加入50 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-HCl→50℃浸提0.5h→离心（4000r/min，20min）→透析、浓缩→冷冻干燥→葛根蛋白样品。
针对以上4条工艺路线，以葛根蛋白提取率为评价指标，筛选葛根蛋白最佳提取方法。
1.2.5 单因素试验
以葛根蛋白提取率为评价指标，通过单因素试验考察提取温度（30、35、40、45、50 ℃）、提取时间（1、1.5、2、2.5、3h）、料液比[1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）]3个因素对葛根蛋白提取效果的影响。
1.2.6 Box-Behnken响应面试验设计
在单因素试验基础上，采用响应面法中Box-Behnken中心组合试验设计原理[8]，以提取温度（A）、提取时间（B）、料液比（C）为自变量，提取率（Y）为响应值，试验因素水平见表1。
表1 Box-Behnken响应面试验因素水平表
Table 1 Box-Behnken response surface test factor level table
水平A提取温度/℃B提取时间/hC料液比/（g/mL）-1 40 1.5 1∶15 0 45 2 1∶20 1 50 2.5 1∶25
1.2.7 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）
分离胶浓度为15%、浓缩胶浓度为5%，样品和Marker上样量均为20 μL。采用垂直板电泳，条件为浓缩胶电压70 mV，分离胶电压140 mV。电泳结束后用考马斯亮蓝R250染色，脱色液脱色至条带清晰[9]。
1.2.8 葛根蛋白体外抗氧化试验
1.2.8.1 DPPH自由基清除能力测定
取不同浓度葛根蛋白溶液1mL于试管中，加入3mL 0.004% DPPH溶液，混匀于暗室反应30 min，在517 nm处测定吸光度值A1；空白组为1mL蒸馏水和3mL0.004% DPPH溶液，测定吸光度值A0；样品对照组用3 mL甲醇代替DPPH溶液，测定吸光度值A2。以甲醇作为空白调零，VC作为阳性对照组[10]。清除率计算公式如下：
1.2.8.2 羟基自由基清除能力测定
取不同浓度葛根蛋白溶液1 mL于试管中，加入1 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶液和1.5 mL 0.2 mol/L PBS，混匀，再加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 0.01% H2O2溶液，充分混匀，37℃水浴反应1 h，在536 nm处测定吸光度值A1；正常组以2 mL蒸馏水代替1 mL样品溶液和1 mL 0.01% H2O2溶液，测定吸光度值A0；阴性组以1 mL蒸馏水代替样品，测定吸光度值A2；样品对照组以3mL蒸馏水代替1mL 0.75mmol/L邻二氮菲溶液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 0.01% H2O2溶液，测定吸光度值A3。以蒸馏水作为空白调零，VC作为阳性对照[11]。清除率计算公式如下。
1.2.8.3 总还原能力测定
取1 mL不同浓度葛根蛋白于试管中，分别加入2.5 mL 0.2 mol/L PBS 和 2.5 mL 1% K3Fe（CN）6溶液，50℃水浴反应20min，冷却，加入2.5mL10%三氯乙酸，离心，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1% FeCl3溶液，摇匀，静置，在700nm处测定吸光度值A1；以 2.5mL 蒸馏水代替 2.5mL1% K3Fe（CN）6溶液，其余步骤相同，测定吸光度值A2。以蒸馏水作为空白调零，VC作为阳性对照组[12]。总还原能力计算公式如下。
1.3 统计处理
每个试验重复3次，结果以均值±标准差表示。采用软件Origin 8.0进行图表制作，Design-Expert V8.0.6软件进行响应面试验设计及相应数据处理。
2 结果与分析
2.1 葛根蛋白等电点测定结果
葛根蛋白等电点测定结果见图1。
图1 葛根蛋白等电点测定
Fig.1 Determination of isoelectric point of Pueraria lobata protein
当pH值为3.5时，沉淀质量最大。这是因为当蛋白质溶液pH值处于等电点时，蛋白质分子表面不带电荷呈电中性，分子间的斥力减弱，容易受静电引力[13]影响聚集而产生沉淀，所以葛根蛋白的等电点为3.5。
2.2 不同提取方法比较结果
以葛根蛋白提取率为评价指标，筛选葛根蛋白4种不同提取方法，结果见表2。
