随着我国茶产业经济的迅速发展，茶叶加工及深加工的规模与日递增，同时，茶产品加工过程中产生了大量废弃物，如茶渣、茶梗、茶碎末等。其中，茶梗以乌龙茶中的铁观音茶最为常见[1]，茶梗中主要含有茶多酚[2]、茶多糖[3]、生物碱[4]、芳香类物质[5]等活性成分，李杨等[6]测定铁观音茶梗中茶多酚含量为8.07%，茶多糖含量为1.10%，许雨石[7]测定铁观音茶梗中茶多酚含量为11.95%。目前，茶梗产量约占乌龙茶总量的20%，仅福建省安溪县每年茶梗产量就高达50000 t[7]，只有少量茶梗制成茶枕或空气吸附剂，造成资源的极大浪费[8]，若能对茶梗中的功能成分进行提取利用，既能提高茶叶的附加值，又能变废为宝，对资源优化和环境治理具有重要意义。
茶多酚（tea polyphenols，TP）又名茶单宁、茶鞣质，是茶叶中所含有的一类多羟基酚类化合物的总称，约占茶叶干重的18%～36%，在乌龙茶梗中含量为6%～13%。儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，约占到茶多酚总量的65%～80%[9]。茶多酚作为一种新型的天然抗氧化剂，具有杀菌和抑制细菌生长的作用，还可清除活性氧自由基、抑制脂质过氧化、抗衰老、抗辐射等，在食品、医药、农业、日用化工等领域应用前景广阔[10-11]。
目前，提取茶多酚的常用方法包括有机溶剂法、生物酶法、超声波辅助浸提法、微波辅助浸提法、沉淀法、超高压法、超临界萃取法[12-14]。其中，有机溶剂法存在试剂残留、安全隐患问题，超滤法、超压真空法、超临界萃取、超声波辅助浸提和微波辅助浸提所用的设备技术和经济成本高[15]，酶法最大优势是反应条件温和，茶多酚中有效成分儿茶素在提取过程中几乎不损失，有效成分的提取量高；同时所得产物纯度、稳定性、活性均较高，且无污染。此外，酶法还具有缩短提取时间、降低能耗、降低生产成本等优势[16]。本试验以乌龙茶梗中茶多酚提取量为考察指标，利用单因素试验和响应面优化试验研究生物酶法提取茶多酚的工艺条件，旨在为茶梗废弃物的精深加工提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
乌龙茶茶梗：市售，2019年产自福建省安溪县如意茶厂，茶梗粉碎后过40目筛。
果胶酶（≥1.1 U/mg）：美国Fluka公司；中性蛋白酶（≥50 000 U/g）：山东苏柯汉生物工程股份有限公司；纤维素酶（≥15 000 U/g）、福林酚试剂（分析纯）：国药集团；没食子酸标准品（＞98%，分析纯）：上海展云化工有限公司。
1.2 仪器与设备
ME204E电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；722N紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SHZ-82A水浴恒温振荡器：金坛市医疗仪器厂；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；SHB-III T循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；FZ102植物粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3 标准曲线制作及茶多酚含量测定
茶多酚含量测定参照国标GB/T 8318-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》的福林酚法[17]。称取0.110 g没食子酸于100 mL容量瓶中溶解并定容，摇匀后分别移取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的没食子酸标准液于100 mL容量瓶中，蒸馏水定容、摇匀。分别移取1.0 mL没食子酸标准液，加入5.0 mL 10%福林酚试剂摇匀，静置3 min～8 min，再加入4 mL 7.5%碳酸钠溶液，25℃室温静置60 min，765 nm波长处测定吸光值。以蒸馏水代替没食子酸标准液为空白组。以没食子酸浓度为横坐标、吸光值为纵坐标制作标准曲线，标准曲线方程为：y=0.011 7x+0.019 1，R2=0.998 1，说明测定范围内线性关系较好。吸取1.0 mL茶梗提取液于25 mL容量瓶中，移取上述1.0 mL供试液，按照标准曲线方程计算茶梗中茶多酚总含量及不同浸提条件下的茶多酚提取量。
1.4 单因素试验
1.4.1 酶种类对茶梗茶多酚提取量的影响
准确称取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），酶解温度50℃，反应时间50 min参数下，分别考察酶添加量为1.0%（以底物质量计）的5种酶体系[果胶酶（种类1），纤维素酶（种类2），果胶酶与纤维素酶合成复合酶（种类3），果胶酶，纤维素酶及蛋白酶合成复合酶（种类4），蛋白酶（种类5）]对茶多酚提取量的影响。
1.4.2 果胶酶与纤维素酶质量比对茶梗茶多酚提取量的影响
