壳聚糖是甲壳素脱乙酰后的天然产物，也是自然界中唯一的天然碱性多糖[1]。由于壳聚糖具有良好的成膜特性、生物相容性和全降解特性[2-3]，在药品和食品领域通常作为包装的基材之一。研究表明，果蔬经壳聚糖涂膜处理后，贮藏期间，果蔬的呼吸作用降低、失重减少，可以获得较长的保鲜期[4-5]，壳聚糖涂膜也可以抑制病原菌和腐败微生物的生长，延缓果蔬的腐烂变质[6-8]。壳聚糖膜的组成、性能和结构都与保鲜效果密切相关。
为了进一步提高壳聚糖膜的抗菌特性及应用价值，植物精油常被加入壳聚糖膜中，提高复合膜的抗菌性。植物精油是从植物的根、茎、叶、花或果实中提取的芳香物质，由于含有各种酚类、醛类、醇类、酯类等活性成分，具有很强的抗菌特性[9-11]。研究表明牛至精油、百里香精油、丁香精油等均具有较强的抗菌能力[12]。作为天然产物，植物精油通常被认为是安全的[13]，但由于植物精油易于挥发，单独使用时抗菌时效短，研究控制植物精油从膜中释放的技术措施尤为重要。
壳聚糖膜复合植物精油可以延迟精油的释放，精油的释放与保留受壳聚糖膜结构、精油类型、乳化剂等多种因素的影响[14-15]。研究发现，乳化剂可以降低油水两相之间的表面张力，促进精油在水相的溶解，乳化剂对精油粒径和膜溶液的稳定性都有一定影响。并且，乳化剂的乳化效果与亲水亲脂平衡（hydrophile lipophilic balance，HLB） 值密切相关，HLB 值越高，说明对水的亲和力越强[16]。目前为止，复配型乳化剂的HLB值影响壳聚糖精油复合膜的性能及结构的研究鲜有报道。
本研究利用吐温和司盘复配得到不同HLB值的乳化剂，添加到壳聚糖-百里香精油复合膜中，考察乳化剂的HLB值对复合膜的物理性能、抗氧化能力和微观结构的影响，以期为活性抗菌多糖膜的制备及应用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验用壳聚糖（脱乙酰度90.2%）：上海源叶生物科技有限公司；百里香精油：广州文玲贸易有限公司；吐温 80、司盘 80、甘油、冰乙酸、1，1-二苯基-2-吡啶肼（DPPH）（均为分析纯）：天津凯通化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
FA2004电子天平：天津天马衡基仪器有限公司；OMST-150C螺旋测微器：南京苏测计量仪器有限公司；WSC-S色差计：上海精密科学仪器有限公司；CL-3250A恒温数显磁力搅拌器：天津奥特赛斯仪器有限公司；IKA T18均质分散机：德国IKA公司；TW-2A循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；BI-90 plus激光粒度分析仪：美国布鲁克海文仪器公司；JSM-6610扫描电子显微镜：日本JEOL有限公司；UV-5100 B紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 乳化剂添加量的筛选
参照申莉莉的方法[17]，添加不同比例的吐温80和司盘80，分别配制成HLB值分别为9、11、13、15的4种复配乳化剂。以乳化剂和百里香精油体积比为1∶10和1∶5两个比例混合，测定乳液的粒径，考察乳化剂添加量对百里香精油的乳化效果，筛选复配比例。
1.3.2 复合膜的制备
准确称取4.5 g壳聚糖粉末，加入300 mL的0.5%乙酸水溶液中，配制成1.5%的壳聚糖膜溶液。待壳聚糖溶解完全后，加入30%的甘油（30%壳聚糖）作为增塑剂。然后，将1%的百里香精油及乳化剂（乳化剂和精油比例为1∶5）加入膜溶液，膜溶液用均质分散机在12 000 r/min条件下均质3 min后用真空抽气泵抽气30 min，将膜溶液倒在自制玻璃板上，室温（25℃）下干燥成膜。最后将膜贮藏于相对湿度53%的干燥器（含有过饱和硝酸镁溶液）中备用。
试验设计如表1所示，设置不加乳化剂、不加精油的对照CK1，同时设置不加乳化剂、只加精油的对照CK2，并以乳化剂HLB值的不同设置 TS9、TS11、TS13、TS15四个处理。
表1 复配乳化剂的试验设计
Table 1 Experimental design table for compounding emulsifier
注：-表示无。
吐温80/% 司盘80/% 百里香精油/%最终HLB值 命名0 CK1 0 0 1-CK2 0 0-43.9 56.1 1 9 TS9 62.6 37.4 1 11 TS11 81.3 18.7 1 13 TS13 100 0 1 15 TS15
