硒（Se）是人和动物体内所必需的微量元素，具有清除自由基、抗癌、保护肝脏、防衰老、增强免疫等生物学功能[1-5]。缺硒会严重影响人类和动物的健康，导致克山病和大骨节病等多种疾病的发生，因此科学合理地补硒变得尤为重要[6]。人体硒的主要来源是食物，其中富硒农作物是人体获取硒元素的重要途径之一[7]。硒元素能够以硒酸盐或亚硒酸盐的形式被植物吸收，并在叶绿体中代谢转化为有机硒代氨基酸及其衍生物，以便被人体吸收[8]。
枣属隶属鼠李科，是本草上品和传统滋补佳品，素以营养丰富著称[9]。枣果中环核苷酸、维生素C、功能性糖、铁、钾、钙、锌等重要营养成分含量均居百果前茅，开发高营养健康食品前景广阔[10]。植物化学研究表明，枣具有抗氧化作用，主要归因于天然抗氧化剂——酚酸、类黄酮、花青素、维生素和环核苷的活性[11-12]。富硒枣的研究多限于生产富硒枣适宜的处理量及抗氧化性的探讨，对于硒对富硒大枣中多种微量元素的生物胁迫作用研究较少。
目前，硒的测定有原子荧光光谱法、紫外-可见分光光度法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法等多种方法[13-15]。电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）以等离子体作为离子源，通过质谱进行分析的方法，该技术的优点是操作较为简单、灵敏度更高、选择性更好并且可以多元素同时测定[16-17]。微波消解具有所用试剂少，样品分解得更快更彻底，同时密闭消解能避免元素的损失使测定更加准确的优点[18-19]。因此，本文采用微波消解-电感耦合等离子体质谱联用技术探究硒对富硒大枣中多种微量元素的生物胁迫作用，为富硒枣的生产及开发利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
硝酸（优级纯）、盐酸（优级纯）：科瑞峰公司；环境混合元素标准储存溶液为1 000 mg/L Fe、Ca和10 mg/L Zn、Mn、Cu、V、Mo、Co、Pb、As、Cd、Hg、Se 的混合标准溶液、1 μg/L 内标液由 10 μg/L 的 Rh、Sc、Lu、In：Agilent公司。
1.2 主要仪器与设备
电感耦合等离子体质谱仪（7900型ICP-MS）：美国安捷伦公司；微波消解仪（MD8H）：奥普乐仪器有限公司；分析天平（FA2204B）：上海仪田精密科学仪器有限公司；超低温冰箱（MDF-U4086S）：日本三洋公司；冷冻干燥机（SCIENTZ-30F）：宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 富硒大枣的培养
将种植的大枣分别在坐果期和果实着色期对其注射外源硒（亚硒酸钠），施硒量分别为0、50、100、150、200、250、300 mg/kg。每个施硒量枣树为 10 棵，行距 8 m～12 m，株距 4 m～6 m，5 224 棵/hm2～5 970 棵/hm2。通过植物吸收转化到大枣中来达到富集硒的目的，其中施硒量为0 mg/kg的作为空白组。待果实成熟后，采摘大枣并用大量清水冲洗干净，再用去离子水冲洗多次。将洗净后的相同量梯度的大枣混匀，置于-84℃的超低温冰箱中冰冻，再经过冷冻干燥处理，使其去除水分。最后将干燥后的大枣打磨成粉末，放置于干燥器中待用。
1.4 富硒大枣的处理
准确称取0.1 g富硒大枣粉于聚四氟乙烯消解罐中并加入5 mL优级纯HNO3，拧紧消解罐盖并将其放入微波消解仪中进行消解，按表1中的方法消解，结束后赶酸，当赶酸至溶液体积在1 mL～2 mL且澄清透明时静置，待溶液冷却后定容至25 mL，4℃保存待上机检测。每份富硒大枣样品做两份平行样。样品微波消解程序见表1。
表1 样品微波消解程序
Table 1 Sample microwave digestion procedure
方法 工步 温度/℃ 升温时间/min恒温时间/min 功率/W大枣（HNO3）1 120 5 5 6 2 150 5 10 6
1.5 ICP-MS工作条件
ICP-MS工作条件见表2。
表2 ICP-MS工作条件
