小麦粉是制作传统馒头常用的原料，因为含有麸质即面筋，在产品制作过程中形成三维网络结构，能够保留酵母发酵过程中产生的二氧化碳，并在蒸汽作用下拉伸，形成最终产品所特有的结构和蜂窝状纹理。尽管麸质在馒头制作过程中发挥着重要的作用，但是部分人群摄入麸质，会引发一种免疫介导疾病——乳糜泻，不摄入含有麸质的食品是目前最有效的预防方法[1]。由于无麸质谷物粉不含麸质，故无麸质产品与小麦制品有很大差距，所以使用无麸质谷物粉生产高品质馒头成为了一项重大的技术挑战[2-3]。
玉米富含维生素和功能性物质，具有预防高血压、延缓脑功能退化等功能[4]。大豆中含有多种人体必需氨基酸，蛋白质含量较高，具有保护心脏、美容养颜等功效[5]。糯米粉多为支链淀粉，其独特的理化特性，富含钙、铁、磷等多种营养物质，具有健胃养脾，缓解腹胀腹泻等功能特性[6]。本试验以玉米粉、大豆粉和糯米粉为原料生产无麸质谷物馒头，制作过程中添加适量的碱性蛋白酶、植物乳杆菌和谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TG酶）改善其质构与品质，为无麸质谷物馒头研究开发提供基础[7-8]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
生黄豆粉（26.2%蛋白质，6.0%脂肪，41.2%碳水化合物，11.0%含水量）、玉米粉（6.7%蛋白质，11%脂肪，71.4%碳水化合物，12.4%含水量）：山东美乐嘉食品有限公司；糯米粉（7.6%蛋白质，0.9%脂肪，80.5%碳水化合物，12.3%含水量）：新乡良润全谷物食品有限公司；碱性蛋白酶（酶活10万U/g）：河南万邦实业有限公司；植物乳杆菌：善恩康生物科技（苏州）有限公司；TG酶（酶活10万U/g）：东圣生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
生化培养箱（SPX-150B-Z）：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；中式电蒸锅（MZ-SYS28-2B）：广东美的生活电器制造有限公司；质构仪（TA-XT Plus）：英国Stable Micro Syetems公司；旋转流变仪（Discovery HR-1）：美国 TA 公司；混合试验仪（Mixolab2）：法国肖邦技术公司；电子天平（JY5002）：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
无麸质谷物馒头制作工艺流程：原料粉→加水混合→搅拌→一次发酵（碱性蛋白酶；pH8.0；60 min）→二次发酵（植物乳杆菌；pH6.5、TG酶；90 min）→切分→揉圆→醒发→蒸制→冷却→成品。
1.3.2 配料
普通无麸质馒头基础配方：大豆粉30 g，玉米粉30 g，糯米粉 40 g，小苏打 1.3 g，酵母 0.6 g，泡打粉0.6 g，半胱氨酸 0.8 g，胱氨酸 0.8 g，水 60 g。
1.3.3 单因素试验
选取大豆粉、玉米粉和糯米粉为原料，利用混合试验仪确定混合粉的配比，在此基础上，探讨碱性蛋白酶、植物乳杆菌和TG酶3种添加物的添加量对无麸质谷物馒头质构特性和感官品质的影响，添加物以干粉为基准进行添加，进行单因素试验[9-11]，试验方案如表1所示。
表1 单因素试验
Table 1 Single factor experiment
添加物 添加量/% 其它条件碱性蛋白酶3.5、4.0、4.5、5.0、5.5 植物乳杆菌添加量为2.5%，TG酶添加量为2.5%植物乳杆菌1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 碱性蛋白酶添加量为4.5%，TG酶添加量为2.5%TG酶 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 碱性蛋白酶添加量为4.5%，植物乳杆菌添加量为2.5%
1.3.4 制备条件优化
综合考察单因素试验结果，采用Box-Behnken方法设计响应面模型，选择碱性蛋白酶添加量、植物乳杆菌添加量和TG酶添加量为影响因素，以馒头的感官评分为响应值，采用三因素三水平的响应面法进行试验[12]。试验设计见表2。
表2 响应面因素水平编码表
Table 2 Response surface factor level coding table
水平C TG酶添加量/%-1 4 2 2 0 4.5 2.5 2.5 1 5 3 3因素A碱性蛋白酶添加量/%B植物乳杆菌添加量/%
1.3.5 面粉粉质特性的测定
