枸杞子（Fructus lycii）是枸杞果实的干制品，具有很高的食用价值，有着悠久的应用史[1]。枸杞子具有抗氧化、预防视网膜损伤、抗细胞凋亡等作用[2-4]。就我国枸杞的种植情况上看，比较知名的有宁夏枸杞、新疆枸杞等，其中包括3个变异品种[5]。近年来，对枸杞大部分的研究发现，碳水化合物占枸杞子总重的45% ～50%，其中包括丰富的枸杞多糖，枸杞多糖的得率大部分在1% ～4%之间。蛋白质占枸杞子总重的10% ～15%[6]。除此以外，枸杞子中还包括一些黄酮类、生物碱和维生素类物质，占比不超过枸杞子总重的0.02%。经了解，枸杞多糖属于细胞内源性物质，该糖是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和鼠李糖组成，具有很高的潜在利用价值[7]。
Song等[8]研究显示持续的光照会引起视网膜组织的损伤，其机制可能是因为长时间光照过程促使视网膜产生过量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），从而引起视网膜功能受损。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞是一种光感受器细胞，虽然本身具有一定的抗氧化能力[9-11]，但长时间在强光环境下工作，自由基含量上升，会引起RPE层细胞功能受损。这种损害使得黄斑区光感受器细胞功能下降，伴有视力受损，同时造成脉络膜新生血管的生成。
为了探究枸杞子对小鼠视网膜的保护作用，拟采用枸杞多糖粗提物为原料，以光损伤小鼠为模型，通过视网膜电图和光学相干断层成像等相关视网膜生理指标检测，探讨枸杞子对光损伤小鼠视网膜的影响，以期为枸杞子视力保护产品的开发提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料及试剂
基础饲料：斯贝福（北京）生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定试剂盒、喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）试剂盒：南京建成生物工程研究所；三氯乙醛（AR>99%）：上海麦克林生化科技有限公司；复方托吡卡胺滴眼液：参天制药（中国）有限公司；氧氟沙星眼膏：沈阳兴齐眼药股份有限公司。
FA2004型分析天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；EPIC-4000视网膜电图（ERG）仪：美国LKC科技有限公司；MicronⅣ光学相干断层扫描（OCT）仪器：美国Phoenix研究实验室；LS C300dⅡ型LED灯：深圳市爱图仕影像器材有限公司；U-3900Hitachi紫外分光光度计：日立科学仪器有限公司。
1.2 枸杞多糖粗提物制备
称取枸杞子（符合2015版《中华人民共和国药典》标准）药材，每次提取水量为药材体积6倍，提取3次，合并提取液，提取液经浓缩得到水提物浸膏，再经醇沉（含乙醇量为80%）、干燥，制得枸杞多糖粗提物（每克枸杞多糖粗提物含枸杞子生药3.488 g）。参考蔡红梅等[10]的粗多糖检测方法（苯酚硫酸法）检测得到枸杞子中粗多糖含量为2.77%。
1.3 实验动物
健康雄性 C57BL/6J小鼠，6 周龄，（18±1）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司[许可证号为SCXK（京）2016-0002]，饲养于天津科技大学实验动物中心[（23±2）℃，相对湿度55%，明暗循环为12 h/12 h]，摄食和饮水自由。本研究的所有实验程序均按照天津科技大学动物实验伦理委员会批准的方案进行。
1.4 光损伤模型制备及动物分组
动物适应1周后，实验分组，每组12只，采用灌胃方式分别对5组实验动物给药，其中正常组（NOR）和光损伤模型组（MOD）每天每只灌胃无菌生理盐水0.2 mL；根据前期预实验结果，枸杞子低（GQL）、中（GQM）和高剂量组（GQH）的给药剂量分别为每天280、370、460 mg/kg bw，连续给药8周。实验组小鼠在第9周进行强光照射，光强为（9 000±500）Lux，每天照射 4 h，连续照射7 d，照射期间正常进食与饮水。光照结束后进行视网膜电图（electroretinogram，ERG）和光学相干断层成像（optical coherence tomography，OCT）等生理指标检测。