Table 2 ICP-MS working conditions
参数 值 参数 值氩气纯度辅助气流量泵速采样深度RF功率等离子体气体雾化气流量99.999%1.0 L/min 1.5 mL/min 8 mm 1 355 W 15 L/min 344.75 kPa氩气压力冷却气流量循环水流量载气补偿/稀释气体雾化室温度蠕动泵700 MPa 15 L/min 2.0 L/min 1.0 L/min 1.0 L/min 2℃0.3 r/s
2 结果与讨论
2.1 标准曲线与方法的检出限
试验方法的标准曲线与方法的检出限（detection limit，DL）与相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）如表3所示。
表3 线性范围、相关系数及检出限
Table 3 Correlation coefficient of linear range and detection limit
元素 线性范围/(μg/L) 相关系数 检出限/(μg/L) RSD/%Se Zn Mn Cu Ca Fe V Mo Co Cd As Hg Pb 0～100 0～400 0～100 0～100 0～400 0～100 0～200 0～200 0～200 0～100 0～100 0～10 0～100 0.999 7 0.999 1 0.999 9 0.999 9 0.998 3 0.999 7 0.999 3 0.999 9 0.998 6 0.999 8 0.999 9 0.999 8 0.999 6 0.032 0.054 0.027 0.003 0.061 0.012 0.006 0.022 0.024 0.024 0.035 0.012 0.020 1.7 2.3 2.1 1.9 2.0 2.3 2.4 1.1 1.5 1.9 1.8 1.0 1.5
2.2 施硒量对大枣中硒含量的影响
施硒量对大枣中硒含量的影响见图1。
图1 施硒量对大枣中硒含量的影响
Fig.1 Effect of selenium application on selenium content in jujube
由图1可知，施硒量为0 mg/kg时，硒含量为0.113 4 mg/kg。随着施硒量的增加，富硒大枣中的硒含量也逐渐升高，并在施硒量处于250 mg/kg时达到最大值0.557 7 mg/kg，较空白组提高了3.92倍。但当施硒量达到250 mg/kg以上，随着施硒量的增加，大枣中的硒含量反而下降。说明施硒量过高会抑制大枣对硒元素的吸收。因此，在大枣富硒时，要选择合适的施硒量。施硒量过低达不到良好的效果，施硒量过高会抑制富硒效果。
2.3 施硒量对大枣中营养元素锰、锌、铜含量的影响
施硒量对大枣中锰、锌、铜含量的影响见图2。
图2 施硒量对大枣中锰、锌、铜含量的影响
Fig.2 Effect of selenium application on manganese，zinc and copper content in jujube
锰、锌和铜元素都是人体所必需的微量元素。锰是人体内多种酶的成分，在细胞代谢中起重要作用，与人体健康关系十分密切，缺锰会导致婴儿骨骼畸形；锌对促进机体生长发育、维持人体正常食欲、调节机体免疫具有重要作用，摄入不足会导致发育迟缓甚至影响智力发育；铜是人体内含量位居第二的必需微量元素，缺铜会引起贫血、毛发异常、骨和动脉异常以至脑障碍。从图2可以看出，施硒量为0 mg/kg时，富硒大枣中锰、锌和铜元素的含量分别为0.045 2、0.058 3、0.062 4 mg/kg，随着施硒量的增加3种元素的含量整体呈现先上升后下降的趋势。当施硒量处于200 mg/kg时，锰和锌的含量达到最大，分别为0.184 5 mg/kg和0.145 9 mg/kg，较空白组增加了3.08、1.50倍；而铜含量在施硒量为50 mg/kg时达到最大为0.084 6 mg/kg，较空白组增加了36%。当施硒量继续增加，二者的含量反而降低。说明施硒量过高会对大枣产生毒害作用，并通过拮抗作用抑制大枣对锰、锌和铜3种元素的吸收，从而造成这些元素的流失。所以，低含量硒对锰、锌和铜3种元素均具有协同作用，而高含量硒对它们有拮抗作用。
