缺铁性贫血病（iron deficiency anemia，IDA）是全球最常见的贫血病之一。采用第一代、第二代补铁剂治疗IDA具有副作用大、对肠胃刺激明显等不足。多糖铁作为第三代补铁剂通过降低患者的血清转铁蛋白受体的含量，提高血清铁蛋白的含量来改善血液学指标[1]，具有与常规硫酸亚铁相同的补铁作用。由于其中的铁在肠胃中以分子形式存在，不会对胃肠道产生刺激作用及不出现二价铁常有的轻微呕吐、腹泻或便秘等症状[2]，因此，多糖铁类补铁剂的研发备受学者的青睐。
目前，多糖铁类补铁剂的研究主要包括银耳[3]、紫菜[4]、茶叶[5]、大枣[6]等常见的植物类多糖铁复合物及人参[7]、白芍[8]、当归[9]、党参[10]、黄芪[11]等中药类多糖铁复合物。其中中药类多糖铁复合物具有自身活血补血的特点[12]。
多糖铁类复合物（polysaccharide-ironcomplex，PIC）是以植物多糖为载体，络合三价铁后得到的，采用化学合成方法制备[13-14]。根据铁盐的特殊反应，采用红外光谱法可以对多糖-铁（Ⅲ）进行定性鉴别[9，15-17]。
玛咖作为一种药食两用植物，具有极高的营养价值[18]。其主要成分——玛咖多糖不仅具有调节免疫力、抗疲劳、抗氧化、抗衰老等作用[19-21]，在治疗贫血方面也具有一定的功效[8]。至今虽然研究玛咖多糖[22-24]及PIC[3-11]的报道不少，但尚未有玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的研究报道。
本文报道了玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的制备方法，并对其进行了定性表征和定量分析。以期这种制备玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的研究思路能为其它大分子螯合铁类补铁剂的研发提供参考。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
UV-8000s型紫外-可见分光光度计：上海菁海仪器有限公司；ALPHA-Ⅱ型红外光谱仪：德国布鲁克·道尔顿公司；PHS25型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司。
1.2 试剂及配制
硫酸亚铁胺[Fe（NH4）（2SO4）2·6H2O]、邻菲罗啉、葡萄糖、亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]、三氯化铁（FeCl3·6H2O）、硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）、柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2H2O）、盐酸羟胺（NH2OH·HCl）、醋酸钠、氢氧化钠、盐酸、冰乙酸、无水乙醇、乙醚、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、浓硫酸（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；α-淀粉酶（3 700 U/g，生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司。
100 mg/L铁（Ⅱ）标准储备液：精密称取0.702 3 g硫酸亚铁胺，溶于少量蒸馏水后，加入3 mL盐酸，定容至1 000 mL。
10.0 mg/L铁（Ⅱ）标准使用液（使用时现配）：精确吸取10.00 mL铁（Ⅱ）标准储备液稀释至100 mL。
500 mg/L柠檬酸钠溶液：称取0.500 0 g Na3C6H5O·7 2H2O溶于蒸馏水中，稀释至1 000 mL。
邻菲罗啉显色液：称取0.1 g邻菲罗啉，溶解于加有2滴盐酸的蒸馏水中，稀释至100 mL。
10%盐酸羟胺溶液：称取10 g NH2OH·HCl溶解并稀释至100 mL。
醋酸钠缓冲液（pH4.5）：称取68 g醋酸钠溶于500mL蒸馏水中，加入冰乙酸28.8mL，稀释至1000 mL。
0.01 mol/L三氯化铁溶液：称取0.270 3 g FeCl3·6H2O用蒸馏水溶解并稀释至100 mL。
0.01mol/L的硫酸亚铁溶液：称取0.2780 g FeSO·4 7H2O用蒸馏水溶解并稀释至100 mL。
0.5 mol/L氢氧化钠溶液：称取2 g氢氧化钠用蒸馏水溶解并稀释至100 mL。
10%的亚铁氰化钾溶液：称取10 g亚铁氰化钾用蒸馏水溶解并稀释至100 mL。
玛咖：云南省昆明市丰熙茶行。
2 方法
2.1 玛咖多糖的提取
玛咖切片粉碎后，准确称取100g玛咖粉末，按照料液比1∶20（g/mL）加入蒸馏水，超声 40 min 后，将溶液在90℃下浸提2 h，离心5 min，弃去沉淀，蒸发上清液。
用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS）调节 pH值至6.0左右，加入α-淀粉酶，在60℃下酶解，随后加入无水乙醇醇析12 h；离心5 min收集沉淀，加入蒸馏水溶解，采用Sevag法除蛋白。对蛋白除尽的液体再次醇析12 h后，用乙醚、丙酮洗涤沉淀2次，真空干燥后，保存备用。采用该法得到的玛咖多糖为5.291 5 g，产率约为5.29%。
Sevag法除蛋白：移取玛咖多糖溶液100 mL，按体积比5∶1加入三氯甲烷-正丁醇（5∶1，体积比）混合液，振摇30 min，经离心分离后吸取上清液。重复此过程，直至玛咖多糖稀释液在260 nm～280 nm不出现吸收峰。
2.2 玛咖多糖-Fe（Ⅲ）配合物的制备
移取1 mL 500 mg/L玛咖多糖溶液、0.25 mL柠檬酸钠溶液和3 mL三氯化铁溶液，用0.5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值，用蒸馏水补至15 mL。将上述溶液分别置于不同温度的水浴中加热1 h。即得玛咖多糖-Fe（Ⅲ）配合物。
3 结果与讨论
3.1 玛咖多糖-Fe（Ⅲ）配合物最佳反应条件的探究
向玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物溶液中加入1 mL 10%盐酸羟胺溶液、2.5 mL邻菲罗啉溶液和5 mL醋酸钠溶液，用蒸馏水稀释至50 mL，显色15 min后，测定吸光度，考察反应温度、pH值、络合时间对玛咖多糖-Fe（Ⅲ）配合物吸光度的影响。
3.1.1 温度与pH值的选择
反应温度和pH值对玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物吸光度的影响见图1。
从图1可见，当温度为70℃、pH9时，吸光度最低，表明此时游离Fe3+浓度最小，玛咖多糖和Fe（Ⅲ）的络合程度最高。
图1 反应温度和pH值对玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物吸光度的影响
Fig.1 The effect of temperature and pH value on absorbance of Maca polysaccharide-Fe（Ⅲ）complex
3.1.2 络合时间的选择
在pH9的反应条件下，控制反应温度为70℃，在不同络合时间下测定样品的吸光度，结果见图2。
图2 络合时间对玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物吸光度的影响
Fig.2 The effect of time on absorbance of Maca polysaccharide-Fe（Ⅲ）complex
由图2可见，随着反应时间的延长，吸光度先减小后增大，当络合时间为150 min时吸光度最低。
综上所述，制备玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的最佳反应条件为：溶液pH9，反应温度70℃，反应时间150min。
3.2 玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的定性鉴别
3.2.1 配合物的性质
采用该方法制备得到的玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物为无臭、无味、易溶于水、不溶于有机试剂的棕色粉末。
在0.01 mol/L的三氯化铁溶液、0.01 mol/L的硫酸亚铁溶液和500 mg/L玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物溶液中分别滴加0.5 mol/L的氢氧化钠标准溶液，用pH酸度计测定它们分别在刚产生沉淀和产生大量沉淀时的pH值。结果发现：三氯化铁溶液刚产生沉淀时的pH值为2.56，产生大量沉淀时的pH值为6.62；硫酸亚铁溶液刚产生沉淀时的pH值为3.33，产生大量沉淀时的pH值为5.57；而玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物在pH值≥13时都没有出现沉淀现象，这一事实表明玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物在碱性条件下具有一定的稳定性。
3.2.2 游离铁的鉴别
取少量500 mg/L玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物溶液，加入10%的亚铁氰化钾溶液，未见普鲁士蓝沉淀现象发生，表明配合物中没有游离的Fe3+。
取少量玛咖多糖-铁（Ⅲ）溶液，滴加0.5 mol/L氢氧化钠溶液，无明显现象，进一步表明配合物中没有游离的Fe3+。
3.2.3 络合铁的鉴别
移取10 mL玛咖多糖-铁（Ⅲ）溶液，加入5 mL浓盐酸，煮沸5 min。溶液由透明棕色变为透明黄色。冷却后，加入10%的亚铁氰化钾溶液，出现普鲁士蓝沉淀现象，说明该配合物为玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物。
取同样量的玛咖多糖-铁（Ⅲ）溶液进行酸化煮沸后，滴加0.5 mol/L氢氧化钠溶液，溶液迅速产生红棕色沉淀，进一步说明该配合物为玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物。
3.3 玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的结构分析
3.3.1 紫外-可见吸收光谱分析
邻菲罗啉分光光度法作为表征和检测多糖铁中铁含量的主要方法在多糖铁的合成中被广泛应用。由于玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物中不含有游离的Fe3+，但当加入强酸加热后，再向溶液加入鉴别试剂时却能表现出特殊的铁盐反应。玛咖多糖和玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的紫外-可见吸收光谱见图3。
图3 玛咖多糖和玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的紫外-可见吸收光谱
Fig.3 The ultraviolet-visible absorption spectra of Maca polysaccharides and Maca polysaccharides-Fe（Ⅲ）complex
a.玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物50 mg/L；b.玛咖多糖500 mg/L。
由图3可知，玛咖多糖的吸收峰出现在340 nm左右；而玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的吸收峰出现在270 nm。通过与玛咖多糖的吸收光谱进行对比，发现玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的吸收峰在波长200 nm～450 nm时上升缓慢，但吸光度均大于玛咖多糖的吸光度。