混合试验仪是测定面粉与水经混合形成面团的过程中面团流变特性变化的仪器。测定开始时，将谷物粉加入面钵中，混合试验仪根据面粉的水分含量计算出吸水率并自动添加蒸馏水，由两个“s”形的搅拌刀进行搅拌，在对应的时间内记录两个搅拌刀对面团的力矩（N·m），根据相应的力矩参数分析不同比例谷物粉的粉质特性[13]。混合试验仪工艺参数如表3所示。混合试验仪参数含义如表4所示。
表3 混合试验仪参数的设定
Table 3 Mixing experimenter parameter settings
进程温度梯度/（℃/min）温度/℃时间/min第1阶段 30 8第2阶段梯度 4 15第2阶段 90 7第3阶段梯度 -4 10第3阶段 50 5
表4 混合试验仪参照表
Table 4 Hybrid experiment instrument reference table
参数 参数释义C1 揉混面团时扭矩最大值，用于测定吸水率C2 用于测定在机械力和加热过程中，蛋白质弱化特性C3 糊化黏度最大值，用于测定淀粉特性C4 用于测定淀粉糊化热稳定性C5 用于测定冷却过程中淀粉回生特性吸水率（湿基14%） C1达到（1.1±0.5）N·m区间所需加水量，即面粉吸水达到给定黏度所需水量C1时间（形成时间）/min 达到C1所需时间，面团形成时间越长，面筋强度越强稳定时间/min 力矩在C1～11%C1的时间，表示面团的耐揉性、稳定时间越长，面筋强度越强C3时间/min 达到最大黏度所需时间，表示糊化时间。糊化时间越短，烹煮时间越短C1-C2/（N·m）表示蛋白弱化特性，值越大说明蛋白质弱化程度越大C3-C2/（N·m）表示淀粉糊化特性，值越大说明淀粉糊化特性增强，黏度变大C3-C4/（N·m）表示淀粉糊化热稳定性，值越小淀粉糊化热稳定性越强C5-C4/（N·m）表示淀粉回生特性，值越大表示淀粉越容易回生
1.3.6 质构特性
取20 mm×20 mm×20 mm的馒头芯，25℃冷却1 h，用质构分析仪测定馒头的硬度、弹性、胶着度、咀嚼度等参数。试验参数如下：压缩率50%，速度为1 mm，触发力0.05 N，两种压缩过程停留时间为10 s，探头为P50[14]。
1.3.7 馒头的感官评定
参照GB/T 35991-2018《粮油检验小麦粉馒头加工品质评价》，选用6名有感官评定经验且经过训练的人员（其中男性、女性各3名），对无麸质谷物馒头进行感官评价，取平均值[15]（具体的馒头品质评分精确到0.01分）。无麸质谷物馒头感官评分标准见表5。
表5 馒头感官品质评分表
Table 5 Steamed bread sensory quality rating table
项目 评分标准比容（20分） 比容大于或等于2.8 mL/g得满分20分；比容小于或等于1.8 mL/g得最低分5分；每下降0.1扣1.5分宽高比（5分） 宽高比小于或等于1.40得最高分5分；大于1.60得最低分0分；在1.40～1.60之间每增加0.05扣1分弹性（10分） 手指按压回弹性：8分～10分；手指按压回弹性弱：6分～7分；手指按压不回弹或按压困难：4分～5分表面色泽（10分） 光泽性好：8分～10分；稍暗：6分～7分；灰暗：4分～5分表面结构（10分） 表面光滑：8分～10分；皱缩、塌陷、有气泡或烫斑：4分～7分内部结构（20分） 气孔细腻均匀：18分～20分；气孔细腻基本均匀，有个别气泡：13分～17分，边缘与表皮有分离现象，扣1分；气孔基本均匀，但有下列情况之一的：10分～12分，过于细密，有稍多气泡，气孔均匀但结构稍显粗糙；气孔不均匀或结构很粗糙：5分～9分韧性（10分） 咬劲强：8分～10分；咬劲一般：6分～7分；咬劲差，切时掉渣或咀嚼干硬：4分～5分黏性（10分） 爽口不粘牙：8分～10分；稍粘牙：6分～7分；咀嚼不爽口，很粘牙：4分～5分食味（5分） 正常小麦固有的香味：5分；滋味平淡：4分；有异味：2分～3分
1.3.8 流变特性
取经发酵后的面团2 g，使用带有40 mm平行板探头的流变仪进行测定，间隙为1 mm，温度为25℃，频率为0.1 Hz～10 Hz，应变为0.2%，分别测量弹性模量（G′）和黏性模量（G″），评估其流变特性[16]。
1.4 数据处理
试验均进行3次重复，数据以
±s形式表示，应用Origin 8.5软件绘制图表，差异显著性采用SPSS19.0分析处理。响应面图与回归方程的处理均用Design-Expert 8.0.6软件，P＜0.05表示显著影响，P＜0.01表示极显著影响。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果分析
2.1.1 粉配比对谷物粉粉质特性的影响
不同比例的谷物粉对谷物粉粉质特性的影响见表6。