其中，模型制备在无自然光干扰下进行。将光照器放在有自动调温功能的箱体中，悬挂于小鼠顶端50 cm处，采用垂直照射方式照射，排除温度升高引起小鼠视网膜光热损伤的可能。
1.5 体重及摄食量记录
体重及摄食量自给药开始后进行记录，其中，体重每周称量1次。摄食量每天记录1次，最后计算8周以来总的均值。
1.6 视网膜电图检测
ERG是由光诱发的电生理反应。C57BL/6J小鼠的视网膜以视杆细胞为主，0.01 cd/m2下的b波反映小鼠视杆系统的功能，3.0 cd/m2下的b波反映视网膜双极细胞的功能，因此，本实验以视网膜电图中的b波来判断视网膜功能的受损程度。
小鼠在检查前进行避光处理12 h。配制5%的水合氯醛溶液，采用0.01 mL/g体重的剂量对小鼠进行腹腔注射，麻醉后用0.1 mg/mL硫酸阿托品滴眼液进行散瞳处理。整个实验过程在红光下进行，记录视网膜电图，记录电极为角膜环形电极，参考电极接近眼的面部皮肤，接地电极接尾部。电位放大器的通频带宽为0.3 Hz～300 Hz。实验结束后对小鼠眼球表面涂抹氧氟沙星眼膏，防止眼球长时间干燥引起小鼠眼球脱水。
1.7 光学相干断层成像
麻醉方法同1.6，小鼠经水合氯醛溶液腹腔注射后麻醉。待小鼠四肢无反应并脊背无弓起现象后将其放置于固定架上，滴加散瞳药，然后将小鼠右眼球与镜面紧贴，眼球位置摆正后进行观察。实验结束后迅速涂抹眼膏，防止眼球长时间暴露于空气中引起眼球脱水。
1.8 视网膜组织氧化指标检测
参照陈春艳等[11]的研究方法，取各组小鼠眼球，体式显微镜下分离视网膜，并制备视网膜组织匀浆。根据试剂盒说明检测各项指标。
1.9 统计学分析
采用SPSS20.0软件进行统计学处理，结果以
±s表示，P＜0.05表示组间具有统计学差异。
2 结果分析
2.1 体重与摄食量
小鼠体重与摄食量见表1。
表1 体重与摄食量
Table 1 Body weight and food intake
注：上标字母不同表示组间具有统计学差异（P＜0.05）。
分组初始体重/g最终体重/g摄食量/（g/d）NOR 22.15±2.17a 32.04±2.13a 4.7±0.3a MOD 21.91±2.32a 30.21±3.11a 4.6±0.2a GQL 22.06±2.21a 26.12±2.19b 4.6±0.4a GQM 22.22±2.07a 27.02±2.18b 4.5±0.3a GQH 21.86±2.29a 27.16±2.53b 4.6±0.3a
如表1所示，各组小鼠初始体重较模型组无统计学差异（P＞0.05）。从最终体重上看，药物干预组体重较正常组和模型组有所下降，与模型组比较，GQL、GQM、GQH均具有统计学差异（P＜0.05）。从摄食量上来看，各组动物摄食量无统计学差异（P＞0.05）。
2.2 ERG结果分析
ERG结果分析见图1。
图1 视网膜电生理b波振幅
Fig.1 ERG b-wave amplitude of retina in each group
A.0.01b；B.3.0 b；上标字母不同表示组间具有统计学差异（P＜0.05）。
如图1所示，ERG的振幅越高，说明小鼠眼球对光的反应越敏感，属于一种功能性检测。比较0.01 b波和3.0 b波处各组动物，药物干预组振幅高于模型组。从 0.01 b波来看，NOR、MOD、GQL、GQM 和 GQH 组振幅分别为（59.38±2.35）、（50.49±3.12）、（53.55±1.12）、（54.26±3.26）μV 和（55.12±2.38）μV，与模型组比较，枸杞子低、中、高剂量组振幅显著升高（P＜0.05）。从3.0 b波上看，NOR、MOD、GQL、GQM和GQH组振幅分别为 （57.48±5.2）、（48.12±3.12）、（52.58±4.8）、（54.42±3.28）μV 和（55.25±4.26）μV，说明枸杞多糖粗提物对光损伤小鼠视网膜具有修复作用，并且粗提物的剂量越高，其修复效果越好。
