咖啡以其独特的风味受到人们的喜爱。绿原酸（chlorogenic acid，CGA）、咖啡因（caffeine，CAF）、葫芦巴碱（trigonelline，TRI）是咖啡中重要的物质，影响着咖啡的风味变化。CGA是由奎宁酸与肉桂酸盐类合成的，属多酚类化合物，占咖啡物质组成的6%～12%[1]，是咖啡中独特的成分之一 [2]，影响着咖啡的苦涩味。CGA在烘焙中经Strecker降解反应分解为咖啡酸、阿魏酸与奎尼酸，间接影响咖啡最终的酸度，并赋予咖啡收敛性和苦味[3]。CAF是一种黄嘌呤生物碱化合物，也是咖啡中重要的风味物质[4]，呈苦味，影响咖啡的醇厚感和苦涩度[3]。TRG为尼克酸甲基化的产物，是植物体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate，NADP）代谢或转化产物，决定着咖啡的涩味，并兼具提神功效[5]。
三维荧光法是将荧光强度表示为激发波长-发射波长两个变量的函数，即三维荧光光谱（three-dimensional excitation-emission matrix，3D-EEM），它能够表示激发波长（excitation wavelength，λex）和发射波长（emission wavelength，λem）同时变化时的荧光强度信息[6]，物质不同，特征荧光谱也不同。3D-EEM具有良好的选择性和高灵敏度，检测方法也较为简捷、所需样品少、复现性好，这些优点使得其在食品检测和生物检测中得到广泛的应用[7]。目前，对咖啡中成分的检测方法主要有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8-11]、毛细管电泳电化学检测法[12-13]、高效液相色谱-质谱法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[14-16]和分光光度法[17]等，但这些方法样品的前处理较为复杂繁琐，近年来利用3D-EEM在牛肉新鲜度评价[18]、兽药残留检测[19]、水体污染物的检测[20-21]、药物研究[22]已有较多报道，而利用3D-EEM针对咖啡成分的研究还较少。
本文基于3D-EEM对不同品种生咖啡、烘焙咖啡浸提液荧光光谱进行研究，针对特征成分CGA、CAF、TRG建立3D-EEM图谱特征数据，结合特征图谱探究其半定量可行性，为咖啡豆品种的快速鉴别以及咖啡豆中CGA、CAF、TRG含量快速测定提供一定理论依据和数据支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
5种不同品种咖啡豆（2016产季）：广州伊蕴丽贸易有限公司；CGA标准品、TRG标准品：上海源叶生物科技有限公司；CAF标准品：成都德锐可生物科技有限公司。
F97Pro型荧光分光光度计：上海棱光技术有限公司；兴盛多功能高速粉碎机：永康市兆申电器有限公司；SANTOKER R500E烘焙机：三豆客咖啡科技；Coffee Roast Analyzer RA-710烘焙度测试仪：Acronova Technolog。
咖啡豆样品见表1。
表1 咖啡豆样品
Table 1 Sample of coffee beans
编号 品种 产地 风味描述 失水率/% 烘焙度 烘焙等级A 高山卡蒂姆 中国（云南） 口感均衡，坚果香，后段特殊香 13.54 73.3 中度烘焙B Geisha瑰夏种 巴拿马 柳橙、苹果果酸、花香、蜂蜜 14.12 62.3 深度烘焙C阿拉比卡 印尼 热带水果、发酵酒香浓郁、樱桃巧克力，余韵持久 15.14 56.7 中深烘焙D 阿拉比卡原生种豆 埃塞俄比亚 莓果，莱姆，整体口感明亮、多汁，香浓滑顺 13.47 64.7 深度烘焙E 牙买加蓝山种铁比卡 巴布亚新几内亚 葡萄柚酸香、水果口感、柠檬皮香气、黑巧克力 14.94 69.7 深度烘焙
1.2 试验方法
1.2.1 样品及标准品制备
咖啡生豆、烘焙豆粉碎后用UP水制备为浓度为2.5 mg/mL的溶液备用。各配制浓度为0.5 mg/mL的4种 CGA、CAF、TRG、CGA-CAF-TRG（体积比 1 ∶1 ∶1）混合溶液备用。