粉配比为大豆粉∶糯米粉∶玉米粉=3∶3∶4的条件下，目标力矩（C1）接近1.1，且C1-C2值最小，表明蛋白质弱化程度较小[17]。在此比例下，淀粉糊化特性较大，糊化稳定性最强，不容易回生，此时的面粉特性较其它比例更适合制作馒头。分析原因可能是粉配比在3∶3∶4情况下，糯米粉的增加，能够提升混合粉的吸水率，使混合粉接近面粉特性，粉质特性较好[18]。
表6 粉配比对谷物粉粉质特性的影响
Table 6 Effect of powder ratio on the grain characteristics of grain flour
粉配比（大豆粉∶糯米粉∶玉米粉）力矩/（N·m）C1 C2 C3 C4 C5 C1-C2 C3-C2 C3-C4 C5-C4 3∶6∶1 1.633 0.744 0.982 0.801 1.047 0.889 0.238 0.181 0.246 3∶5∶2 1.027 0.759 1.221 1.140 1.632 0.268 0.462 0.081 0.492 3∶4∶3 1.242 0.773 1.325 1.284 1.606 0.469 0.552 0.041 0.322 3∶3∶4 1.104 0.920 1.490 1.463 1.556 0.184 0.570 0.027 0.093 3∶2∶5 1.435 0.855 1.298 0.887 1.220 0.580 0.443 0.411 0.333 3∶1∶6 0.961 1.409 0.961 1.409 1.828 0.448 0.448 0.448 0.419
2.1.2 碱性蛋白酶添加量对无麸质谷物馒头品质的影响
向谷物粉中分别添加3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%的碱性蛋白酶（碱性蛋白酶的添加量以玉米、大豆和糯米的混合粉为基准），测定其质构特性，结果见表7。
由表7可知，随着碱性蛋白酶添加量的增加，硬度和咀嚼性均呈现先减少后平稳的趋势。馒头质构分析在一定范围内，硬度和咀嚼性数值越小，馒头越柔软。较高弹性和胶着度在一定程度上反映了馒头具有较好的膨胀性、柔韧性和组织结构稳定性[3]。分析原因可能是酶解作用破坏蛋白质内部结构，构架失去支撑作用，硬度减小，咀嚼性也随之减小，弹性较强，此时无麸质谷物馒头较为柔软。结合感官品质评分，确定碱性蛋白酶的合适添加量为4.5%。
表7 碱性蛋白酶添加量对馒头品质及感官评分的影响
Table 7 Effect of alkaline protease on quality and sensory score of steamed bread
注：同列不同字母表示同一指标不同添加量之间的差异显著（P<0.05）。
试验号 添加量/% 硬度/g 弹性/g 胶着度/N 咀嚼性 感官评分1 3.5 1 024.966±25.106a 0.188±0.014c 191.686±3.461a 35.052±1.619a 67.53 2 4.0 867.921±37.042b 0.226±0.004b 196.825±5.357a 29.208±3.105b 68.33 3 4.5 482.634±4.467e 0.512±0.014a 91.844±6.104b 11.609±1.313c 70.04 4 5.0 520.142±8.320d 0.147±0.003d 91.888±0.477b 12.659±0.592c 69.17 5 5.5 545.707±6.854c 0.149±0.005d 67.426±1.044c 11.348±0.130c 69.43
2.1.3 植物乳杆菌添加量对无麸质谷物馒头品质的影响
面团配方如1.3.2操作，向面团中分别添加1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%植物乳杆菌（植物乳杆菌的添加以玉米、大豆和糯米的混合粉为基准），测定其质构特性，试验结果如表8所示。
由表8可知，硬度和咀嚼性随植物乳杆菌的添加呈现先下降再上升的趋势，当添加量为2.5%时，硬度和咀嚼性相对较低，表明此时无麸质谷物馒头较为柔软。植物乳杆菌降解糖类和蛋白质，产生有机酸和游离氨基酸后，pH值降低，为TG酶发挥最大活力提供适宜条件，促进其发挥最大作用[19]。结合感官品质评分，确定植物乳杆菌的合适添加量为2.5%。
表8 植物乳杆菌添加量对馒头品质及感官评分的影响
Table 8 Effects of Lactobacillus plantarum on quality and sensory score of steamed bread
注：同列不同字母表示同一指标不同添加量之间的差异显著（P<0.05）。