准确称取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），复合酶添加量 1.0%（以底物质量计），酶解温度50℃，反应时间50 min参数下，考察果胶酶与纤维素酶质量比为 2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5对茶多酚提取量的影响。
1.4.3 复合酶添加量对茶梗茶多酚提取量的影响
准确称取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），酶解温度50℃，反应时间50 min参数下，分别考察0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%复合酶（果胶酶∶纤维素酶=2∶3，质量比）添加量对茶多酚提取量的影响。
1.4.4 料液比对茶梗茶多酚提取量的影响
准确称取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，复合酶（果胶酶∶纤维素酶=2∶3，质量比）添加量1.0%，酶解温度50 ℃，反应时间 50 min 参数下，考察1∶10、1∶15、1∶20、1 ∶25、1∶30（g/mL）的料液比对茶多酚提取量的影响。
1.4.5 酶解温度对茶梗茶多酚提取量的影响
准确称取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），复合酶（果胶酶∶纤维素酶=2 ∶3，质量比）添加量1.0%，反应时间50 min参数下，考察酶解温度30、40、50、60、70 ℃对茶多酚提取量的影响。
1.4.6 酶解时间对茶梗茶多酚提取量的影响
准确称取1.0 g茶梗粉末，在pH 5.0，料液比1∶20（g/mL），复合酶（果胶酶∶纤维素酶=2∶3，质量比）添加量1.0%，酶解温度50℃参数下，考察反应时间30、40、50、60、70 min 对茶多酚提取量的影响。
1.5 响应面优化试验
依照Box-Behnken中心组合试验设计原理，基于单因素试验结果进行三因素三水平试验设计，选取复合酶添加量（A）、料液比（B）、酶解温度（C）为响应因子，使用Design-Expert 8.0软件进行数据拟合优化铁观音茶梗中茶多酚提取工艺。试验因素水平编码见表1。
表1 响应面设计试验因素与水平
Table 1 Variables and levels in response surface design
水平A复合酶添加量/%B料液比/（g/mL）C酶解温度/℃-1 0.5 1∶15 40 0 1.0 1∶20 50 1 1.5 1∶25 60
1.6 试验数据分析
通过Excel 2007软件处理相关试验数据，并用SPSS 21.0对数据进行单因素方差分析和显著性分析，利用Design-expert 8.0软件设计响应面试验和分析回归模型结果。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 酶种类的确定
不同酶种类对茶梗中茶多酚提取量的影响见图1。
由图1可知，5种酶体系获得茶梗中茶多酚提取量差异显著（P＜0.05），且复合酶的作用效果高于单一酶。提取量最低的是种类5（蛋白酶），仅有27.47 mg/g，种类3（果胶酶与纤维素酶）的茶多酚提取量最高，达到79.17 mg/g，其次是种类4（果胶酶、纤维素酶和蛋白酶），茶多酚提取量为67.76 mg/g，说明蛋白酶的存在会抑制果胶酶与纤维素酶的复合作用，种类1（果胶酶）和种类2（纤维素酶）的茶多酚提取量分别为35.62 mg/g和45.26 mg/g，因此，确定酶种类3（果胶酶与纤维素酶合成复合酶）作为提取铁观音茶梗中茶多酚的复合酶。
图1 不同酶种类对茶梗中茶多酚提取量的影响
Fig.1 Effect of enzyme types on extraction of tea polyphenol in tea stalks
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.1.2 果胶酶与纤维素酶质量比的确定
不同果胶酶与纤维素酶质量比对茶梗中茶多酚提取量的影响见图2。
图2 果胶酶与纤维素酶质量比对茶梗中茶多酚提取量的影响
Fig.2 Effect of pectinase-cellulose mass ratio on extraction of tea polyphenol in tea stalks
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，果胶酶与纤维素酶质量比在2∶1～2∶3范围内，随着复合酶中纤维素酶的用量增加，茶多酚提取量逐渐提高，由62.77 mg/g提高到80.02 mg/g（P＜0.05），原因是提高纤维素酶用量能够使细胞壁破裂更充分，促使茶多酚大量浸出。果胶酶与纤维素酶质量比为2∶3时，两种酶发挥最大活性，但随着纤维素用量的继续增加，茶多酚提取量呈下降趋势，质量比为2∶5时茶多酚提取量为70.56 mg/g，说明复合酶对底物浓度呈饱和状态[18]。因此，确定复合酶中果胶酶和纤维素酶质量比为2∶3适宜。