1.2.2 咖啡豆烘焙
咖啡生豆采用SANTOKER R500E烘焙机烘焙。火力 0.5 kPa，风门 4，转速 60 r/min。每次入豆 250 g。烘培失水率范围控制在13.47%～15.14%。烘培程度范围在56.7～73.3基本上在65左右，接近于中、深度烘培。
1.2.3 CGA、CAF、TRG三维荧光二维荧光指纹图谱及测定线性浓度范围的建立
1）CGA、CAF、TRG三维荧光分析条件设置：发射波长 λem=200 nm～900 nm，激发波长 λex=200 nm～900 nm，每隔10 nm激发扫描一次，扫描速度为30 000 nm/min，激发宽带、发射宽带为10 nm，光电倍增管增益（photomultiplier tube，PMT）=900 V高，相应时间自动匹配。按照CGA、CAF、TRG三维荧光分析条件设置分别对制备好的CGA、CAF、TRG标准溶液和 CGA、CAF、TRG混合标准溶液进行三维荧光扫描，建立CGA、CAF、TRG的三维荧光指纹图谱。以相同方法做纯净水空白对照组。
2）CGA、CAF、TRG的二维荧光分析条件设置（激发模式）：测量类型为波长扫描，扫描模式为激发模式，数据模式为荧光模式，λem分别为：CGA 457 nm；CAF 681nm；TRG 380 nm。λex起始波长分别为：CGA 320 nm；CAF 360 nm；TRG 280 nm。λex终止波长分别为：CGA 420 nm；CAF 480 nm；TRG 360 nm。扫描速度均为300 nm/min，等待时间均为0 s，激发带宽均为10 nm，发射带宽均为 10 nm，增益（PMT）均为15档（900 V），响应时间自动匹配，自动光门未使用，重复次数为一次，重复间隔为0 s。
1.3 数据处理
采用F97Pro型荧光分光光度计连接电脑自带软件进行数据统计和处理，做3次平行。
2 结果与分析
2.1 对照、标准品及混标的3D-EEM光谱特征
图1为对照、标准品及混标的3D-EEM光谱特征图。
图1 对照、标准品及混标的3D-EEM光谱特征
Fig.1 3D-EEM spectral characteristics of reference standard and mixed standard
考虑到咖啡液体以水为溶剂，因此选择超纯水作空白对照组，图中从原点起始的斜线部分主要有瑞利散射（rayleigh scattering）、拉曼散射（raman scattering）和倍频峰线。在瑞利散射中，入射光与物质分子没有发生能量交换，它的波长和激发波长相同，强度是入射光强度的10-3倍；拉曼散射是由于处在激发态的分子没有跃迁至基态而偏离原来的能级，到达稍高或稍低能级产生的，强度是入射光强度的10-6～10-8。拉曼散射、瑞利散射与水中粒子的浓度和体积有关。倍频峰是由光栅衍射造成的。这4条峰线均属干扰散射，除此以外可以看出荧光光谱纯净，无杂质干扰。各添加0.5 mg/mL CGA、CAF、TRG标准品均能出现特征荧光峰。CGA主要位于λex/λem=（340～400）nm（/390～600）nm，λex=371.0 nm，λem=457.0 nm处荧光信号最强。CAF主要出现两个峰分别位于λex/λem=（363～456）nm（/640～750）nm和λex/λem=（460～527）nm（/508～586）nm，在λex=411.0 nm，λem=681.0 nm 和 λex=499.0 nm，λem=538.0 nm处荧光信号最强。TRG主要位于λex/λem=（280～410）nm/（345～550）nm，λex=330.0 nm，λem=380.0 nm 处荧光信号最强。混合浓度为0.5 mg/mL的CGA、CAF、TRG 3种标准液后，荧光峰发生了变化，仅出现一个峰，主要位于λex/λem=（357～410）nm（/390～595）nm，λex=380.0 nm，λem=457.0 nm处荧光信号最强。荧光特征峰范围非常接近CGA峰范围。