1.3.3 膜溶液粒径的测定
根据Li所述的方法[18]，通过激光粒度分析仪测量溶液的粒径。膜溶液用蒸馏水稀释100倍，设定参数为折射率1.33和测试角90°，在25℃下进行测试，重复3次测试。
1.3.4 膜厚度及颜色的测定
采用数字螺旋测微器，在6个随机点上测量薄膜的厚度，测量精度为0.001 mm。
依照CIE LAB表色系统来表示颜色，采用WSC-S色差仪测定膜的颜色。以白板作色差测定参比，每个处理测6次，取平均值，分别记录膜的L*、a*和b*。
1.3.5 含水量（moisturecontent，MC）、膨胀程度（swelling degree，SD）、水溶性（water solubility，WS）以及水蒸汽透过率（water vapor permeability，WVP）的测定
根据Homez-Jara[19]的方法略作修改，测定壳聚糖精油复合膜含水量、溶胀度、水溶性，膜切割成20 mm×20 mm的正方形，称其重量，记为m1。然后将裁好的膜片放入烘箱中，温度为105℃，烘干24 h后取出，放入干燥器中冷却后称重，记为m2。量取30 mL蒸馏水，将膜放入水中，放置24 h后取出，擦去表面水分后称重，记为m3。再放入烘箱内干燥24 h，得到膜最终的质量m4。每一组膜测定3次。
参考彭勇等[20]的方法测定复合膜的水蒸汽透过率。薄膜（60 mm×60 mm）覆盖在含有无水氯化钙的称量瓶上，将称量瓶称重（M1），然后，放入含有饱和氯化钠溶液的干燥器中，放置7 d后称重，记为M2，复合膜的水蒸汽透过率[WVP，g/（m·s·Pa）]用下式计算。
式中：（M2-M1） 为称量瓶重量的变化，g；L 为膜厚度，m；A 为膜的有效面积，m2；t为贮藏时间，s；△P为薄膜两侧的水蒸汽压差，Pa。
1.3.6 抗拉强度、断裂伸长率的测定
根据GB/T 1040.3—2006《塑料拉伸性能的测定第3部分：薄膜和薄片的实验条件》塑料拉伸性能的测定方法略作修改测定膜的拉伸性能[21]。试验前将薄膜放置在相对湿度53%，23℃条件下48 h。首先将薄膜切成15 mm×150 mm长方形，用XLW拉伸试验机测定薄膜拉伸强度（tensile strength，TS）和断裂伸长率（percentage of breaking elongation，EAB）。拉伸速度为10 mm/min，初始距离为100 mm，每组6次重复测试。
1.3.7 抗氧化性的测定
参照张小燕等的方法[22]，将膜样切成20mm×20mm，在含有10 mL甲醇中，放置10 min。然后，吸取200 μL样品溶液与2 mL的DPPH甲醇溶液混合，其中以200 μL的甲醇代替样品作为对照组，在25℃的黑暗中放置30 min。于516 nm处测定吸光度。用下面公式计算。
式中：Af和Ab分别是薄膜样品和对照组的吸光度值。
1.3.8 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）图像
在测试前，薄膜至少干燥7 d，并在液氮中断裂。然后将样品切成长方形（1 mm×6 mm），粘在金属板上，真空镀金，用扫描电镜在5 kV条件下观察薄膜样品的表面和截面形貌。
1.3.9 数据处理
结果以平均值±标准差表示，数据通过SPSS软件ANOVA分析（版本24.0），并进行邓肯多样本差异显著性分析（P＜0.05）。
2 结果与分析
2.1 复配乳化剂HLB值对壳聚糖膜溶液粒径的影响
不同复配乳化剂的膜溶液粒径如表2所示。从表2中可以看出，当乳化剂与精油混合时，无论体积比是1∶10还是1∶5，HLB值在9～15之间均可获得较小的精油粒径，1∶5时精油粒径较小，而没有乳化剂的对照组精油粒径最大。
表2 乳化剂HLB值对壳聚糖精油膜溶液粒径的影响
Table 2 Effect of emulsifier HLB value on the particle size of chitosan-essential oil composite films solution
注：-表示无；同列不同小写字母表示差异显著性P<0.05。