2.1.3 复合酶添加量的确定
不同复合酶添加量对茶梗中茶多酚提取量的影响见图3。
图3 复合酶添加量对茶梗中茶多酚提取量的影响
Fig.3 Effect of compound enzymatic addition on extraction of tea polyphenol in tea stalks
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图3可知，随着果胶酶与纤维素酶组成的复合酶添加量的升高，茶多酚提取量显著增加（P＜0.05），当复合酶添加量为1.0%时，提取量达到最大值75.31 mg/g，继续增加复合酶添加量，茶多酚提取量呈现下降趋势，其原因是复合酶添加量达到一定值时，与反应底物达到饱和状态，继续增加复合酶添加量会使酶解反应受到抑制[19]。因此，确定复合酶添加量为1.0%最佳。
2.1.4 料液比对茶梗茶多酚提取量的影响
不同料液比对茶梗中茶多酚提取量的影响见图4。
图4 料液比对茶梗中茶多酚提取量的影响
Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on extraction of tea polyphenol in tea stalks
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图4可知，茶梗中茶多酚的提取量随溶剂体积的增大而差异显著（P＜0.05），当料液比 1 ∶20（g/mL）时达到最大值，为70.90 mg/g，随着溶剂体积继续增大提取量迅速下降，在料液比1∶30（g/mL）时得到最小值44.53 mg/g。原因为溶剂较少时，受到传质阻力影响，茶多酚浸出量小；在一定的料液比范围内，传质阻力减弱，茶多酚溶出量会升高，但当溶剂过量时，不能再加速茶多酚的浸出率[20]。因此，确定料液比1∶20（g/mL）为最佳。
2.1.5 酶解温度的确定
不同酶解温度对茶梗中茶多酚提取量的影响见图5。
图5 酶解温度对茶梗中茶多酚提取量的影响
Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction of tea polyphenol in tea stalks
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图5可知，不同酶解温度对茶梗中茶多酚提取量影响显著（P＜0.05），在 30℃～50℃范围内，茶多酚提取量随着温度升高而增加，在50℃时达到80.76 mg/g的最大值，复合酶发挥最大活性与稳定性，达到了复合酶的最适反应温度，最大程度地使细胞壁破裂，使茶多酚充分溶出；随着温度逐渐升高，酶蛋白质变性失活，酶活性下降，提取量也显著降低，在70℃时仅有53.32 mg/g，为最大值的66.02%。因此，确定最适的酶解温度以50℃最佳。
2.1.6 酶解时间的确定
不同酶解时间对茶梗中茶多酚提取量的影响见图6。
图6 酶解时间对茶梗中茶多酚提取量的影响
Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction of tea polyphenol in tea stalks
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由图6可知，在30 min～50 min范围内，随着酶解时间的延长，茶梗中茶多酚提取量显著提高（P＜0.05），在50 min时，达到82.80 mg/g的最大提取量；超过50 min后，茶多酚提取量呈现平稳下降趋势。原因是提取时间过短，酶解作用不充分，延长酶解时间对提高茶多酚提取量无意义，且存在抑制酶活性的现象。因此，确定酶解时间以50 min适宜。
2.2 响应面模型建立与分析
响应面分析试验结果见表2。
表2 响应面分析试验及结果
Table 2 Response surface methodology and analysis results
序号 A复合酶添加量 B料液比 C酶解温度 Y茶多酚提取量/（mg/g）1 0 0 0 83.45 2 1 0 -1 72.11 3 0 0 0 83.27 4 -1 0 1 65.39 5 1 1 0 68.73 6 -1 0 -1 79.05 7 0 1 -1 75.91 8 1 -1 0 62.77 9 -1 1 0 68.63 10 0 -1 1 63.74 11 0 0 0 83.38 12 0 0 0 84.15 13 1 0 1 63.22 14 0 0 0 84.46 15 0 -1 -1 77.82 16 -1 -1 0 71.53 17 0 1 1 66.45
利用Design-Expert 8.0软件对表2试验数据进行二次多项式回归拟合，得到茶多酚提取量与复合酶添加量（A）、料液比（B）、酶解温度（C）的回归模型方程为：Y=83.74-2.22A+0.48B-5.76C+2.21AB+1.19AC+1.15BC-8.43A2-7.39B2-5.37C2。
方差分析见表3。