2.4 施硒量对大枣中营养元素钙、铁含量的影响
施硒量对大枣中钙、铁含量的影响见图3。
图3 施硒量对大枣中钙、铁含量的影响
Fig.3 Effect of selenium application on the content of calcium and iron in jujube
钙对人体神经系统和细胞膜结构完整及多种酶的结合有十分重要的作用，缺钙会患软骨病[20]。从图3可以看出，富硒大枣中钙含量随着施硒量的增加呈现先增加后减少的趋势。当施硒量为0 mg/kg时，钙的含量达到1.352 mg/kg，而当施硒量处于250 mg/kg时，钙的含量达到峰值3.092mg/kg，较空白组增加了1.29倍。说明此含量硒对钙的促进作用最大，而当施硒量继续增加，钙含量反而降低。因为在植物体内，钙能维持植物细胞膜的完整性，而高含量硒会降低植物细胞膜的选择透过性，损伤植物质膜的完整性。所以低含量硒对钙元素有协同作用，而高含量硒对钙元素有拮抗作用。
铁是人体不可缺少的微量元素，参与体内氧的运转、交换和组织呼吸过程，维持机体正常造血功能，缺铁会贫血[21]。由图3可知，当施硒量处于0 mg/kg时，铁的含量为1.231 mg/kg，随着施硒量的增加，硒对大枣中铁元素的整体增长幅度虽没有钙元素明显，但在施硒量为100mg/kg时铁含量出现峰值，达到1.833 mg/kg，较空白组增加了49%。铁元素是辅酶的组成部分，可通过电子传递，催化植物体一系列的氧化还原反应，而硒是这些酶的活性中心。所以，低含量硒对铁元素的吸收具有协同作用。
2.5 施硒量对大枣中营养元素钼、钒、钴含量的影响
施硒量对大枣中钼、钒、钴含量的影响见图4。
图4 施硒量对大枣中钼、钒、钴含量的影响
Fig.4 Effect of selenium application on vanadium，molybdenum and cobalt content in jujube
钼是多种酶的重要构成要素，参与人体内铁的利用，可以预防贫血，促进发育，维持心肌能量代谢和人体免疫功能，防止龋齿、肾结石和癌症等，钼不足可表现为生长发育迟缓甚至死亡。由图4可知，随着施硒量的增加，富硒大枣中钼急剧增加。当施硒量为0 mg/kg时，钼的含量为0.287 4 μg/kg，而当施硒量增加到50 mg/kg时，硒对钼元素的协同作用最大，达到0.623 7 μg/kg，较空白组增加了1.17倍，之后随着施硒量的增加，钼的含量变化不明显。因为钼与植物体内的氧化酶活性有关，而硒是这些酶的活性位点，所以钼和硒两种微量元素具有一定的协同关系。
钒是人体的重要微量元素，对机体的生长发育、心血管、肾脏、代谢均具有重要的影响。由图4可知，当施硒量处于0 mg/kg时，钒的含量达到0.133 2 μg/kg，随着施硒量的增加，富硒大枣中的钒元素呈现先增大后减少的趋势，当施硒量达到200 mg/kg时达到峰值0.264 4 μg/kg，较空白组提高了约98%。因为钒能促进植物细胞中葡萄糖的转运、氧化及糖原的合成，低量硒对糖的抗氧化作用没有高量硒明显，所以低量硒对钒具有明显的协同作用。
钴是维生素B12的重要组成部分，对蛋白质的新陈代谢、部分酶的合成、铁在人体内的储存以及肠道对铁和锌的吸收均具有促进作用。钴的缺乏会直接影响到维生素B12生理功能的发挥，易导致人体出现贫血症、老年痴呆症、性功能障碍以及心血管等疾病。由图4可知，当施硒量处于0mg/kg时，钴的含量为0.0423μg/kg，随着施硒量的增加，富硒大枣中的钴元素呈现先增大后减少的趋势，当施硒量达到150 mg/kg时达到峰值0.074 3 μg/kg，较对照组增加了0.43倍。由于钴能影响植物的光合作用，而适量硒能增加叶绿体的数量，所以施加一定含量的硒能增加富硒大枣中钴的含量，具有明显的协同作用。
2.6 施硒量对大枣中重金属元素砷、镉含量的影响
施硒量对大枣中砷、镉含量的影响见图5。
图5 施硒量对大枣中砷、镉含量的影响