试验号 添加量/% 硬度/g 弹性/g 胶着度/N 咀嚼性 感官评分1 1.5 525.464±13.815c 0.145±0.003b 63.768±3.363b 15.344±2.279a 65.00 2 2.0 431.999±3.351b 0.138±0.003b 80.689±0.663a 12.851±1.482ab 67.33 3 2.5 357.528±3.581e 0.190±0.012a 63.274±7.317b 10.439±0.146b 70.18 4 3.0 378.976±2.927d 0.145±0.005b 67.221±1.993b 12.046±1.300b 68.33 5 3.5 451.347±6.453a 0.148±0.002b 85.027±2.116a 12.149±0.774b 66.67
2.1.4 TG酶添加量对无麸质谷物馒头品质的影响
面团的制备工艺如1.3.1所述，配方如1.3.2所述，向面团中分别添加1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%TG酶（TG酶的添加以玉米、大豆和糯米的混合粉为基准），测定其质构特性，结果见表9。
由表9可知，随着TG酶添加量的增加，馒头的硬度和咀嚼性先下降再上升，弹性呈相对平稳的趋势。TG酶添加量为混合粉的2.5%时，无麸质谷物馒头的硬度和咀嚼性较低，表明馒头较为柔软。分析原因可能是面团在发酵过程中TG酶促进蛋白质进行交联，蛋白质网状结构强度增大，利于馒头成型[20]。但随着TG酶添加量增加，吸水量持续增大，面团黏度增加，发酵性能降低。结合感官品质评分，确定TG酶的合适添加量为2.5%。
表9 TG酶添加量对馒头品质及感官评分的影响
Table 9 Effects of TG enzyme on quality and sensory score of steamed bread
注：同列不同字母表示同一指标不同添加量之间的差异显著（P＜0.05）。
试验号 添加量/% 硬度/g 弹性/g 胶着度/N 咀嚼性 感官评分1 1.5 439.103±3.554b 0.142±0.005c 70.670±3.632bc 12.695±0.715a 63.00 2 2.0 393.685±3.466c 0.152±0.009ab 53.077±3.794d 9.575±1.826b 66.67 3 2.5 352.907±8.741e 0.156±0.003a 72.543±1.110b 8.526±1.387b 69.83 4 3.0 381.864±1.040d 0.145±0.002bc 64.718±5.511c 10.461±1.292ab 67.52 5 3.5 479.592±5.892a 0.152±0.002ab 88.161±0.874a 12.226±1.263a 62.17
由单因素试验结果可知，碱性蛋白酶添加量为4.5%、植物乳杆菌添加量为2.5%、TG酶添加量为2.5%时，馒头品质特性较好。感官评价能够直观地反映出无麸质谷物馒头的品质，综合分析，选取感官评分为响应值进行响应面分析，确定出3种添加物添加量的最优组合。
2.2 响应面优化试验
2.2.1 回归模型的建立与分析
对碱性蛋白酶添加量（A）、植物乳杆菌添加量（B）、TG酶添加量（C）进行三因素三水平响应面试验，试验结果见表10。方差分析见表11。
表10 响应面设计方案及结果
Table 10 Design scheme and result of response surface
因素序号 A碱性蛋白酶添加量B植物乳杆菌添加量C TG酶添加量感官评分1 1 0-1 68.17 2 0 0 0 71.83 3-1 1 68.00 4 0 0 0 71.50 0 5 0 72.33 6-1 -1 0 69.00 7 1 0 1 67.00 0 0 8-1 0 1 66.50 9 1-1 0 69.33 10 0 0 0 72.83 11 -1 0 -1 67.83 12 0 0 0 72.17 13 0 -1 -1 69.83 14 0 1 1 67.67 15 1 1 0 66.67 16 -1 1 0 67.67 17 0 1 -1 66.33
采用Design-Expert试验设计软件对表10的数据进行多元回归拟合，得到二次多项式回归方程：Y=72.13+0.21A-0.98B-0.37C+0.04AB+0.79AC+0.37BC-2.27A2-1.69B2-2.48C2。
表11 回归模型方差分析
Table 11 Variance analysis of regression model
注：P＜0.01 表示极显著，0.01＜P＜0.05表示显著。
