桔梗（Platycodon grandiflorum）为桔梗科桔梗属的草本植物，又名包袱花、铃铛花、僧帽花[1]。从古至今，既可被用作食物原料，又可被用作药材[2]。桔梗具有广泛的药理活性，对多种疾病均有很好的治疗作用[3]。中药与合成的抗生素、抗氧化剂及抗炎药物相比，具有低毒、无残留、副作用小等优点[4]。随着人们对传统药食同源越来越深入的研究，植物提取物被广泛的用作天然抗氧化剂、抑菌剂等[5]。
人体的生命活动伴随氧化反应，产生大量的氧自由基，大量的氧自由基会引起氧化损伤，长期处于氧化损伤状态会引起大量慢性疾病[6]。故近年来国内外很多学者致力于抗氧化剂的筛选，天然抗氧化剂由于自身的优势，成为食品和医药的研究热点。单一的抗氧化体系不能全面的说明物质的抗氧化能力，为了更好地评价物质的综合抗氧化性，通常测定总还原能力、超氧阴离子自由基清除能力、羟自由基清除能力、DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力[7-10]，便于全面的分析物质的抗氧化性。
目前关于桔梗中的活性物质的主要提取方法有传统水提法、微波辅助提取法、超声辅助提取法等[11-13]，但关于不同溶剂对桔梗提取物进行萃取尚未报道。为了深入研究不同溶剂对桔梗中总多酚和总黄酮含量及萃取物抗氧化活性的影响，本文对桔梗根提取物进行不同溶剂的萃取，并对不同溶剂萃取物的抗氧化性进行了评价。以期为进一步开发和发展桔梗资源提供理论基础和试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
桔梗根：采于黑龙江省鸡西市鸡东县；没食子酸标准品（色谱纯）、福林-酚试剂、1，1-二苯基-2-三硝基苯（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）、2，2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azinobis（3-ethylbenzothiaoline-6-sulphonicacid，ABTS]、TPTZ 试剂：美国Sigma公司；抗坏血酸、Trolox：美国Solarbio公司；试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
LGJ-1A-50真空冷冻干燥机：北京亚泰科隆仪器技术有限公司；RE-5203旋转蒸发仪、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵：上海亚荣生化仪器厂；YP20002电子天平：上海越平科学仪器有限公司；G70D20CN1P－D2微波炉：格兰仕微波电器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；万能高速粉碎机：上海菲力博实业公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品的制备
新鲜桔梗根洗净、去皮、切片后置于真空冷冻干燥机中干燥至恒重，将干燥的桔梗根用粉碎机打磨成粉末。称取10 g的粉末，加入30倍体积的50%乙醇溶液，210 W的微波条件下，提取60 s，过滤出滤渣并收集滤液，在此条件下提取两次，合并滤液。将上述滤液冷冻干燥收集粉末，将粉末溶解于250 mL容量瓶中，取40 mL溶液与等体积石油醚混合，置于分液漏斗中，振荡溶液使得两种液体充分接触，静置30 min，收集上层石油醚相，将下层水相按上述方法再萃取3次。并按以上方法进行正丁醇、乙酸乙酯、正丁烷的萃取。将相同溶剂萃取液合并，进行减压浓缩、冷冻干燥得不同溶剂萃取物。
1.3.2 总多酚含量的测定
桔梗根提取物不同溶剂萃取物中总多酚含量的测定，采用福林-酚测定法[14]，吸取萃取液1 mL、蒸馏水5 mL、福林-酚试剂1 mL于试管中，充分混合并静置5 min后，加入3 mL7%碳酸钠溶液，充分混合后，70℃避光反应20 min，在765 nm波长下测定其吸光度。以不同浓度没食子酸标准品溶液代替萃取液按以上步骤操作，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=5.827 3x+0.327 2（R2=0.999 3）。把测定样品吸光度代入方程，即得到总多酚含量。