2.3 OCT结果分析
光学相干断层扫描法是利用眼内不同组织对光的反射性的不同，分析出不同组织的结构及其厚度，结果见图2和表2。
从OCT伪彩图中可以看到，损伤后RPE层出现明显病变，其组织较正常组表面更加粗糙。如图2所示，与模型组比较，枸杞子低、中、高剂量组的RPE层均较模型组表面光滑。另外，光损伤组ONL厚度明显变薄（表2），枸杞多糖粗提物干预后，ONL层厚度明显增加（P＜0.05），表明枸杞多糖粗提物具有预防视网膜RPE层损伤的作用。
2.4 枸杞多糖粗提物对小鼠视网膜组织中MDA含量的影响
在过量光照环境中视网膜会发生脂质过氧化，会产生大量的活性醛类物质，使视网膜的脂类受到不可逆损伤[12]，枸杞多糖粗提物对小鼠视网膜组织中MDA含量的影响见图3。
图2 不同组别的OCT伪彩图
Fig.2 OCT pseudo-color images of different groups
a表示椭圆体信号反射不均；b表示RPE层信号反射不均。
表2 视网膜ONL层厚度比较
Table 2 Comparison of retinal ONL thickness
注：ONL 层为视网膜外核层（outer nuclear layer，ONL）；上标字母不同表示组间具有统计学差异（P＜0.05）。
分组 数量 ONL厚度/μm NOR 12 59.38±2.35a MOD 12 50.49±3.12c GQL 12 53.55±1.12b GQM 12 54.26±3.26b GQH 12 55.12±2.38b
图3 提取物对光损伤小鼠视网膜组织MDA含量的影响
Fig.3 Effects of the extract on MDA content of retinal tissues of light-damaged mice
上标字母不同表示组间具有统计学差异（P＜0.05）。
图3表明，NOR组和MOD组MDA含量分别为（1.5±0.3）nmol/mg和（5.21±0.66）nmol/mg。光照能引起小鼠视网膜组织中MDA含量显著增加，而摄入低、中、高剂量枸杞多糖粗提物后，与模型组相比，MDA含量分别下降13.6%、16.5%和18.4%。其中，与模型组相比较，受试物低、中、高剂量组较模型组具有统计学差异（P＜0.05）。
2.5 枸杞多糖粗提物对视网膜组织中SOD活力的影响
SOD作为一种抗氧化酶，对视网膜具有一定的保护作用[13]，枸杞多糖粗提物对视网膜组织中SOD活力的影响见图4。
图4 提取物对光损伤小鼠视网膜组织SOD活力的影响
Fig.4 Effects of the extract on SOD activity of retinal tissue of light-damaged mice
上标字母不同表示组间具有统计学差异（P＜0.05）。
图4结果表明，NOR组和MOD组SOD活力分别为（9.84±0.58）U/mg和（5.21±0.66）U/mg。光照导致小鼠视网膜组织中产生了自由基代谢失衡现象。而摄入低、中、高剂量枸杞多糖粗提物的小鼠，与模型组相比，SOD活力分别增加14.8%、17.5%和22.8%，具有统计学差异（P＜0.05）。
2.6 枸杞多糖粗提物对小鼠视网膜组织中CAT活力的影响
CAT是体内重要的抗氧化酶系之一，具有抑制自由基损伤关键性亚细胞结构的作用[14]，枸杞多糖粗提物对小鼠视网膜组织中CAT活力的影响见图5。
图5 提取物对光损伤小鼠视网膜组织CAT活力的影响
Fig.5 effects of the extract on CAT activity of retinal tissue of light-damaged mice
上标字母不同表示组间具有统计学差异（P＜0.05）。
如图5所示，NOR组和MOD组CAT活力分别为（25.38±1.21）U/mg和（15.21±1.06）U/mg，与正常组比较，光损伤小鼠CAT活力下降40.1%（P＜0.05）；摄入低、中、高剂量枸杞多糖粗提物后，与模型组相比CAT活力分别增加 17.6%、20.0%和32.2%（P＜0.05）。
2.7 枸杞多糖粗提物对视网膜组织中GSH-Px活力的影响