项目 平方和 自由度 均方 F值 P模型 78.29 9 8.70 33.61 ＜0.000 1 A 3.613×10-3 1 3.613×10-3 0.014 0.909 B 7.64 1 7.64 29.53 0.001 C 1.12 1 1.12 4.32 0.076 AB 0.44 1 0.44 1.71 0.233 AC 6.400×10-3 1 6.400×10-3 0.025 0.880 BC 2.51 1 2.51 9.71 0.017 A2 21.76 1 21.76 84.09 ＜0.000 1 B2 12.04 1 12.04 46.52 0.001 C2 25.97 1 25.97 100.34 ＜0.000 1残差 1.81 7 0.26失拟项 0.79 3 0.26 1.04 0.466纯误差 1.02 4 0.25总离差 80.10 16
由表11可知，影响无麸质谷物馒头感官评分的顺序为：植物乳杆菌添加量＞TG酶添加量＞碱性蛋白酶添加量。回归方程模型P＜0.000 1，该模型极显著，失拟项P=0.466不显著，说明该回归方程是可行的。模型的决定系数R2为0.977 4，R2adj为0.948 3，表明感官评分的实际值与预测值拟合较好。由此可知，各试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。
2.2.2 响应面两两因素间交互作用
绘制响应面三维立体图见图1～图3[21]。
由图1可知，当TG酶添加量一定时，碱性蛋白酶添加量与植物乳杆菌添加量交互作用不显著，植物乳杆菌添加量对感官评分影响显著，且随植物乳杆菌添加量的增加先上升后下降。由图2可知，当植物乳杆菌添加量一定时，碱性蛋白酶添加量与TG酶添加量交互作用不显著。由图3可知，植物乳杆菌添加量和TG酶添加量交互作用显著，感官评分随两种添加物添加量的增加变化较大。利用Box-Behnken设计响应面对试验结果进行优化，得出最佳工艺参数：碱性蛋白酶添加量为4.5%，植物乳杆菌添加量为2.4%，TG酶添加量为2.3%，模型预测感官评分为72.313。为验证试验可靠性，选取最优添加量制作无麸质谷物馒头进行感官评定，取3组平行，感官评分平均值为71.667，与预测值相符，表明响应面优化无麸质谷物馒头加工工艺的可靠性较高[22-24]。
图1 碱性蛋白酶添加量和植物乳杆菌添加量对馒头感官评分的影响
Fig.1 Effects of alkaline protease and Lactobacillus plantarum on sensory evaluation of steamed bread
图2 碱性蛋白酶添加量和TG酶添加量对馒头感官评分的影响
Fig.2 Effects of alkaline protease and TG enzyme on sensory evaluation of steamed bread
图3 植物乳杆菌添加量和TG酶添加量对感官评分的影响
Fig.3 Effects of Lactobacillus plantarum and TG enzyme on sensory evaluation
2.3 优化结果对面团流变学特性的影响
根据响应面试验预测的最佳工艺参数，做3组重复试验，分别测试其面团的流变学特性，结果如图4所示。
图4 优化结果对面团流变学特性影响
Fig.4 Influence of optimization results on the rheology of dough
动态流变通常用于表征面团及面筋蛋白的黏弹性质。由图4可知，随振动频率的升高，3组平行试验的G′和G″均呈上升趋势，表明面团的黏弹性较佳。第1组和第2组试验中G′＞G″，第3组试验中虽然G′＜G″，但是其黏弹性均高于第1、2组，以上结果表明通过最优配方制作出的面团柔软性较好，耐形变能力较强，面团内部结构较为坚实，面团具有较好的加工性能[25]。
3 结论
本试验在确定玉米粉、大豆粉和糯米粉合理配比的基础上，研究碱性蛋白酶、植物乳杆菌和TG酶的添加量对无麸质谷物馒头质构及品质的影响。在单因素试验的基础上，以感官评分为响应值，通过响应面法确定了无麸质谷物馒头的最优工艺配方。当谷物粉（大豆粉、糯米粉和玉米粉质量比为3∶3∶4）为100 g时，碱性蛋白酶添加量为4.5%，植物乳杆菌添加量为2.4%，TG酶添加量为2.3%，按此配方制作的无麸质谷物馒头感官评分为71.667分，品质较好。
在今后的研究中，需要对面团形成的网状结构进行分析，探索添加物对于面团的作用，寻找酶类相关替代物，解决经济问题。
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