乳化剂复配膜粒径/nm 膜溶液粒径/nm 1∶10处理 1∶5处理CK2 - 5 441.5±530.8a 5 441.5±530.8a 7 417.9±369.2a TS9 9 2.7±0.1d 1.7±0.2c 1416.0±140.7b TS11 11 2.4±0.1e 1.6±0.1c 1066.5±42.1c TS13 13 4.2±0.0c 2.0±0.4b 899.9±77.5c TS15 15 4.9±0.1b 2.1±0.4b 656.4±106.4d HLB值
根据乳化效果，选择乳化剂和精油1∶5（体积比）的复配比例，制备壳聚糖复合膜溶液，可以看出随着乳化剂HLB值的升高，膜溶液的粒径逐渐下降，HLB值为15时，粒径最小，其值为656.4 nm。粒径较小的乳液通常意味着较好的乳化效果，复合膜溶液混合体系也更稳定[16]。
2.2 复配乳化剂HLB值对膜颜色及厚度的影响
乳化剂HLB值对壳聚糖精油复合膜颜色和厚度的影响见表3。
表3 乳化剂HLB值对壳聚糖精油复合膜颜色和厚度的影响
Table 3 Effect of emulsifier HLB value on color and thickness of chitosan-essential oil composite films
注：同列不同小写字母表示差异显著性P<0.05。
序号 L* a* b* 厚度/mm CK1 92.50±0.08a -1.01±0.06a 8.90±0.33d 0.072±0.005d CK2 88.35±0.75d -1.81±0.05d 21.75±1.99a 0.142±0.009a TS9 90.09±0.15b -1.68±0.11c 17.40±0.68c 0.108±0.007c TS11 89.32±0.32c -1.71±0.07c 19.09±0.87b 0.119±0.011b TS13 89.41±0.22c -2.02±0.05e 21.54±0.88a 0.139±0.012a TS15 90.42±0.18b -1.60±0.06b 16.56±0.46c 0.100±0.003c
由表3可知，未加精油的CK1膜的L*值为92.50、a*值为-1.01，b*值为 8.90，膜透明、亮度大、黄色淡。加入精油后的对照膜CK2的L*值显著降低，膜的颜色加深。这可能是精油本身的颜色导致的。添加不同HLB值的复配乳化剂后，膜的L*值增加、b*值下降，但是乳化剂的HLB值与膜颜色之间无显著相关性。
从膜厚度来看，未添加精油的CK1膜厚度最小，仅0.072 mm，添加精油后的CK2膜，厚度显著增加。而添加乳化剂之后，膜的厚度显著下降，以TS15膜的厚度最小，膜的厚度是由膜的组成成分和各组分之间的相互作用决定的[23]，乳化作用使得精油粒径变小，各组分间的相互作用减弱，从而降低了膜厚度。
2.3 膜的含水量、膨胀程度、水溶性及水蒸汽透过率的分析
乳化剂HLB值对壳聚糖精油复合膜的物理性能（包括含水量、水溶性、膨胀程度和水蒸汽透过率）的影响见表4。
表4 乳化剂HLB值对壳聚糖精油复合膜含水量、膨胀程度、水溶性和水蒸汽渗透率的影响
Table 4 Effect of HLB value of emulsifier on water content，swelling degree，water solubility and water vapour permeability of chitosan-essential oil composite films
注：同列不同小写字母表示差异显著性P<0.05。
处理 含水量/% 膨胀程度/% 水溶性/% 水蒸汽透过率/[10-7g/（m·s·Pa）]CK1 57.76±2.63a 85.82±3.59a 16.03±1.94c 2.32±0.21b CK2 38.58±1.05b 61.51±5.87bc 31.93±0.65a 3.21±0.41a TS9 40.64±1.33b 68.79±5.87b 26.24±1.06b 2.55±0.45a TS11 39.81±1.91b 59.22±6.07c 25.87±0.85b 3.00±0.74a TS13 41.67±4.08b 56.97±0.25c 26.66±1.85b 2.79±0.53a TS15 39.11±0.83b 62.77±5.10bc 26.19±0.75b 3.01±0.63a