Fig.5 Effect of selenium application on arsenic and cadmium content in jujube
镉不是人体的必需元素，长期吸入镉可产生慢性中毒，引起肾脏损害；砷为原生质毒，过量能使人体细胞坏死，甚至引起死亡。从图5可得，富硒大枣中镉和砷的含量随着施硒量的增加而显著变化。当施硒量处于0 mg/kg时，砷和镉的含量分别为1.675 μg/kg和0.891 5 μg/kg，随着施硒量的增加，富硒大枣中镉和砷的含量，呈先下降后增加的趋势。当施硒量处于150 mg/kg时，砷的含量为 0.494 0 μg/kg，较空白组降低了70.51%。硒对镉的拮抗峰值发生在100 mg/kg，镉的含量为0.374 2 μg/kg，较空白组降低了58.02%。因为硒能清除由于重金属（砷和镉）产生的过多自由基，降低其对细胞膜系统造成的细胞膜脂过氧化现象，从而减少对重金属离子的吸收和积累，所以硒对砷和镉两种元素均有拮抗作用，其中硒对砷的拮抗作用更加明显。
2.7 施硒量对大枣中重金属元素汞、铅含量的影响
施硒量对大枣中汞、铅含量的影响见图6。
汞是一种有毒元素，会使人体神经系统失调、对肾脏、造血系统、肝脏构成威胁，甚至造成不孕不育。由图6可知，当施硒量处于0 mg/kg时，汞的含量为11.45 μg/kg，随着施硒量的增加，富硒大枣中汞元素含量急剧下降直至趋于平缓，汞含量降至0.15 μg/kg，较空白组降低了98.69%。
图6 施硒量对大枣中汞、铅含量的影响
Fig.6 Effect of selenium application on mercury and lead content in jujube
铅是对人体危害极大的一种重金属元素，它对神经系统、骨骼造血功能、消化系统、男性生殖系统等均有危害。从图6可以看出，当施硒量处于0 mg/kg时，铅的含量为 10.97 μg/kg，随着施硒量的增加，富硒大枣中铅的分布趋势先降低后升高。当施硒量处于150 mg/kg时出现最低值为4.529 μg/kg，较空白组降低了58.71%。而后随着施硒量继续增加，铅元素的含量也相应增加，但其含量一直在10 μg/kg以内，符合食品安全规定。一方面外源硒可以调节植物细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶，促进植物对重金属元素的螯合作用，从而减少植物对重金属离子的吸收与积累；另一方面，适量硒能增加叶绿素的含量，促进光合作用，减少重金属诱导产生的生长抑制因子，提高植物抵抗重金属元素的能力，所以硒的存在可以预防重金属元素（如汞，铅等）引起的毒害，对其产生拮抗作用。
3 结论
通过ICP-MS对富硒大枣中的微量元素进行定量分析。结果表明，不同元素在外源硒的作用下表现出不同的趋势：随着施硒量的逐渐增加，硒对锌、锰、铜、钙、铁、钒、钼、钴元素具有明显协同作用，其中铜元素于施硒量为50 mg/kg时达到峰值0.084 6 mg/kg，较空白组增加了36%；铁元素于施硒量为100 mg/kg时达到峰值1.833 mg/kg，较空白组增加了49%；钴元素于施硒量为150 mg/kg时达到峰值0.074 3 μg/kg，较空白组增加了43%；锰、锌、钒元素于施硒量为200 mg/kg时达到峰值分别为 0.1845、0.1459mg/kg和 0.264 4 μg/kg，较空白组分别提高了3.08、1.50、0.98倍；钙和钼于施硒量为250 mg/kg时达到峰值分别为3.092 mg/kg和0.706 5 μg/kg。硒对重金属元素砷、镉、汞、铅具有显著的拮抗作用，其中砷和铅于施硒量为150 mg/kg时拮抗作用最好，较空白组分别降低了70.51%和58.71%。当施硒量为50 mg/kg时，硒对汞的拮抗作用达到最大，达到98.69%。因此，外源硒除能有效补充硒元素外，还能协同植物体对各种营养元素的吸收，并且能够拮抗通过食物链积累对人体有害的重金属元素。试验结果表明，富硒农作物的种植对食品的安全性和人体的硒补充具有重要指导意义。
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