综上，玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的紫外吸收光谱出现的明显变化归因于结构的改变，即表明采用该方法可以成功地制得玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物。
3.3.2 红外吸收光谱分析
采用KBr压片法分析了样品的红外吸收光谱。图4为玛咖多糖和玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的红外谱图。
图4 玛咖多糖和玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的红外吸收光谱
Fig.4 Infrared absorption spectra of Maca polysaccharides and Maca polysaccharides-Fe（Ⅲ）complex
a.玛咖多糖；b.玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物。
通过对比发现，这两种物质的红外光谱图存在显著的差异。玛咖多糖在3 600 cm-1～3 100 cm-1处出现精确的吸收峰，而玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物只在3 412 cm-1处出现一个强吸收峰，对应于O-H的伸缩振动；玛咖多糖在1 668 cm-1处出现的吸收峰对应于C=O伸缩振动，在1 417 cm-1处出现的吸收峰对应于C-O伸缩振动，在1 078 cm-1处出现的吸收峰对应于C-O-C的对称伸缩振动；玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物在这3处的吸收峰增强并移动到1 598、1 402 cm-1和1 142 cm-1处。玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的红外谱图在848 cm-1出现了铁的氢氧化物的特征吸收峰。这是由于铁（Ⅲ）与玛咖多糖的络合引起-OH吸收峰发生改变。这一结果说明玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物中的-OH参与了Fe3+的配位反应。
3.4 玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物中铁含量的测定
由于在强酸且加热的条件下，玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物的结构会被破坏，导致络合铁变为游离铁[10]，因此采用邻菲罗啉分光光度法测定玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物中铁的含量。
3.4.1 标准曲线的绘制
移取 10 mg/L 标准铁溶液 0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00mL及10.00mL，分别加入10%盐酸羟胺溶液1mL、邻菲罗啉显色液2.5 mL和1 mol/L醋酸钠溶液5 mL，用蒸馏水稀释至50 mL，摇匀，放置10 min～15 min，以第一份溶液为参比，测定510 nm处的吸光度。以铁浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线,如图5所示，得到回归方程：A=0.214 4c-0.013 7，R2=0.991 8。
图5 铁溶液的标准曲线
Fig.5 The standard calibration curve of iron solution
3.4.2 样品中铁的含量
准确称取0.010 0 g玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物，加入3 mL浓盐酸溶液和少量蒸馏水，煮沸5 min，冷却至室温（25℃）后，定容至100 mL。分别从中吸取0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 置于比色管中，按 3.4.1 方法测定溶液的吸光度（n=3），结果见表1。
表1 样品中铁含量的测定
Table 1 Determination of the content of Fe（Ⅲ）in Maca polysaccharides-Fe（Ⅲ）complex
编号 吸光度 浓度/(μ g/m L) 铁含量/%1 0.0 4 3 4 0.2 6 6 3 1 3.3 2 2 0.1 0 1 3 0.5 3 6 4 1 3.4 1 3 0.1 5 7 0 0.7 9 6 2 1 3.2 7 4 0.2 1 3 5 1.0 5 9 7 1 3.2 5 5 0.2 7 2 0 1.3 3 2 6 1 3.3 1
计算得到玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物中铁含量为13.31%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.46%。
4 结论
本试验以玛咖粉为原料，采用热水浸提法结合超声波辅助法提取粗玛咖多糖，用Sevag法除去其中的游离蛋白质；采用三氯化铁法使提取纯化的玛咖多糖和铁（Ⅲ）反应制备玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物。该络合反应的最佳条件为：70℃、调节溶液的pH9，反应150min。该方法制备的玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物为无臭、无味、易溶于水、不溶于有机试剂，且具有良好稳定性的棕色粉末。采用邻菲罗啉分光光度法测定玛咖多糖-铁（Ⅲ）配合物中铁的含量为13.31%，RSD为0.46%。
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