抗氧化物酶活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力[15]，枸杞多糖粗提物对视网膜组织中GSH-Px活力的影响见图6。
图6 提取物对光损伤小鼠视网膜组织GSH-Px活力的影响
Fig.6 effects of the extract on GSH-Px activity of retinal tissue of light damaged mice
上标字母不同表示组间具有统计学差异（P＜0.05）。
图6结果表明，NOR组和MOD组GSH-Px活力分别为（10.25±1.12）U/mg 和（6.02±0.68）U/mg。与正常组相比，光损伤模型小鼠视网膜中GSH-Px活力显著下降（P＜0.05），低、中、高剂量模型小鼠中 GSH-Px活力与模型组比较，分别增加27.6%、37.2%和49.5%，具有剂量效应关系。其中，与模型组比较，枸杞多糖粗提物干预组均有显著性差异（P＜0.05）。
2.8 枸杞多糖粗提物对视网膜组织中T-AOC的影响
在机体防御机制中，T-AOC能反映动物机体的总抗氧化状态[16]，枸杞多糖粗提物对视网膜组织中T-AOC的影响见图7。
图7 提取物对光损伤小鼠视网膜组织T-AOC的影响
Fig.7 effects of the extract on T-AOC of retinal tissue of light damaged mice
上标字母不同表示组间具有统计学差异（P＜0.05）。
图7结果表明，NOR组和MOD组T-AOC分别为（3.2±0.12）U/mg和（1.4±0.14）U/mg，与正常组相比，光损伤小鼠视网膜组织中T-AOC显著下降（P＜0.05），低、中、高剂量模型小鼠中T-AOC与模型对照组比较，分别增加12.9%、15.7%和22.1%，具有剂量效应关系（P＜0.05）。
3 结论与讨论
水提醇沉法是植物活性成分提取的一个常用方法，可以将枸杞子中的活性功能成分进行有效提取。枸杞多糖粗提物的功能成分比较复杂，一般认为其中起主要抗氧化作用的成分为枸杞多糖[17]，并且发现枸杞多糖的保护作用可能与下调视网膜Nrf2等抗氧化基因的表达有关[18]。同时，与枸杞多糖一起被提取出来的包括水溶性淀粉与蛋白质，还有微量的鞣质、色素和无机盐等。张兆旺等[19]对水提醇沉的工艺研究发现，其有效成分的提取受醇沉中乙醇含量的影响较大。当醇沉过程中乙醇含量达到50% ～60%时，可以使淀粉发生沉淀，当含醇量达到75%以上时，除鞣质和水溶性色素等无效成分外，全部淀粉、多糖、蛋白质和无机盐类被沉淀下来。
视网膜是眼球的重要组成部分，大多数视力疾病的发生都与视网膜的功能和形态异常有关。视网膜是一个多层细胞结构，小胶质细胞穿梭现象是视网膜出现病变的重要表征。有研究发现，在正常情况下，小胶质细胞主要存在于外核层（outer nuclear layer，OPL），但长时间的强光刺激后，小胶质细胞开始逐渐向ONL层迁移，可能与两层之间的细胞膜屏障被破坏有关，经常有视网膜萎缩的情况发生[20]。这与本研究的OCT实验结果是相互印证的。通过OCT和ERG实验发现，与正常组小鼠视网膜相比，接受强光刺激的小鼠视网膜ONL层出现了明显萎缩，并且视网膜电图中b波振幅明显降低。与模型组小鼠相比，枸杞子干预组小鼠的视网膜得到了明显的改善。
视网膜最外层细胞为RPE层细胞，是光线的主要吸收部位，但长时间接受强光刺激会促使抗过氧化物酶的活性降低，导致RPE细胞损伤、凋亡，甚至坏死，进而引发眼部疾病[21-23]。通过对视网膜酶活的研究发现，枸杞多糖粗提物明显增强了视网膜中抗氧化酶的活力，在实验剂量组范围内呈现出量效关系，且低剂量组即可起效，提示枸杞多糖粗提物可增强视网膜的抗氧化能力，减轻过量活性氧自由基对视网膜组织造成的损伤。
综合ERG的b波数据及OCT成像检测，与模型组比较，低、中、高剂量组的枸杞多糖粗提物均可对视网膜损伤起到保护作用，并且在本实验给药的剂量范围内随着枸杞多糖粗提物剂量的提高而升高，具有一定的剂量依赖性。总的来说，枸杞子的摄入能够增强机体的抗氧化作用，可在后续研究中对枸杞子中的功能成分进一步进行分离，以期为枸杞子视力保护产品的开发提供科学依据。
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