由表2筛选结果可知，方法2葛根蛋白提取率明显高于其它方法，其原因可能是碱提酸沉法重现性好，有机溶剂易使蛋白失活[14]，盐析法提取蛋白不充分[15]，故选择方法2作为葛根蛋白提取优选工艺。
表2 葛根蛋白不同提取工艺比较研究
Table 2 Comparison of different extraction methods of Pueraria lobata protein
提取方法 提取率/%方法 1 9.35±0.13方法 2 10.11±0.08方法 3 7.39±0.24方法 4 8.28±0.11
2.3 单因素试验结果与分析
2.3.1 温度对提取率的影响
温度对提取率的影响如图2所示。
图2 温度对葛根蛋白提取率的影响
Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of Pueraria lobata protein
随着温度升高，葛根蛋白提取率随之增加，当温度为45℃时，葛根蛋白提取率达到最大值。而温度继续升高，曲线呈下降趋势，主要原因是温度过低时蛋白不能充分溶解在提取溶剂中，而温度过高又极易引起蛋白质的变性[16]。
2.3.2 提取时间对提取率的影响
提取时间对提取率的影响如图3所示。
图3 提取时间对葛根蛋白提取率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of Pueraria lobata protein
葛根蛋白提取率随着提取时间延长，呈先增加后降低的趋势。主要原因是提取时间延长，能促进颗粒胞膜的破裂，有利于蛋白质的析出。
图4 料液比对葛根蛋白提取率的影响
Fig.4 Effect of material liquid ratio on extraction rate of Pueraria lobata protein
2.3.3 料液比对提取率的影响
料液比对提取率影响结果如图4。
在溶剂体积较小时，葛根药材提取不完全，导致蛋白提取率低。当料液比为1∶20（g/mL）时，葛根药材能够充分溶解，蛋白提取率达到最大值。
2.4 响应面优化试验结果与分析
2.4.1 回归模型的建立与数据分析
根据单因素试验结果，以葛根蛋白提取率为评价指标，对提取温度（A）、提取时间（B）和液料比（C）进行三因素三水平响应面优化设计，结果见表3。
表3 响应面试验设计与结果
Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis
试验号 A B C 提取率/%1-1 0 -1 9.00 2 0-1 1 10.86 3 1 0-1 8.37 4-1 0 1 9.82 5 0 1 1 11.04 6-1 10.75 7 0 0 0 11.45 0 1 8-1 -1 0 8.92 9 0 0 0 11.64 10 1 -1 0 8.29 11 0 0 0 11.25 12 0 0 0 11.05 13 0 0 0 11.44 14 1 1 0 9.15 15 0 -1 -1 9.06 16 1 0 1 8.29 17 -1 1 0 9.20
通过Design-Expert V8.0.6软件对表3数据进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程：Y=-172.65+7.03A+9.26B+1.59C+0.06AB-6.68AC-0.17BC-0.08A2-1.92B2-0.02C2。对试验数据模型进行方差分析，结果见表4。
表4 响应面二次回归方程模型方差分析结果
Table 4 The results of quadratic regression model for response surface
注：**P<0.01为差异极显著；*P<0.05为差异显著。
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P 显著性模型 22.93 9 2.55 34.45<0.000 1 **A-提取温度 0.81 1 0.81 10.99 0.012 9 *B-提取时间 1.13 1 1.13 15.31 0.005 8 **C-料液比 1.22 1 1.22 16.45 0.004 8 **AB 0.084 1 0.084 1.14 0.321 7 AC 0.093 1 0.093 1.26 0.299 1 BC 0.57 1 0.57 7.71 0.027 5 *A2 16.24 1 16.24 219.68<0.000 1 **B2 0.97 1 0.97 13.09 0.008 5 C2 0.77 1 0.77 10.38 0.014 6 *残差 0.52 7 0.074失拟项 0.38 3 0.13 3.83 0.113 7纯误差 0.13 4 0.033总离差 23.45 16