1.3.3 总黄酮含量的测定
桔梗根提取物不同溶剂萃取物中总黄酮含量的测定，采用硝酸铝显色法测定[15]，吸取萃取液1、5 mL蒸馏水和1 mL5%的亚硝酸钠水溶液于试管中，充分混合后静置5 min，再加入1 mL 10%的硝酸铝，充分混合后静置5 min，再加10 mL10%的氢氧化钠水溶液，充分混合15 min后，在510 nm波长下测定其吸光度。以不同浓度芦丁标准品溶液代替萃取液按以上步骤操作，绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.000 7x-0.006 4（R2=0.999 3）。把测定样品吸光度代入方程，即得到总黄酮含量。
1.3.4 抗氧化能力的测定
1.3.4.1 铁还原能力的测定
铁还原能力的测定采用铁离子还原法（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP），参照朱尚彬、杨少辉等[16-17]的方法略做改动，将0.1 mL样品、3 mL醋酸盐缓冲溶液（pH3.6）、0.1 mL的 TPTZ溶液（10 mmol/L）和0.1 mL的三氯化铁溶液（10 mmol/L）充分混合，放置25℃条件下反应6 min，并于700 nm处测定其吸光度。并以VC为对照组，按以上步骤进行试验。
1.3.4.2 超氧阴离子自由基清除率测定
参照李斌等[18]的方法略做改动，吸取200 μL样品、5.7 mL Tris-HCl缓冲溶液（0.05 mol/L，pH 8.20）和0.1 mL邻苯三酚溶液（6 mmol/L）于试管中，充分混合后，在320 nm波长处测定其吸光度，记为Ai；按上述试验步骤，以等体积蒸馏水代替样品测定其吸光度，记为A0；以等体积蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定吸光度，记为At；并以VC为对照组，按以上步骤进行试验。
按照公式计算超氧阴离子自由基清除率。
1.3.4.3 羟自由基（·OH）清除能力的测定
参照白生文等[19]的方法略做改动，吸取3 mL样品、2 mL硫酸亚铁溶液（0.1 mol/L）、2 mL水杨酸溶液（0.1 mol/L）和2 mL过氧化氢溶液（0.1 mol/L）于试管中，充分混合后，37℃水浴条件下反应30 min，在510 nm波长处测定其吸光度，记为Ai；按上述试验步骤，以等体积无水乙醇代替样品测定其吸光度，记为A0；以等体积蒸馏水代替过氧化氢溶液测定吸光度，记为At；并以VC为对照组，按以上步骤进行试验。
按照公式计算·OH清除率。
1.3.4.4 DPPH自由基清除能力的测定
参考Li Xiuxia等[20]方法的基础上略做改动，吸取2 mL DPPH乙醇溶液（0.1 mol/L）和2 mL样品溶液于试管中，充分混合后室温25℃避光反应30 min，在517 nm波长处测定其吸光度，记为Ai；按上述试验步骤，以等体积无水乙醇代替样品测定其吸光度，记为A0；以等体积无水乙醇代替DPPH乙醇溶液测定吸光度，记为At；并以VC为对照组，按以上步骤进行试验。
按照公式计算DPPH自由基清除率。
1.3.4.5 ABTS+·清除能力的测定
参考Garzón G A等[21-22]方法的基础上略做改动，用甲醇将ABTS溶液在734 nm处的吸光度调整为0.7±0.02，记为 A0；吸取 200 μL 样品和 4 mL ABTS 溶液于试管中，充分混合后室温25℃避光反应30 min，在517 nm波长处测定其吸光度，记为Ai；并以Trolox为对照组，按以上步骤进行试验。按照公式计算ABTS+·清除率。
1.4 数据处理与统计分析