从3种标准液的荧光强度上看，在相同浓度条件下CGA、CAF、TRG的激发波长、发射波长和荧光强度都不同。荧光强度：TRG＞CGA＞CAF。TRG在λex=330.0 nm，λem=380.0 nm处相对荧光强度为1 036.00，CGA在λex=371.0 nm，λem=457.0 nm处相对荧光强度为 852.20，CAF在易辨的λex=411.0 nm，λem=681.0 nm处相对荧光强度为74.32。
2.2 不同品种生咖啡、烘焙咖啡浸提液3D-EEM光谱特征
一些亲水性有机酸、核酸、氨基酸、碳水化合物、表面活性剂等，这些污染物分子结构大多具有共轭双键芳香烃或双键、羰基、羧基等共轭体系，在紫外光区受到特定波长光线的激发照射时会发射不同波长的荧光，咖啡中也含有类似成分。
5种不同品种生熟咖啡豆样品三维荧光差异对比图见图2。
由图2可知，不同品种生咖啡浸提液荧光峰较为散乱，主要荧光峰分布在两块，峰值最高的荧光峰在λex/λem=（359～450）nm（/365～761）nm范围，另一块峰值较低为λex/λem=（750～860）nm（/450～560）nm范围。咖啡烘焙后浸提液荧光峰与生咖啡浸提液荧光峰范围明显发生变化，荧光峰集中为一块在λex/λem=（380～600）nm。
图2 5种不同品种生熟咖啡豆样品三维荧光差异对比图
Fig.2 Three-dimensional fluorescence difference comparison of 5 different varieties of cooked coffee beans
官能团的含量增加或减少，或发生物质氧化作用时，即相应地表现出荧光峰的红移或蓝移。咖啡烘焙后的浸提液中荧光峰最高点从λex=401 nm，λem=480 nm，向λex=480 nm，λem=550 nm红移，与咖啡豆中含有羟基、羰基、羧基等荧光基团数量的多少有关。
生咖啡浸提液的荧光峰分布松散，烘焙咖啡浸提液荧光分布紧密，黄微[24]的研究表明，3D-EEM等高线的疏密程度反映了投影图中荧光峰的陡峭程度。咖啡烘焙后其等高圈面积增大，荧光峰强度值变小。最高λex发生红移，荧光峰最大值衰减，推测是由于咖啡中的CGA、TRG等物质分解及其他咖啡中化合物转化有关。烘焙咖啡与生咖啡浸提液相比荧光峰偏移的大小不同。
结合文献，荧光指纹图和荧光位移表来看，3DEEM可以明显区分咖啡生豆浸提液和烘焙咖啡浸提液，但由于咖啡成分的复杂性，在区分咖啡品种方面较为困难。不同品种咖啡豆样品最高峰峰值及主荧光峰位移见表2。
表2 不同品种咖啡豆样品最高峰峰值及主荧光峰位移
Table 2 Maximum peak-to-peak value and main fluorescence peak displacement table of 5 different species of coffee beans
波长 A B C D E生咖啡豆 λex 401.0 403.0 402.0 409.0 409.0 λem 480.0 480.0 480.0 480.0 480.0熟咖啡豆 λex 476.4 489.1 482.0 475.0 483.5 λem 559.3 565.4 563.9 557.7 563.9 λex位移 75.4 86.1 80.0 66.0 74.5 λem位移 79.3 85.4 83.9 77.0 83.9
2.3 利用3D-EEM对咖啡浸提液中CGA、CAF、TRG定量初探
不同品种生熟咖啡豆样品中CGA、CAF、TRG差异性对比见表3。