从结果来看，未添加精油的对照CK1膜含水量和膨胀程度最高、水溶性和水蒸汽透过率最小，添加精油后的对照CK2膜，其含水量和膨胀度显著下降，而CK2膜的水溶性和水蒸汽透过率显著增加，表明百里香精油可以衰弱壳聚糖与水分子之间的相互作用。添加不同HLB值的乳化剂之后，复合膜的含水量略有增加，水溶性显著降低，但膨胀程度差异不大，并且乳化剂HLB值与膜的含水量、水溶性、水蒸汽透过率等无相关性。吐温和司盘都是非离子型乳化剂，乳化剂的加入不但降低了壳聚糖与精油的相互作用，而且乳化剂本身也影响了复合膜的性能[24]，从而导致了含水量、水溶性等指标的变化。
2.4 不同HLB值的乳化剂对膜拉伸性能的影响
乳化剂HLB值对壳聚糖精油复合膜的拉伸性能（包括抗拉强度和断裂伸长率）的影响见图1。
图1 乳化剂HLB值对壳聚糖精油复合膜抗拉强度和断裂伸长率的影响
Fig.1 Effect of emulsifier HLB value on tensile strength and elongation at break of chitosan-essential oil composite films
如图1所示，与CK1相比，加入百里香精油的CK2的复合膜的抗拉强度变化不大，但是增加了膜的断裂伸长率，这与Zinoviadou在乳清蛋白膜中添加牛至精油观察到断裂伸长率增加的结果是一致的[25]。加入乳化剂之后，随着乳化剂HLB值的增加，复合膜的抗拉强度表现不一致，HLB值为13的复合膜抗拉强度最大，而TS15抗拉强度最小，从断裂伸长率来看，与CK2相比，乳化剂降低了膜的断裂伸长率，并且，随着乳化剂HLB的增加，膜的断裂伸长率呈现增加的趋势。膜的抗拉强度和断裂伸长率与膜体间各组分的相互作用及膜的结晶程度有关，乳化剂可以调节水相和油相的相互作用，因而使得复合膜的力学性能更均衡。
2.5 抗氧化剂活性分析
DPPH自由基清除率是衡量抗氧化活性的重要方法之一。纯壳聚糖膜本身具有较低的抗氧化能力，其DPPH自由基清除率为10.90%，见图2。
图2 不同HLB值的乳化剂壳聚糖精油复合膜的自由基清除率
Fig.2 Free radical scavenging rate of emulsifier chitosan-essential oil composite films with different HLB values
精油的添加显著提高了薄膜的抗氧化能力，这与精油中含有较多的酚类成分有关。乳化剂的添加对膜的抗氧化能力影响不同，HLB值为9时，复合膜的抗氧化能力显著降低，可能是不同HLB值的乳化剂对油水相的影响不同。HLB值为9时，乳化剂乳化精油的效果较差，但却导致了膜体作用力的下降，从而导致了精油的挥发[26]，使得DPPH自由基清除率下降。而随着HLB的增加，乳化作用加强，精油被限制在膜体中，提高了膜的抗氧化能力。
2.6 扫描电镜
壳聚糖复合膜的扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）图像见图 3。
图3 壳聚糖复合膜的SEM图像
Fig.3 SEM images of chitosan composite films
A.CK1薄膜表面；a.薄膜截面；B.CK2薄膜表面；b.CK2薄膜截面；C.TS9薄膜表面；c.TS9薄膜截面；D.TS11薄膜表面；d.TS11薄膜截面；E.TS13薄膜表面；e.TS13薄膜截面；F.TS15薄膜表面；f.TS15薄膜截面。
图3中可以看出，百里香精油可以均匀的分布于膜中，膜的微观结构主要与膜中精油的含量和粒径有关[27]。CK1膜表面和截面质地光滑，而CK2膜由于精油的加入，其膜表面和截面的粗糙度显著增加，并且精油颗粒大，粒径不均匀。而添加乳化剂后，乳化剂降低了精油的粒径和膜表面孔隙度，从表面图像来看，TS9的膜表面无精油附着，表明其膜体作用力弱，精油难以留在表面，易于挥发，这与抗氧化的结果（DPPH自由基清除率低）是一致的。但HLB值在11～15之间，乳化剂对精油粒径和膜结构的影响并不显著，这可能与精油、乳化剂及壳聚糖的相互作用有关。
3 结论
乳化剂对壳聚糖精油复合膜有较好的乳化作用，精油粒径的大小会随复配乳化剂HLB值的增加而减小，使壳聚糖-精油复合膜乳液更加稳定。一定HLB值的乳化剂可以提升壳聚糖-精油复合膜的抗氧化性能。添加不同HLB值的乳化剂，对膜的物理性能也有不同的影响。综合来看，添加TS13复配乳化剂的复合膜性能较好，可以获得较低的膨胀程度和水蒸汽透过率，提升膜的抗拉强度，有助于改善壳聚糖精油复合膜的性能，得到性能优良的抗菌活性包装。
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