本试验采用Origin9.1软件绘图，SPSS22.0软件对数据进行单因素方差分析，所有试验均重复3次。
2 结果与分析
2.1 不同溶剂萃取物总多酚含量
桔梗根提取物不同溶剂萃取物总多酚含量如图1所示。
图1 不同溶剂萃取物的总多酚含量
Fig.1 Total polyphenol contents of different solvents of extracts
不同小写字母表示差异显著，p<0.05。
由图1可知不同溶剂萃取物总多酚含量：正丁醇>石油醚>乙酸乙酯>正己烷，且各萃取相中总多酚含量差异明显。其中正丁醇萃取物明显高于其他组，总多酚含量为（4.02±0.097）mg/g，是石油醚萃取物的1.3倍，乙酸乙酯萃取物的3倍，正己烷萃取物的3.5倍。说明桔梗根提取物经过不同溶剂萃取后，正丁醇和石油醚萃取物富集多酚类物质的能力最好，可以富集大部分的多酚类物质；而乙酸乙酯和正己烷萃取物富集多酚类物质的能力较弱，说明多酚类物质在这两种溶剂中溶解度较差。这4种溶剂极性排序为：石油醚<正己烷<乙酸乙酯<正丁醇，说明桔梗根提取物中多酚更容易溶解于极性较大或者极性较小的溶剂中。
2.2 不同溶剂萃取物总黄酮含量
不同溶剂萃取物的总黄酮含量见图2。
图2 不同溶剂萃取物的总黄酮含量
Fig.2 Total flavonoids contents of different solvents of extracts
不同小写字母表示差异显著，p<0.05。
由图2可知，桔梗根提取物不同溶剂萃取物总黄酮含量差异显著，其中含量最高的为石油醚萃取物，为（1.545±0.055）mg/g，含量最低的为正己烷萃取物，为（0.403±0.019）mg/g。不同溶剂萃取总黄酮含量：石油醚>正丁醇>乙酸乙酯>正己烷，其中石油醚萃取物中总黄酮含量是正丁醇的1.4倍，乙酸乙酯萃取物的3倍，正己烷萃取物的3.8倍。说明黄酮类物质更容易溶解到极性小的溶液中。液-液萃取不仅可以增加黄酮的含量，而且可以提高黄酮的纯度，还具有操作简便，能耗较小的优点，被广泛用于提取及纯化的技术上[23]。
2.3 抗氧化活性测定结果
2.3.1 铁还原能力分析
通常用FRAP法来表示样品的铁还原能力，吸光度越大表示还原能力越强[24]。不同溶剂萃取物的铁还原能力见图3。
图3 不同溶剂萃取物的铁还原能力
Fig.3 FRAP of different solvents of extracts
图3中随着样品浓度的增加，吸光度也随之增大，由此可知，样品的铁还原能力与浓度呈正相关。正丁醇萃取物的铁还原能力明显高于其他萃取物，其中正己烷萃取物显示出较弱的铁还原能力，阳性对照组VC的铁还原能力优于各萃取物。各萃取物的铁还原能力大小依次为：正丁醇>石油醚>乙酸乙酯>正己烷。
2.3.2 超氧阴离子自由基清除能力
不同溶剂萃取物对超氧阴离子自由基清除能力见图4。
图4 不同溶剂萃取物对超氧阴离子自由基清除能力
Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of different solvents
由图4可知，桔梗根提取物不同溶剂萃取物对超氧阴离子自由基清除能力存在剂量依赖效应，在20 μg/mL ～100 μg/mL的浓度范围内，超氧阴离子自由基的清除率与萃取物浓度成正比，且各萃取物对超氧阴离子自由基的清除率各不相同。阳性对照组VC明显高于各溶剂萃取物，正丁醇萃取物的超氧阴离子自由基清除率最好。
不同溶剂萃取物的IC50值见表1。
表1 不同溶剂萃取物的IC50值
Table 1 IC50values of different solvent extracts
清除ABTS+·IC50值/（μg/mL）石油醚 80.335±1.957 0.162±0.015 0.372±0.048 0.015±0.002正丁醇 39.322±1.712 0.148±0.024 0.324±0.032 0.014±0.001乙酸乙酯 90.462±1.246 0.326±0.066 0.467±0.073 0.017±0.005正己烷 98.156±2.035 0.473±0.009 0.472±0.019 0.376±0.044萃取物 清除 O2－·IC50值/（μg/mL）清除·OH IC50值/（μg/mL）清除DPPH·IC50值/（μg/mL）