由Design-Expert 8.0软件分析结果，对试验方差及拟合程度进行综合分析。该试验模型的P<0.000 1，呈极显著；失拟项P=0.502 0，不显著，表明该模型真实可靠具有可信度[21]。3个因子对Y（茶多酚提取量）的影响大小为：C（酶解温度）>A（复合酶添加量）>B（料液比）。一次项中A、C呈极显著，B为显著；二次项 A2、B2、C2和交互项 AB、AC、BC 均为极显著。相关系数R2=0.998 2，校正相关系数R2adj=0.995 9，表明模型可解释99.59%的响应值变化；R2=0.998 2，表明响应值的变化有99.82%来源于所选变量，且信噪比为13.33，证明该模型拟合程度好，可用于分析和预测茶梗中茶多酚的提取工艺。
2.3 响应面图分析与优化
各响应因素交互作用对茶多酚提取量影响的响应面和等高线图见图7。
表3 茶多酚提取量的回归方程方差分析
Table 3 Analysis and statistical parameters of regression model of tea polyphenols content
注：*差异显著（P＜0.05）；**差异极显著（P＜0.01）。
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 显著性模型 1 061.58 9 117.95 432.89 <0.000 1 **A 39.47 1 39.47 144.86 <0.000 1 **B 1.86 1 1.86 6.84 0.034 7 *C 265.54 1 265.54 974.52 <0.000 1 **AB 19.62 1 19.62 72.02 <0.000 1 **AC 5.69 1 5.69 20.88 0.002 6 **BC 5.34 1 5.34 19.58 0.003 1 **A2 299.38 1 299.38 1 098.73<0.000 1 **B2 230.24 1 230.24 844.99 <0.000 1 **C2 121.29 1 121.29 445.15 <0.000 1 **残差 1.91 7 0.27失拟项 0.79 3 0.26 0.94 0.502 0纯误差 1.12 4 0.28总和 1 063.49 16
由图7（a）可知，复合酶添加量与料液比对茶多酚提取量影响的响应曲面坡度较为陡峭，其等高线均呈椭圆形且曲线较为密集，表明复合酶添加量和料液比的交互效应对茶多酚提取量的影响较为显著。同时，茶多酚提取量随溶剂体积的升高和复合酶添加量的增加呈现先高后低的变化趋势，并且复合酶添加量的变化曲面较料液比的变化曲面更陡峭，说明复合酶添加量对茶梗中茶多酚提取量的影响更明显。
由图7（b）可知，复合酶添加量与酶解温度对茶多酚提取量影响的响应曲面坡度均较陡峭，其等高线均呈椭圆形且曲线密集，表明复合酶添加量与酶解温度的交互效应对茶梗中茶多酚提取量的影响显著，与方差分析结果相符。同时，茶多酚提取量随复合酶添加量的增加和酶解温度的升高呈现先升高后缓慢降低的趋势，并且酶解温度的变化曲面较复合酶添加量的变化更陡峭，说明酶解温度对茶梗中茶多酚提取量的影响更明显。
由图7（c）可知，料液比与酶解温度对茶多酚提取量影响的响应曲面坡度较为陡峭，但其等高线均呈椭圆形且曲线较为密集，表明料液比与酶解温度的交互效应对茶梗中茶多酚提取量的影响显著，与方差分析结果相符。同时，茶多酚提取量随酶解温度的升高和溶剂体积的增大呈现先升高后降低的趋势，并且酶解温度的变化曲面较料液比的变化更为陡峭，说明酶解温度对茶梗中茶多酚含量的影响更明显。
图7 各响应因素交互作用对茶多酚提取量影响的响应面和等高线图
Fig.7 The response surface and contour plots of the interaction of each factor to the extraction amount of tea polyphenols
2.4 最佳条件确定与回归模型的验证
通过响应面优化试验得到酶法提取茶梗中茶多酚最佳工艺条件为：复合酶添加量1.18%，料液比1∶19.86（g/mL），酶解温度47.86℃，此条件下得到茶多酚提取量为82.79 mg/g。为便于实际操作，提取工艺条件调整为：复合酶添加量1.2%，料液比1∶20（g/mL），酶解温度48℃，在此参数下进行3次重复试验，茶多酚提取量平均值为82.26 mg/g，与理论值接近，表明响应面法优化复合酶提取茶梗中茶多酚的工艺结果可靠。
3 结论
本研究以乌龙茶类铁观音茶梗中的茶多酚提取量为考察目标，在单因素试验的基础上，利用响应面分析法优化茶梗中茶多酚的提取工艺，最终得到茶多酚提取最佳工艺参数为：复合酶添加量1.2%，料液比1∶20（g/mL），酶解温度48℃。在此参数下，铁观音茶梗中茶多酚提取量为82.26 mg/g，接近预测提取量82.79 mg/g，较其它提取方法结果更高，说明此试验模型结果可靠。同时，获得铁观音茶梗中茶多酚提取的因素影响大小为：酶解温度>复合酶添加量>料液比，研究结果将为乌龙茶类的茶梗附加值开发利用提供技术支撑。
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