结合3D-EEM数据分析，发现所有咖啡在烘焙后的浸提液中CGA、CAF、TRG荧光值均有下降，通过公式计算，化合物相对含量=该化合物在咖啡液中特征荧光位置峰值/标准品特征荧光峰值×标准品浓度，得出该化合物的相对含量。可以看出不同品种咖啡生豆CGA含量为0.69%～1.38%，烘焙后下降为0.06%～0.11%；咖啡生豆CAF含量为4.12%～8.37%，烘焙后下降为1.71%～2.35%；咖啡生豆TRG含量为0.08%～0.10%，烘焙后下降为0.04%～0.08%。由于CAF在3DEEM中含有两个峰，在计算中只以主峰计算相对含量，因此存在结果偏低可能。除此以外，3D-EEM含量分析结果与邵金良等[25]研究结果接近。邵金良等研究表明咖啡及咖啡制品CGA含量为0.32%～6.24%，生咖啡豆＞焙炒咖啡豆；CAF含量1.10%～4.62%，焙炒咖啡豆＞生咖啡豆；TRG含量为0.09%～1.41%，生咖啡豆＞焙炒咖啡豆。CGA和CAF为第1主成分贡献率64.932%，TRG为第2主成分贡献率34.944%。3DEEM对咖啡中化合物定量的数据变化趋势也符合蔡瑞玲[26]、吕文佳[1]与Casal[27]等的研究表明，CGA在咖啡烘焙中，受热分解酯键断裂，生成奎宁酸及阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸等物质；TRG受热分解形成大量CO2及风味物质，因此，CGA和TRG在咖啡烘焙后含量均会下降。由于CAF热稳定性比较强，烘焙对其含量影响不大，但由于烘焙过程中水分丧失，会导致烘焙咖啡中CAF的相对含量高于咖啡生豆。
表3 不同品种生熟咖啡豆样品中CGA、CAF、TRG差异性对比
Table 3 Differences of CGA，CAF and TRG in 5 different varieties of cooked coffee beans
生豆 800.2 0.94 688.5 0.81 585.4 0.69 1175.0 1.38 645.8 0.75烘焙豆 50.4 0.06 73.0 0.08 85.2 0.10 91.5 0.11 85.2 0.10 CAF 主峰 λex/λem=414.0/681.0品种 A B C D E荧光值 相对含量/% 荧光值 相对含量/% 荧光值 相对含量/% 荧光值 相对含量/% 荧光值 相对含量/%CGAλex/λem=372.0/457.0生豆 323.2 4.35 306.3 4.12 404.0 5.43 622.6 8.37 388.1 5.21烘焙豆 170.3 2.29 141.4 1.90 127.5 1.72 175.1 2.35 150.9 2.02 TRGλex/λem=334.0/380.0生豆 83.6 0.08 83.7 0.08 79.6 0.08 106.4 0.10 83.4 0.08烘焙豆 37.8 0.04 67.0 0.06 79.9 0.08 80.9 0.08 81.3 0.08
目前，尚无利用3D-EEM测定咖啡中CGA、CAF、TRG的报道，利用3D-EEM对标准品进行指纹图谱建立，利用化合物特征荧光光谱定量，也存在一些问题。1）该技术对所检测的物质有一定限制，检测过程中必须能够捕捉到荧光信息；2）荧光强度会受到环境因素的影响；3）荧光会受到溶液介质中微小粒子或分子的影响而产生散射峰（主要是瑞利散射和拉曼散射）[28]。作为初探本文并未采用加权法、德劳内三角形内插值法、平行因子等方法[29]进行去瑞利散射和拉曼散射，此外在定量方面也未进行加样回收率测试，未来尚需进一步研究。
3 结论
本文初探了不同品种生咖啡、烘焙咖啡浸提液中CGA、CAF、TRG的 3D-EEM分析方法。发现 CGA、CAF、TRG均有特征荧光峰，不同品种生咖啡、烘焙咖啡浸提液的3D-EEM图谱具有差异性。生咖啡浸提液在发射波长为365 nm～761 nm范围内会出现特征荧光峰，且荧光峰有各自的特点，易于区分。咖啡烘焙后的浸提液荧光特征最高峰的激发波长、发射波长向高波长区段移动，发生了荧光峰红移现象，不同品种烘焙咖啡浸提液荧光峰位移大小有差异。利用3D-EEM结合特征峰强度计算烘焙前后咖啡浸提液中3种特征成分含量，可知CGA、CAF、TRG在烘焙后含量均有下降。因此，3D-EEM可对不同地区咖啡豆浸提液中CGA、CAF、TRG含量进行初步分析，可以明显区分咖啡生豆浸提液和烘焙咖啡浸提液，但由于咖啡成分的复杂性，在区分咖啡品种方面较为困难。
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