如表1所示，正丁醇萃取物清除O2-·的IC50为（39.322±1.712）μg/mL，正己烷萃取物的超氧阴离子清除率最弱，其IC50为（98.156±2.035）μg/mL。各萃取物超氧阴离子自由基清除能力大小依次为：正丁醇>石油醚>乙酸乙酯>正己烷。
2.3.3 羟自由基（·OH）清除能力
桔梗根提取物不同溶剂萃取物的羟自由基清除能力如图5所示。
图5 不同溶剂萃取物对羟自由基清除能力
Fig.5 Hydroxyl radical scavenging activity of different solvents
随着各样品浓度的增加，其羟自由基清除率也随之增加，阳性对照组VC羟自由基清除率明显低于各萃取物，正丁醇萃取物的羟自由基清除率优于其他组，由表 1可知其 IC50为（0.148±0.024）μg/mL，各萃取物中，羟自由基清除率最低的为正己烷萃取物，其IC50值为（0.473±0.009）μg/mL。各萃取物羟自由基清除能力大小依次为：正丁醇>石油醚>乙酸乙酯>正己烷。
图6 不同溶剂萃取物对DPPH自由基清除能力
Fig.6 DPPH radical scavenging activity of different solvents
2.3.4 DPPH·清除能力
不同溶剂萃取物对DPPH自由基清除能力见图6。
由图6可知，阳性对照组VC和各溶剂萃取物在试验浓度范围内，对DPPH·清除活性随质量浓度的增加而增强，阳性对照组VCDPPH·清除率略高于各萃取物，在4种溶剂萃取物中，正丁醇萃取物对DPPH·的清除能力最强，由表1可知其IC50值为（0.324±0.032）μg/mL，正己烷萃取物对DPPH·的清除能力最弱，其IC50值为（0.472±0.019）μg/mL。桔梗根提取物不同溶剂萃取物对DPPH·的清除作用大小顺序为：正丁醇>石油醚>乙酸乙酯>正己烷。
2.3.5 ABTS+·清除能力
ABTS+自由基清除法被广泛利用于评价样品的抗氧化能力，不同溶剂萃取物对ABTS+·清除能力见图7。
图7 不同溶剂萃取物对ABTS+·清除能力
Fig.7 ABTS+·scavenging activity of FRAP of different solvents
由图7可以看出阳性对照组Trolox对ABTS+自由基清除能力明显优于各溶剂萃取物，各萃取物对ABTS+自由基清除效果与浓度成正比，随着浓度的增大，对ABTS+自由基清除效果越好。各萃取物中对ABTS+自由基清除效果最好的是正丁醇萃取物，当浓度达到100 μg/mL时，对ABTS+自由基清除率达到92.59%，由表 1知其 IC50值为（0.014±0.001）μg/mL；对ABTS+自由基清除率最低的是正己烷萃取物，其IC50为（0.376±0.044）μg/mL。桔梗根提取物不同溶剂萃取物对ABTS+自由基的清除作用大小顺序为：正丁醇>石油醚>乙酸乙酯>正己烷。
3 结论
本试验选取了不同的溶剂对桔梗提取物水溶液进行萃取，结果表明，正丁醇萃取物中总多酚含量最高，石油醚萃取物中总黄酮含量最高。由于提取物含有多种活性物质，若使用单一评价方法不能全面的评价其抗氧化性[25]。故本试验测定各萃取物的铁还原能力、超氧阴离子自由基清除能力、羟自由基清除能力、DPPH·清除能力和ABTS+·清除能力，以期更加全面的评价各萃取物的抗氧化性。结果表明，正丁醇萃取物的抗氧化活性最强，其次是石油醚萃取物。根据本试验结果，可以得出，正丁醇萃取物可以被用来对桔梗中的多酚进行进一步的分离纯化；石油醚萃取物可用作桔梗中黄酮进一步的分离纯化；正丁醇萃取物在抗氧化性能上较为突出，具有被开发成天然抗氧化剂的潜能。
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