由方差分析结果可知，模型F值为34.45，P<0.000 1，表明该模型差异极显著；失拟项P=0.113 7>0.05，表明失拟项不显著，即模型与试验的差异较小，可以说明其它因素对试验结果的干扰较小，残差是由随机误差引起的，能充分反映各因素和响应值之间的关系；模型的相关系数R2=0.999 7，说明试验数据与回归模型拟合度良好，因此该模型可用来分析葛根蛋白提取工艺条件。
对模型进行回归方程系数显著性检验，A、BC、C2对提取率的作用显著（P<0.05），B、C、A2对提取率作用极显著（P<0.01）。比较F值大小可知影响提取率的主次顺序为：料液比＞提取时间＞提取温度。
2.4.2 响应面各因素交互作用分析
运用Design-Expert V8.0.6软件，分析响应面优化试验结果，得到响应面曲面图，该图形能直观地反映各因素及其交互作用对响应值的影响。试验结果见图5。
由图5可知，提取温度和提取时间的等高线呈椭圆形，响应面较陡，随着提取温度和提取时间的增加，提取率逐渐增高并达到极值，之后缓慢下降，表明二者交互作用较为显著；提取时间与料液比的等高线密集，响应面曲线陡峭，随着提取时间与溶剂体积的增加，提取率越来越高，达到极值后逐渐下降，表明两者之间交互作用显著；提取温度与溶剂体积的等高线密集，响应面曲线陡峭，随着提取温度与溶剂体积的增加，提取率越来越高，达到极值后逐渐下降，表明两者之间交互作用极显著。
通过对回归模型方程求解，得出葛根蛋白最佳提取工艺为：提取温度47.06℃，提取时间2.18 h，料液比1∶21.50（g/mL），提取率为 11.99%。
图5 响应面与等高线分析图
Fig.5 Response surface and contour analysis diagram
2.4.3 验证试验
考虑实际情况，将响应面法优化的最佳提取工艺条件参数修正为：提取温度45℃，提取时间2 h，料液比为1∶20（g/mL）。并对修正后的工艺参数进行3次验证试验，得到葛根蛋白平均提取率为11.73%，与预测值相近。在此条件下，葛根蛋白含量可达到60.18%。说明模型能较好地预测葛根蛋白的提取率，优化得到的工艺参数准确可靠。
2.5 SDS-PAGE结果
通过优选工艺得到的葛根蛋白的SDS-PAGE结果见图6。
图6 葛根蛋白SDS-PAGE图
Fig.6 SDS-PAGE of Pueraria lobata protein
M.Marker；1.葛根蛋白样品1；2.葛根蛋白样品2。
由图6可知，通过碱提酸沉法提取的两批葛根蛋白样品分子量主要集中在14.0 kDa ～43.0 kDa。
2.6 葛根蛋白体外抗氧化试验结果
葛根蛋白的体外抗氧化活性结果见图7。
由图7（a）可知，在0.02 mg/mL ～0.8 mg/mL范围内，葛根蛋白DPPH自由基清除能力随着浓度的增大而增强，当其浓度达到0.8 mg/mL时，DPPH自由基清除率高达51.15%，但清除效果弱于阳性对照组VC，计算得到葛根蛋白清除DPPH自由基的IC50值为0.78 mg/mL。
图7 不同评价方法测定葛根蛋白抗氧化活性
Fig.7 Determination of antioxidant activity of Pueraria lobata protein by different evaluation methods
由图7（b）可知，葛根蛋白对羟基自由基的清除能力在0.05 mg/mL至2.25 mg/mL的浓度范围内随着浓度的增大而增强，呈现较为明显的量效关系，当其浓度达到2.25 mg/mL时，羟基自由基清除率达到88.62%，清除能力与2.25 mg/mL VC相当。通过计算可知葛根蛋白清除羟基自由基的IC50值为1.89 mg/mL。
亚铁氰化钾在酸性条件下与铁离子反应生成有色物质，在700 nm处总还原能力随着溶液浓度变大，其吸光度值变大，则总还原能力越强。由图7（c）可知，葛根蛋白的总还原能力虽然也随着浓度的增大而增加，表明葛根蛋白具有一定还原能力，并呈现一定的量效关系，但与阳性对照组VC相比，其还原能力较弱。
3 结论
本文在单因素试验的基础上，通过Box-Behnken响应面试验设计，得到葛根蛋白最佳提取工艺为：提取温度 45℃，提取时间 2 h，料液比 1∶20（g/mL）。在此条件下进行验证试验，葛根蛋白提取率为11.73%。葛根蛋白的SDS-PAGE结果表明，葛根蛋白分子量主要分布在14.0 kDa ～43.0 kDa。此外，通过体外抗氧化试验充分证明了葛根蛋白具有较强的DPPH自由基和羟基自由基清除能力，同时葛根蛋白还具有一定的还原能力。本研究可为葛根蛋白的深度开发提供一定的理论依据。
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